阅读说明：本技术 两性离子多肽及其衍生物以及以其为基础的纳米药物 (Zwitterionic polypeptide and derivative thereof and nano-drug based on zwitterionic polypeptide and derivative ) 是由 陈圣福 薛伟利 阿斯·屈塔 于 2020-05-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种两性离子多肽及其衍生物以及以其为基础的纳米药物。以本发明的两性离子多肽或其衍生物为基础可以制得纳米药物,两性离子多肽的二级结构在药物释放前后具有优良的转换能力,可加速药物在细胞内的释放。所得到的纳米药物可用于肿瘤靶向治疗,获得预想不到的肿瘤靶向性,并具备优异的血液相容性、躲避免疫识别、肿瘤靶向、细胞内化和进入细胞核的能力,降低在网状内皮组织丰富的肝、肾、脾、肺、心等脏器中的分布,最终实现高效抑制肿瘤生长的能力和体内低毒性的靶向肿瘤治疗效果。(The invention discloses a zwitterionic polypeptide, a derivative thereof and a nano-drug based on the zwitterionic polypeptide and the derivative. The zwitterionic polypeptide or the derivative thereof can be used for preparing nano-drugs, and the secondary structure of the zwitterionic polypeptide has excellent conversion capability before and after drug release, so that the release of the drugs in cells can be accelerated. The obtained nano-drug can be used for tumor targeted therapy, obtains unexpected tumor targeting, has excellent blood compatibility, immune recognition avoidance, tumor targeting, cell internalization and cell nucleus entering capability, reduces the distribution in liver, kidney, spleen, lung, heart and other organs rich in reticuloendothelial tissues, and finally realizes the capability of efficiently inhibiting the growth of tumors and the targeted tumor therapeutic effect with low toxicity in vivo.)

两性离子多肽及其衍生物以及以其为基础的纳米药物

技术领域

本发明涉及一种两性离子多肽及其衍生物和纳米药物，属功能多肽与纳米药物制造领域。

背景技术

恶性肿瘤，在世界范围内作为一种慢性健康疾病，其主要特征在于细胞的非正常增值。人类经过半个世纪的巨大投入之后，尽管在医疗领域对癌症的治疗取得了一定的进展，癌症仍是人类的巨大威胁。根据国际癌症研究机构评估，到仍是人类的巨大威胁。根据国际癌症研究机构评估，到2030年，将会有2220万新发癌症病例，并且死亡病例将会达到1320万。化疗是现有肿瘤治疗的主要方法之一，但具有三大缺陷，包括：对健康器官和组织中正常细胞具有毒副作用，长期治疗后会引起多药耐药性，以及化疗药物本身的物理和化学性质所引起的低生物利用度。特别是毒副作用进一步导致了对肿瘤化疗药物计量的限制，使之更易产生多药耐药性，最终导致肿瘤治疗失败。因此，亟需发展一种高效药物传递到肿瘤内，避开健康器官和组织的靶向方法，将会对肿瘤治疗产生革命性的进步。

虽然纳米药物一直被认为是这种靶向治疗的一种可行的手段，但是由于体内错综复杂的体内多重生物屏障，使得至今未能实现有效的靶向传递。这些多重生物屏障包括了：1)避开为实现靶向争取必要时间的清除行为，其中包括了血液的相容性、巨噬细胞细胞及网状内皮组织的吞噬和肾过滤，2)穿越血管屏障，3)提高靶向识别能力，4)提高肿瘤组织内的渗透能力，5)穿越细胞膜屏障，6)逃避细胞内的消化和反吐机制，7)进入起药物抑制作用的细胞核或其他细胞器的能力。而且，一个纳米药物需要同时具备克服这些屏障能力，才能实现高效的治疗目的。因此，纳米药物的靶向传递非常困难。然而，蛋白质分子(例如抗体)可视为一种最为有效的纳米药物，它具备了天然的克服上述前4个生物屏障能力。借鉴和模拟蛋白质分子的纳米靶向药物，再结合有效的穿越细胞膜屏障、逃避细胞内的消化和反吐和进入起药物抑制作用的细胞器的能力，将能够实现有效的靶向治疗。事实上，为了克服上述7 个屏障，在纳米药物领域侧重突破各个屏障的研究不胜枚举。但是能够综合所有能力，克服上述7个屏障的至今仍然是一个难题。因此，至今仍然缺乏性能优良的靶向纳米药物。

为了达到上述靶向目的，载体材料首先需要具有良好抗非特异性蛋白质吸附能力，这些材料主要分为两类：一类为以氢键为基础的亲水性材料，另一类是两性离子材料。亲水性聚乙二醇(PEG)保护纳米药物在克服上述前3个屏障中显示了明显的优势，但是对在穿越细胞膜屏障方面成为其严重的短板。PEG保护纳米药物往往以此为基础，设计成具有各种响应能力的高度复杂的纳米药物。然而，协调这些额外的功能，在有限的纳米水平的控制能力和空间分布，使这些方法成为难以逾越的瓶颈。

因此，借鉴蛋白质分子和细胞膜的两性离子特性，两性离子材料具备了比PEG更优秀的抗非特异性蛋白质吸附能力，由此获得更好的血液相容性和生物相容性。然而，对两性离子的研究往往停留在人工合成聚合物，如聚甲基丙烯酸酯内两性离子聚合物，存在不可生物降解和代谢的问题。另一方面，对两性离子的研究也大都局限在正负电荷相等的状态，对于如有负电荷偏置的蛋白质分子，仍然有认识局限，特别是仍然缺乏对如白蛋白在肿瘤中的滞留现象缺乏合理的解释。因此，模拟蛋白质分子负电荷偏置的两性离子多肽构成的纳米药物在肿瘤治疗中存在巨大潜力。

但是在肿瘤中滞留的白蛋白，由于分子量较小，仍然能够在肝肾等脏器有较高分布，而且白蛋白分子类疏水内核的生物功能不明，且会干扰小分子药物的包载能力。适当提高纳米药物粒径、剔除冗余结构，有可能超过白蛋白包载紫杉醇药物的功效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的两性离子多肽及其衍生物以及以其为基础的纳米药物。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明两性离子多肽具有如式(Ⅰ)所示的结构：

其中，x、y、z、u均为整数，x≥2，y+z+u大于0；R₁为-CH₂SH和/或其衍生物；R₂为 -CH₂COO^-和/或-CH₂SH的阴离子衍生物；R₃为用于促进多肽被酶降解的基团。

进一步地，本发明所述两性离子多肽具有如以下式(II)至式(VI)中的任一种所示的结构：

其中，x、y、z、u均为正整数，x≥2。

本发明两性离子多肽的衍生物的结构如下：

所述如式(II)所示的两性离子多肽的衍生物具有如以下式(VII)或式(VIII)所示的结构；

如式(III)所示的两性离子多肽的衍生物具有如以下式(IX)或式(X)所示的结构；

如式(IV)所示的两性离子多肽的衍生物具有如以下式(XI)或式(XII)所示的结构；

如式(VI)所示的两性离子多肽的衍生物具有如以下式(XIII)或式(XIV)所示的结构；

其中，x、y、z、u、v、w均为正整数，x≥2，w大于6。

进一步地，本发明所述的如式(VII)、式(VIII)、式(XIII)或式(XIV)所示的两性离子多肽的衍生物中的酰肼与阿霉素反应后含有如下式(XV)所示的特征结构：

本发明两性离子多肽的制备方法为：将含侧链保护基的谷氨酰基赖氨酸二肽单体与侧链保护的半胱氨酸、侧链保护的天冬氨酸、苯丙氨酸中的任一种或任几种进行混合缩聚反应，然后再对混合缩聚产物进行脱保护。

本发明的纳米药物由如式(Ⅰ)、式(IV)或式(V)所示的两性离子多肽中的含憎水性侧链包载憎水性药物得到，或者，由如式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的两性离子多肽的衍生物中的含憎水性侧链包载憎水性药物得到；

式(Ⅰ)中，x、y、z、u均为整数，x≥2，y+z+u大于0；R₁为-CH₂SH和/或其衍生物；R₂为-CH₂COO^-和/或-CH₂SH的阴离子衍生物；R₃为用于促进多肽被酶降解的基团；

式(IV)中，x、y、z、u均为正整数，x≥2；

式(V)中，x、z、u均为正整数，x≥2；

式(IX)中，x、y、z、w均为正整数，x≥2，w大于6；

式(X)中，x、y、z、w均为正整数，x≥2，w大于6；

式(XI)中，x、y、z、u、w均为正整数，x≥2，w大于6；

式(XII)中，x、y、z、u、w均为正整数，x≥2，w大于6。

进一步地，本发明由如式(Ⅰ)、式(IV)或式(IX)所示的两性离子多肽中的含憎水性侧链包载憎水性药物得到的纳米药物，或由如式(X)、式(XI)或式(XII)所述的两性离子多肽的衍生物中的含憎水性侧链包载憎水性药物得到的纳米药物，含有两性离子多肽保护层，该保护层由相应的两性离子多肽或两性离子多肽的衍生物中的半胱氨酸交联形成。

以本发明的一种两性离子多肽的衍生物为基础的纳米药物由含如式(XV)所示特征结构的两性离子多肽的衍生物中的含憎水性侧链包载憎水性药物得到，或者，由含如式(XV)所示的特征结构的两性离子多肽的衍生物直接在水溶液中形成。

进一步地，本发明所述纳米药物在pH7.4的生理溶液中纳米药物的zeta电位为负值，在pH 6.7时的zeta电位在0.02mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中小于8mV。

进一步地，本发明所述纳米药物中至少有一种带负电荷酸根的酸性强于谷氨酸侧链羧酸的酸性，和/或所述纳米药物中的带负电荷酸根的总量大于带正电荷基团的总量。

本发明的两性离子多肽的应用为：所述两性离子多肽能够用于制备抑制肿瘤生长的纳米药物。

本发明的两性离子多肽的衍生物的应用为：所述两性离子多肽的衍生物能够用于制备抑制肿瘤生长的纳米药物。

以本发明的两性离子多肽或其衍生物为基础的纳米药物作为肿瘤生长抑制的治疗药物，可以经静脉注射方法使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明两性离子多肽具有优良而稳定的包载憎水性药物能力，以该两性离子多肽为基础的纳米药物在正常生理pH7.4条件下24小时内药物释放量小于7-20％。

(2)本发明两性离子多肽在药物包载时的beta转折向药物释放后的alpha螺旋结构的变化使之进入肿瘤组织和肿瘤细胞后具有加速药物释放的能力，使之能够实现对肿瘤细胞生长的更佳的抑制能力。可见，本发明两性离子多肽的二级结构在药物释放前后具有优良转换能力，可加速药物在细胞内的释放。

(3)本发明以两性离子多肽为基础的纳米药物的两性离子特殊谷氨酸赖氨酸残基对等结构使之具有优秀的细胞内化和进入细胞核的能力，该能力使药物更易进入细胞内部。

(4)以本发明两性离子多肽为基础的纳米药物，模拟了血液中蛋白质分子表面，剔除蛋白质分子中的冗余结构，添加载药所必须的化学结构，并附加负电荷偏置，最终和小分子抗肿瘤药物构建为粒径大于肾过滤的纳米药物，使得该纳米药物具备优异的血液相容性、躲避免疫识别、降低在网状内皮组织丰富的肝、肾、脾、肺、心等脏器中的分布；具有对微小pH 变化(从pH7.4到pH6.7)对肿瘤组织的瞬间亲和力响应的能力，产生对肿瘤组织的识别；并在肿瘤组织集中，获得预想不到的肿瘤靶向性；且载药量更大，载体更稳定，达到肿瘤组织前不易出现提前释放。

(5)本发明的两性离子多肽为基础的纳米靶向药物通过加入酶可降解氨基酸残基或序列提高了纳米载体材料的在肿瘤部位的选择性酶降解提高对肿瘤细胞的药物传递；并赋予了载体材料的代谢能力，降低了对正常组织的生长影响。且由于该多肽为全合成材料，能够避免生物源，特别是动物源材料的应用，降低其他病原体等污染的可能，使该纳米药物更加安全。

附图说明

图1 Z基团保护的EK-C多肽特征核磁共振图；

图2 EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽特征核磁共振图；

图3 EK-C多肽骨架以硫醚键连接的含酰肼负电荷偏置多肽特征核磁共振图；

图4基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的CMC典型结果图；

图5基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的Zeta电位典型结果图；

图6基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的TEM典型结果图；

图7基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的与血清和纤维蛋白原相互作用典型结果图；

图8基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的酸敏感性典型结果图；

图9基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的pH响应、还原响应药物释放行为典型结果图；

图10基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的圆二色谱典型结果图；

图11基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的细胞毒性典型结果图；

图12基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的细胞毒性典型结果图；

图13基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞摄取典型结果图；

图14基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的抗巨噬细胞(RAW-264.7)免疫吞噬典型结果图；

图15基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内清除典型结果图；

图16基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内分布典型结果图；

图17基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内抑瘤效果图b和给药后裸鼠体重典型结果图a。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作出详细的说明。

本发明两性离子多肽的主要合成方法为：含侧链保护基的谷氨酰基赖氨酸二肽单体与侧链保护的半胱氨酸、侧链保护的天冬氨酸、苯丙氨酸中的任一种或任几种进行混合缩聚反应，然后再对混合缩聚产物进行脱保护。小分子量多肽可以直接用商业化固相合成方法。典型的

(1)巯基活化EK-C多肽骨架的合成路线

(2)EK-C多肽通过二硫键连接载药基团的功能化修饰的合成路线

(3)EK-C多肽通过二硫键连接载抗癌药物Dox的合成路线

(4)基于EK-C-D多肽骨架以二硫键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-T)的合成路线

(5)基于EK-C-D多肽骨架以硫醚键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-M)的合成路线

(6)EK-C-D-F多肽骨架的合成路线

本发明两性离子多肽的药物负载方法主要通过二个途径：一是通过化学接枝反应形成能够实现细胞内断裂和化学键，如酰肼与阿霉素的酮基反应形成酸敏感腙键或还原敏感的二硫键；二是利用药物的憎水性，与两性离子多肽中的憎水性侧链相互作用，最终包载药物。

其中，化学接枝路线如下所示：

(7)腙键连接阿霉素(DOX)反应的合成路线

实施例1：以谷氨酸酰基赖氨酸二聚体(EK)与半胱氨酸(C)为基础多肽(EK-C)的载阿霉素纳米药物制备

(一)巯基活化EK-C多肽骨架的合成

参见合成路线(1)，分别称取1g侧链苄氧基羰基(Z)保护的EK二聚体(2mmol)和0.2422g巯基三苯甲基保护的半胱氨酸(H-Cys(Trt)-OH)(0.667mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中，然后加入4mL的无水DMF溶液。再分别称取0.69g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(3.6mmol)、0.4865g无水N-羟基苯并三唑(HOBt)(3.6mmol)以及0.9306gN,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶液(7.2mmol)加入到上述圆底烧瓶中，超声至全部溶解，然后用封口膜密封搅拌反应48h。通过改变H-Cys(Trt)-OH的加入量合成EK跟C 摩尔比分别为2:1、3:1和4:1的混聚多肽产物。

反应结束后，向烧瓶中加入10倍N,N-二甲基甲酰胺(DMF)量的无水乙醚将反应产物沉出，并搅拌适当时间以除去反应中过量的DIEA，静置一段时间后除去上清液。再向烧瓶中加入10 倍DMF量的甲醇溶液并超声5min，重复加入甲醇洗涤两次以除去反应中残留的HOBt和DIEA 形成的盐。最后离心除去上清液，将沉淀放入真空干燥箱干燥得到化合物2，其特征核磁共振谱见图1。

称取0.2g上述化合物2加入到100mL的圆底烧瓶中，再加入与多肽聚合物中侧链巯基摩尔比为3:1的2,2’-二硫二吡啶(PySSPy)。然后向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h,反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。然后用截止分子量为3000的超滤离心管对干燥后的样品进行超滤离心，以除去过量的PySSPy及其他杂质，最后冷冻干燥得纯净化合物3。化合物3经三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原后为如式(II)所示的两性离子多肽，其中，x＝32,y＝11。

(二)基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置的两性离子多肽合成

参考合成路线(2)，称取20mg上述化合物3并溶于4mL去离子水，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为1:2的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，再加入与TCEP摩尔比为5:1的3-丙-2-烯酰氧基丙烷-1-磺酸钾(SPP)，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤离心除去过量的SPP反应物。

称取5mg 3,3’-二硫代二(丙酰肼)(DTP)溶于2mL去离子水，然后加入3mg还原剂TECP，用来部分打开DTP中的二硫键，与上述溶液混合后继续搅拌反应2h。反应结束后，超滤离心除去过量的DTP、3-巯基丙酰肼(TP)、TCEP或PySH等小分子。最后将反应产物放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到侧链巯基被功能化修饰后的混聚多肽产物化合物5，即具有式(VII)所示的两性离子多肽衍生物，其中，对于x＝32,v＝5,y-v＝6，其特征核磁共振图见图2。通过调整DTP、SPP的加入量从而可以改变巯基侧链两种小分子的接枝比例，可以得到SPP:TP分别为2:3、1:1和3:2的不同混聚多肽产物Poly(EK-C-SS)，即具有式(VII)所示的两性离子多肽衍生物，其中，x,v,y-v分别为；x＝32,v＝7,y-v＝4；x＝32,v＝5,y-v＝6； x＝32,v＝4,y-v＝7。

(三)基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼的两性离子负电荷偏置多肽的阿霉素接枝及其纳米药物制备

参见合成路线(7)，称取20mg侧链巯基被功能化修饰后的混聚多肽产物(化合物5)冻干粉，溶于4mL无水甲醇，然后加入6mg阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)，再加入4μL无水醋酸和适量的无水硫酸钠，将反应液密封避光搅拌反应48h。反应结束后，离心除去无水硫酸钠固体，取上清液用截止分子量为3000的超滤管进行超滤浓缩，以除去游离的DOX·HCl，并将DOX跟多肽混聚物耦合的甲醇溶液浓缩至0.5mL。向浓缩后的甲醇溶液中加入少量TEA溶液，用来除去DOX·HCl上的HCl，得到含如式(XV)所示的特征结构的化合物6。将含化合物(6)的甲醇浓缩液逐滴滴加到5mL去离子水中，边搅拌边滴加，滴加结束后，避光继续搅拌4h。最后将反应后的溶液进行冷冻干燥，得到纳米药物冻干粉。

化合物6中含有的阿霉素可作为憎水性基团，通过于其他憎水性药物的共混液，缓慢滴加到搅拌中的0.1N NaOH调节pH为8的超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH9.0 的硼酸盐缓冲溶液透析3小时，再对超纯水透析21小时，经冷冻干燥获得以阿霉素为憎水链包载其他憎水性药物的纳米药物。

(四)基于EK-C多肽骨架以硫醚键连接的含酰肼的负电荷偏置多肽合成

称取20mg上述化合物3并溶于4mL去离子水，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为 1:2的TCEP，再加入与TCEP摩尔比为5:1的SPP，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤离心除去过量的SPP反应物。

超滤除去未反应的SPP小分子后，再加入同样相同物质量的TCEP，用来断开剩余的一半二硫键，使剩余的侧链巯基裸露出来。加入还原剂TCEP的同时，同样加入甲基丙烯酰肼(MAH)，加入MAH的物质的量为裸露自由巯基物质量的5倍。在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤离心除去过量的MAH反应物。最后将反应产物放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到侧链巯基被功能化修饰后的基于EK-C多肽骨架以硫醚键连接的含酰肼负电荷偏置多肽产物，其特征核磁共振谱见图3。通过调整SPP、MAH的加入量从而可以改变巯基侧链两种小分子的接枝比例，可以得到SPP:MAH分别为2:3、1:1和3:2的不同混聚多肽产物Poly(EK-C-E)，即具有式(VIII)所示的两性离子多肽衍生物，其中，x,v,y-v分别为；x＝32,v＝7,y-v＝4； x＝32,v＝5,y-v＝6；x＝32,v＝4,y-v＝7。

(五)基于EK-C多肽骨架以硫醚键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝及其纳米药物制备

参见合成路线(7)，称取20mg基于EK-C多肽骨架以硫醚键连接的含酰肼负电荷偏置多肽产物冻干粉(即具有结构式(VIII)所示的两性离子多肽衍生物)，溶于4mL无水甲醇，然后加入6mg阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)，再加入4μL无水醋酸和适量的无水硫酸钠，将反应液密封避光搅拌反应48h。反应结束后，离心除去无水硫酸钠固体，取上清液用截止分子量为3000的超滤管进行超滤浓缩，以除去游离的DOX·HCl，并将DOX跟多肽混聚物耦合的甲醇溶液浓缩至0.5mL。向浓缩后的甲醇溶液中加入少量TEA溶液，用来除去DOX·HCl上的HCl，得到含式(XV)所示特征结构的化合物。再将含该化合物的甲醇浓缩液逐滴滴加到5mL去离子水中，边搅拌边滴加，滴加结束后，避光继续搅拌4h。最后将反应后的溶液进行冷冻干燥，得到纳米药物冻干粉。

实施例2：以谷氨酸酰基赖氨酸二聚体(EK)、半胱氨酸(C)和天冬氨酸为基础多肽(EK-C-D)的载阿霉素纳米药物制备

(一)巯基活化EK-C-D多肽骨架的合成

参见合成路线(4)，分别称取1g侧链Z保护的EK二聚体(2mmol)、0.3mmol侧链Z 保护天冬氨酸和0.1817g H-Cys(Trt)-OH(0.5mmol)加入到50mL的圆底烧瓶中，然后加入4mL的无水DMF溶液。再分别称取0.69g EDC·HCl(3.6mmol)、0.4865g HOBt(3.6mmol)以及0.9306g DIEA溶液(7.2mmol)加入到上述圆底烧瓶中，超声至全部溶解，然后用封口膜密封搅拌反应48h。通过改变H-Cys(Trt)-OH的加入量合成EK跟C摩尔比分别为2:1、 3:1和4:1的混聚多肽产物。

反应结束后，向烧瓶中加入10倍DMF量的无水乙醚将反应产物沉出，并搅拌适当时间以除去反应中过量的DIEA，静置一段时间后除去上清液。再向烧瓶中加入10倍DMF量的甲醇溶液并超声5min，重复加入甲醇洗涤两次以除去反应中残留的HOBt和DIEA形成的盐。最后离心除去上清液，将沉淀放入真空干燥箱干燥得到化合物10。

称取0.2g上述化合物10加入到100mL的圆底烧瓶中，再加入与多肽聚合物中侧链巯基摩尔比为3:1的2,2’-二硫二吡啶(PySSPy)。然后向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h。反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。反复用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。然后用截止分子量为3000的超滤离心管对干燥后的样品进行超滤离心，以除去过量的PySSPy及其他杂质，最后冷冻干燥得巯基吡啶活化的EK-C-D 多肽聚合物(化合物11)。

(二)基于EK-C-D多肽骨架以二硫键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-T)的合成及其阿霉素包载纳米药物制备

参见合成路线(4)，称取20mg上述巯基吡啶活化的EK-C-D多肽聚合物(化合物11)并溶于4mL甲醇中，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为1.1:1的ω-巯基脂肪酸，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤除去ω-巯基脂肪酸。对去离子水透析2天后，冷冻干燥，得到EK-C-D-T多肽聚合物(化合物12)，其结构式如式(IX)所示，其中，x＝36，y＝8，z＝6，w＝11。ω-巯基脂肪酸分别为ω-巯基己酸、ω-巯基辛酸和ω-巯基十二酸。

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-C-D-T，经0.1N NaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析3小时，再对超纯水透析21小时，经冷冻干燥获得EK-C-D-T包载阿霉素纳米药物。

(三)基于EK-C-D多肽骨架以硫醚键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-M)的合成及其阿霉素包载纳米药物制备

参见合成路线(5)称取0.2g上述化合物10加入到100mL的圆底烧瓶中，然后向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h。反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。反复用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。最后冷冻干燥得EK-C-D多肽聚合物(化合物13)，其结构式如式(III)所示，其中，x＝36,y＝8z＝6。

称取20mg EK-C-D多肽聚合物(化合物13)并溶于4mL甲醇中，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为1:1的ω-马来酰亚胺基脂肪酸，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤除去ω-巯基脂肪酸。对去离子水透析2天后，冷冻干燥，得到EK-C-D-M(化合物14)，其结构式如式(X)所示，其中，x＝36,y＝8,z＝6，w＝7。ω-马来酰亚胺基脂肪酸分别为ω- 马来酰亚胺基辛酸和ω-马来酰亚胺基十一酸。

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-C-D-M(14)，经0.1N NaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析3小时，再对超纯水透析21小时，经冷冻干燥获得EK-C-D-M包载阿霉素纳米药物。

实施例3：以谷氨酸酰基赖氨酸二聚体(EK)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸和苯丙氨酸为基础多肽(EK-C-D-F)的载阿霉素纳米药物制备

(一)EK-C-D-F多肽骨架的合成

参见合成路线(6)，分别称取1g侧链Z保护的EK二聚体(2mmol)、0.3mmol侧链Z 保护天冬氨酸、0.1817g H-Cys(Trt)-OH(0.5mmol)和0.3mmol苯丙氨酸(F)加入到50 mL的圆底烧瓶中，然后加入4mL的无水DMF溶液。再分别称取0.9g EDC·HCl(4.7mmol)、 0.64gHOBt(4.7mmol)以及1.21g DIEA溶液(9.4mmol)加入到上述圆底烧瓶中，超声至全部溶解，然后用封口膜密封搅拌反应48h。通过改变H-Cys(Trt)-OH的加入量，合成 EK跟半胱氨酸(C)的摩尔比分别为2:1、4:1和6:1的混聚多肽产物；通过改变苯丙氨酸的加入量合成EK跟苯丙氨酸摩尔比分别为2:1、3:1和4:1的混聚多肽产物。

反应结束后，向烧瓶中加入10倍DMF量的无水乙醚将反应产物沉出，并搅拌适当时间以除去反应中过量的DIEA，静置一段时间后除去上清液。再向烧瓶中加入10倍DMF量的甲醇并超声5min，重复加入甲醇洗涤两次以除去反应中残留的HOBt和DIEA形成的盐。最后离心除去上清液，将沉淀放入真空干燥箱干燥得到化合物16。

称取0.2g上述化合物16加入到100mL的圆底烧瓶中，向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h,反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。反复用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。然后用截止分子量为3000的超滤离心管对干燥后的样品进行超滤离心，以除去其他杂质，最后冷冻干燥得纯净化合物EK-C-D-F(化合物17)，其结构式如式(IV)所示，其中，x＝32,y＝7,z＝5,u＝5。

(二)EK-C-D-F多肽包载阿霉素纳米药物制备

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-C-D-F(化合物17)，经0.1NNaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析3小时，再对超纯水透析21小时，透析过程中因水中溶氧促使半胱氨酸残基上巯基形成交联，经冷冻干燥获得EK-C-D-F包载阿霉素纳米药物。

同理，如式(Ⅰ)所示的两性离子多肽中的半胱氨酸残基，如式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)所示的两性离子多肽衍生物中的残余的半胱氨酸残基交联，能在纳米药物中形成两性离子多肽保护层。

(三)基于EK-C-D-F多肽骨架以硫醚键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-F-M)的合成及其阿霉素包载纳米药物制备

合成方法参见合成路线(6)和合成路线(5)，称取20mg上述化合物EK-C-D-F(化合物 17)并溶于4mL甲醇中，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为1:1的ω-马来酰亚胺基脂肪酸，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤除去ω-马来酰亚胺基脂肪酸。对去离子水透析2天后，冷冻干燥，得到EK-C-D-F-M，其结构式如式(XI)所示，其中，x＝32,y＝7， z＝5，u＝5，w＝7。ω-马来酰亚胺基脂肪酸分别为ω-马来酰亚胺基辛酸和ω-马来酰亚胺基十一酸。

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-C-D-F-M，经0.1N NaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析3 小时，再对超纯水透析21小时，经冷冻干燥获得EK-C-D-F-M包载阿霉素纳米药物。

(四)巯基活化EK-C-D-F多肽骨架的合成

合成方法参见合成路线(4)，分别称取1g侧链Z保护的EK二聚体(2mmol)、0.3mmol侧链Z保护天冬氨酸、0.3634g H-Cys(Trt)-OH(1mmol)和1mmol苯丙氨酸加入到50mL 的圆底烧瓶中，然后加入4mL的无水DMF溶液。再分别称取0.9g EDC·HCl(4.7mmol)、 0.64gHOBt(4.7mmol)以及1.21g DIEA溶液(9.4mmol)加入到上述圆底烧瓶中，超声至全部溶解，然后用封口膜密封搅拌反应48h。通过改变H-Cys(Trt)-OH的加入量合成EK 跟C摩尔比分别为2:1、4:1和6:1的混聚多肽产物；通过改变苯丙氨酸的加入量合成EK跟苯丙氨酸摩尔比分别为2:1、3:1和4:1的混聚多肽产物

反应结束后，向烧瓶中加入10倍DMF量的无水乙醚将反应产物沉出，并搅拌适当时间以除去反应中过量的DIEA，静置一段时间后除去上清液。再向烧瓶中加入10倍DMF量的甲醇并超声5min，重复加入甲醇洗涤两次以除去反应中残留的HOBt和DIEA形成的盐。最后离心除去上清液，将沉淀放入真空干燥箱干燥得到化合物(未脱保护EK-C-D-F)。

称取0.2g上述未脱保护EK-C-D-F加入到100mL的圆底烧瓶中，再加入与多肽聚合物中侧链巯基摩尔比为3:1的2,2’-二硫二吡啶(PySSPy)。然后向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h。反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。反复用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。然后用截止分子量为3000的超滤离心管对干燥后的样品进行超滤离心，以除去其他杂质，最后冷冻干燥得巯基吡啶活化EK-C-D-F。

(五)基于EK-C-D-F多肽骨架以二硫键连接脂肪酸多肽(EK-C-D-F-T)的合成及其阿霉素包载纳米药物制备

合成方法参见合成路线(2)，称取20mg上述巯基吡啶活化EK-C-D-F并溶于4mL甲醇中，加入与多肽聚合物中巯基侧链摩尔比为1:1的ω-巯基脂肪酸，在N₂保护下搅拌反应4h，反应结束后，超滤除去ω-巯基脂肪酸。对去离子水透析2天后，冷冻干燥，得到EK-C-D-F-T，其结构式如式(XII)所示，其中，x＝32，y＝7，z＝5u＝5，w＝5。ω-巯基脂肪酸分别为ω-巯基己酸、ω-巯基辛酸和ω-巯基十二酸。

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-C-D-T，经0.1N NaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析3小时，再对超纯水透析21小时，经冷冻干燥获得EK-C-D-F-T包载阿霉素纳米药物。

实施例4：基于EK-D-F多肽骨架的合成及其阿霉素包载纳米药物制备

(一)EK-D-F多肽骨架的合成

参见合成路线(6)的多肽合成方法，分别称取1g侧链Z保护的EK二聚体(2mmol)、0.4mmol侧链Z保护天冬氨酸和1mmol苯丙氨酸加入到50mL的圆底烧瓶中，然后加入4mL 的无水DMF溶液。再分别称取0.73g EDC·HCl(3.8mmol)、0.52g HOBt(3.8mmol)以及 0.98gDIEA溶液(7.6mmol)加入到上述圆底烧瓶中，超声至全部溶解，然后用封口膜密封搅拌反应48h。通过改变苯丙氨酸的加入量合成EK跟苯丙氨酸摩尔比分别为2:1、3:1和 4:1的混聚多肽产物。

反应结束后，向烧瓶中加入10倍DMF量的无水乙醚将反应产物沉出，并搅拌适当时间以除去反应中过量的DIEA，静置一段时间后除去上清液。再向烧瓶中加入10倍DMF量的甲醇并超声5min，重复加入甲醇洗涤两次以除去反应中残留的HOBt和DIEA形成的盐。最后离心除去上清液，将沉淀放入真空干燥箱干燥得到化合物(未脱保护的EK-D-F)。

称取0.2g上述(未脱保护的EK-D-F)，加入到100mL的圆底烧瓶中，向烧瓶中加入2mL TFA溶液超声至反应物溶解，最后再加入4mL的33wt.％HBr/HOAc溶液，搅拌反应4h,反应结束后，向烧瓶中加入10倍量TFA/HBr混合溶液的无水乙醚将反应产物沉出。反复用无水乙醚洗涤3次，离心后除去上清放入真空干燥箱干燥。然后用截止分子量为3000的超滤离心管对干燥后的样品进行超滤离心，以除去其他杂质，最后冷冻干燥得纯净混聚化合物(EK-D-F)，其结构式如式(V)所示，其中，x＝37,z＝8,u＝19。

(二)EK-D-F多肽包载阿霉素纳米药物制备

1mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)和二倍摩尔量的三乙胺(TEA)在无水二甲亚砜(DMSO)中溶解，搅拌6小时；将该溶液缓慢滴入低速搅拌的含5.5mg EK-D-F，经0.1N NaOH调节pH为8的5ml超纯水溶液中，滴加结束再搅拌4小时后对pH 9.0的硼酸盐缓冲溶液透析4小时，再对超纯水透析20小时，经冷冻干燥获得EK-D-F包载阿霉素纳米药物。

实施例5：以谷氨酸酰赖氨酸酰半胱氨酸酰谷氨酸酰赖氨酸五肽(EKCEK)为基础的载阿霉素纳米药物制备

(一)以二硫键连接含酰肼基团的EKCEK五肽合成及其载阿霉素纳米药物制备

以标准固相合成方法制备得到EKCEK，其结构式如式(VI)所示。将100mg EKCEK(0.155 mmol)溶解到5ml甲醇，加入五多肽摩尔比为3:1的2,2’-二硫二吡啶(PySSPy)，室温搅拌过夜，用甲醇10倍体积量的乙醚沉淀。并用乙醚洗涤3次，真空干燥箱干燥后得到巯基吡啶活化EKCEK五肽。

称取5mg 3,3’-二硫代二(丙酰肼)(DTP)溶于2mL去离子水，然后加入3mg还原剂TECP，用来部分打开DTP中的二硫键，加入12.7mg巯基吡啶活化EKCEK五肽，继续搅拌反应2h。用甲醇10倍体积量的乙醚沉淀。并用乙醚洗涤3次，真空干燥箱干燥后得到二硫键连接含酰肼基团的EKCEK五肽，其结构式如式(XIV)所示。

合成反应参见合成路线(7)，称取20mg二硫键连接含酰肼基团的的EKCEK五肽冻干粉，溶于4mL无水甲醇，然后加入16mg阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)，再加入4μL无水醋酸和适量的无水硫酸钠，将反应液密封避光搅拌反应48h。反应结束后，过滤除去无水硫酸钠，收集滤液。向收集的滤液中加入少量的TEA以除去Dox分子上所带的盐酸，使其表现出疏水作用。再将反应后的上述甲醇溶液缓慢滴入到pH 9的水溶液中，滴加完毕后继续避光搅拌4h，让所合成的化合物进行自组装。将上述溶液在避光条件下进行透析，以除去游离的Dox分子，最后冷冻干燥得到最终两性离子五肽载药胶束的冻干粉。该冻干粉将于以后的各种化学表征及体外细胞实验中。

(二)以硫醚键连接含酰肼基团的EKCEK五肽合成及其载阿霉素纳米药物制备

称取200mg EKCEK(0.31mmol)干粉溶于pH 3的水溶液中，再加入67mg脱BOC保护的MAH·HBr(0.37mmol)，室温条件下搅拌反应4h。反应结束后进行冷冻干燥，得到冻干粉，其结构式如式(XIII)所示。然后称取冻干粉50mg溶于无水甲醇中，加入42.8mg盐酸阿霉素(Dox·HCl)，加入一滴冰醋酸和适量的无水硫酸钠，避光搅拌反应48h。反应结束后，过滤除去无水硫酸钠，收集滤液。向收集的滤液中加入少量的TEA以除去Dox分子上所带的盐酸，使其表现出疏水作用。再将反应后的上述甲醇溶液缓慢滴入到pH 9的水溶液中，滴加完毕后继续避光搅拌4h，让所合成的化合物进行自组装。将上述溶液在避光条件下进行透析，以除去游离的Dox分子，最后冷冻干燥得到最终两性离子五肽载药胶束的冻干粉。该冻干粉将于以后的各种化学表征及体外细胞实验中。

实施例6：

本实施例以实施例1制备得到的基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼的两性离子多肽的阿霉素接枝纳米药物为例的表征和抑瘤效果测定。该纳米药物以EK二聚体和巯基三苯甲基保护的半胱氨酸(H-Cys(Trt)-OH)(EK：C)为3：1合成，SPP与MAH修饰的比率为3：2，得到的两性离子多肽衍生物中EK/MAH/SPP为x＝32,v＝4,y-v＝7，经酰肼接枝阿霉素效率大于90％。

(一)载药胶束的临界胶束浓度测定(CMC)

本实施例利用芘荧光探针法来测定多肽混聚物载药胶束的临界胶束浓度(CMC)。首先配制芘的丙酮溶液，使其浓度为1.6×10^-6M，然后将配制好的芘的丙酮溶液加入到带刻度的试管中，让丙酮挥发干净。按浓度从高到底，将多肽混聚物配置成0.4mg/mL到7.8×10^{- 4}mg/mL 的水溶液。然后将不同浓度的多肽混聚物溶液加入到上述含有芘的刻度试管中，使得每只刻度试管中芘的最终浓度为6×10^-7M，在室温条件下避光孵育24小时。最后用荧光分光光度计在390nm波长的发射光下检测300-360nm波长下的激发光谱，然后用338nm和333nm波长处荧光强度的比值(I₃₃₈/I₃₃₃)作为纵坐标，多肽混聚物浓度对数值作为横坐标作图，曲线拐点处对应的多肽聚合物浓度即为其在水中的CMC。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的CMC 典型结果见图4，显示该药物的CMC在4.85mg/L水平。

(二)载药胶束的粒径与Zeta电位表征

利用纳米粒度仪(Zetasizer Nano-ZS)对所制备的载药纳米胶束的光学粒径以及胶束的表面Zeta电位进行表征。具体操作步骤如下：

称取1mg纳米载药胶束的冻干粉，溶于5mL的PBS溶液中，然后吸取100μL上去胶束溶液滴加到一次性塑料比色皿，放入粒度仪进行检测。配制pH分别为5.0、5.6、6.2、6.8、7.4和8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(Mcllvaine Buffer)，然后各取1mL上述MB溶液溶解载药胶束冻干粉，最终配制得到浓度为0.2mg/mL，将不同pH的载药胶束溶液加入到马尔文Zeta电位样品池中，放入粒度仪进行检测。仪器参数为：温度25℃、光散射检测角度173o。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的 Zeta电位典型结果见图5，显示该药物载体在pH7.4时为略带负电荷，肿瘤微环境的pH6.7 时接近中性。这有利于该纳米药物有较好的血液相容性，而进入肿瘤微环境后能够降低与肿瘤细胞的电荷排斥。

(三)载药胶束的形貌表征

通过透射电镜(TEM)对纳米载药胶束的形貌进行表征。样品制备方法如下：配制浓度为0.2mg/mL的载药胶束水溶液，用移液枪吸取10μL滴加两到三滴胶束溶液到铜网支持的碳膜上，然后将碳膜置于滤纸上，室温晾干后于电镜下观察胶束形貌。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的TEM 典型结果见图6，显示纳米药物粒径小于100纳米。

(四)聚合物上酰肼接枝率和胶束载药量测定

首先建立2-巯基吡啶的标准曲线(PySH)，称取2mg PySH溶于3mL去离子水(pH 3)，然后稀释相应的倍数5-15倍，然后再稀释20倍，在270nm吸收波长处用紫外分光光度计进行测试，从而得到PySH在去离子水(pH 3)中的紫外吸收标准曲线。

向化合物11的水溶液中加入过量的还原剂TCEP，将聚合物上的二硫键打开释放出PySH，然后在270nm处检测溶液的吸光度值，根据PySH的紫外吸收标准曲线计算出游离PySH的物质的量(b)；再向化合物(11)的水溶液中加入过量的TP，用来将聚合物上的PySH置换出来，然后测定此时溶液的紫外吸光度值并计算被替换下来的PySH的物质的量(a)。酰肼接枝率(CE)计算公式：CE＝a/b*100％。

阿霉素紫外吸收标准曲线的建立：配制不同浓度的DOX·HCl水溶液，然后分别不同浓度的DOX·HCl水溶液中加入一滴浓盐酸，使阿霉素溶液酸化，以排除不同pH对DOX·HCl的紫外吸收产生的影响。最后用紫外分光光度计分别测量上述溶液在485nm处的吸光度，并绘制阿霉素紫外吸收标准曲线。

称取1mg载药胶束冻干粉，溶于1mL pH为3.0的醋酸缓冲溶液中，然后置于50℃的恒温金属浴中振荡24h。反应结束后再加入2mL用浓盐酸酸化的去离子水，放入石英比色皿中，在485nm处检测样品的吸光度。并根据以下公式来计算载药胶束的载药量(DLC)。

DLC＝(载药胶束中阿霉素的质量/载药胶束的质量)*100％

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物在EK-C 比例为2:1、3:1和4:1时酰肼基团接枝率分别为95.1％、90.06％、91.46％，三种聚合物酰肼基团接枝率均在90％以上。

(五)载药胶束的稳定性测试

利用DLS来检测载药胶束在不同的溶液中其粒径大小随着时间的变化来表征载药胶束的稳定性。具体操作步骤如下：称取2mg载药胶束冻干粉溶于1mL的PBS溶液中，然后分别取0.1mL上述载药胶束溶液加入到0.9mL的PBS溶液，100％的FBS溶液和含3mg/mL牛纤维蛋白原(Fg)的PBS溶液中，然后将上述样品密封保存在37℃摇床中。最后在不同的时间点将样品取出分别来测定载药胶束的光学粒径变化。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的与血清和纤维蛋白原相互作用典型结果见图7，说明和血清、纤维蛋白源能够稳定的相容，不会因非特异性蛋白质吸附而导致聚集。

(六)载药胶束的酸敏感测试

在弱酸环境中，载药胶束表面的-COO^-基团会发生质子化，因此载药胶束与多聚唾液酸(PSA)的亲和作用会增强。为了证明在肿瘤细胞微环境中，我们设计的载药胶束会与肿瘤细胞过量分泌的PSA发生作用使其表面质子化，并发生聚集，分别配制pH为6.7/7.4的20mM PB+130mM NaCl缓冲溶液(含0.075mg/mLPSA)，将载药胶束冻干粉溶于上述溶液中并控制胶束浓度为0.2mg/mL，最后在设点的时间点用DLS对样品的粒径变化进行检测。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的酸敏感性典型结果见图8，说明在pH接近肿瘤组织时能够识别肿瘤细胞表面的PSA，提高对肿瘤组织的靶向性。

(七)载药胶束的pH响应、还原响应药物释放行为研究

通过分别测试载药胶束在pH7.4、pH5.0和pH5.0+GSH(10mM)的缓冲溶液中的药物释放行为来表征载药胶束对pH刺激、还原刺激的响应。具体操作步骤如下：将5mL载药胶束溶液(5mg/mL)装于截留分子量为3500Da的透析袋中，分别置于45mL上述不同缓冲溶液中，然后放在37℃的恒温空气浴摇床(200rpm)中振荡。在不同的时间点取出2mL透析液，并加入浓盐酸酸化，然后再补加2mL对应的新鲜缓冲液。最后将取出的透析液在485nm处测定其吸光度，利用前面建立的阿霉素标准曲线来计算载药胶束的药物累计释放量。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的pH 响应、还原响应药物释放行为典型结果见图9，说明该纳米药物在正常生理条件下非常稳定，而在低pH肿瘤微环境和细胞内还原环境具有快速释放的能力。

(八)多肽聚合物的圆二色谱表征

分别配制浓度为0.2mg/mL的多肽混聚物水溶液、载药胶束水溶液、载药胶束+GSH(10mM)水溶液，利用移液枪各吸取上述溶液200μL加入到光程为1mm的圆二色石英比色皿中，然后放入圆二色光谱仪中检测。扫描范围为190-260nm，扫描速度为20nm/min，带宽为1.00 nm。最后将图谱结果放到Dichroweb网站进行数据分析。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的圆二色谱典型结果见图10，说明纳米药物内多肽以无规转折结构为主，在释放后药物后，变成了更为松散的alpha螺旋。可见，本发明两性离子多肽的二级结构在药物释放前后具有优良转换能力，可加速药物在细胞内的释放。

(九)载药胶束的体外生物安全性评估

选用DMEM细胞培养液(含10％FBS和1％的双抗)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行培养，培养条件为5％CO²和37℃的饱和湿度。根据细胞的生长情况，待细胞贴壁铺满以后，进行传代，一般每隔2-3天进行一次传代。最后选用处于对数生长期的HUVECs细胞用于MTT实验。同时选取另外两种肿瘤细胞，即MCF-7和PANC-1作为对照，用来研究我们所制备的载药体系在未载药的情况下对肿瘤细胞所产生的细胞毒性。上述两种肿瘤细胞的培养方法与正常细胞 HUVEC细胞相同，只是将原来的DMEM培养基替换成RPMI-1640培养基。

将上述培养的HUVECs细胞按细胞密度5×10³个/孔接种到96孔板中，放入恒温细胞培养箱继续培养4小时，加入不载药多肽混聚物样品的冻干粉溶于配制好的DMEM溶液中，使得最终的样品浓度梯度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL，每个不同浓度样品做5复孔平行实验。96孔板中的细胞培养24h后，加入含有0.5μg/mLMTT 的培养液，每个孔加入200μL。细胞培养4h后，移除含有MTT的培养液，然后每个孔加入150μL DMSO溶液，振荡一段时间后，放入酶标仪，在570nm波长下检测96孔板中每个孔的OD值。未加任何药物只加培养基的细胞作为阴性对照组，加入空白培养液不加细胞的为调零组。

最后，利用下面的计算公式来计算不同样品的细胞相对生存率：

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的细胞毒性典型结果见图11，说明在正常的药物传递浓度下该多肽不显示细胞毒性，只有高浓度时对细胞活性有抑制能力。

(十)载药胶束对乳腺癌细胞(MCF-7)体外抑制效果研究

选用RPMI-1640细胞培养液(含10％FBS和1％的双抗)对乳腺癌细胞(MCF-7)进行培养，培养条件为5％CO²和37℃。根据细胞的生长情况，待细胞贴壁铺满以后，进行传代，一般每隔2-3天进行一次传代。最后选用处于对数生长期的MCF-7细胞用于MTT实验。

将上述培养的MCF-7细胞按细胞密度5×10³个/孔接种到96孔板中，放入恒温细胞培养箱继续培养。将载药胶束冻干粉分别溶于pH为6.7(用HCl调pH)跟7.4的RPMI-1640细胞培养液中，使得最终的样品浓度梯度分别为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20 μg/mL(以Dox的含量为准)。同样配制不同浓度不同pH值的Free Dox的RPMI-1640细胞培养液，作为阳性对照组。96孔板中的细胞培养24h后，取出弃掉孔中的培养液，将上述配制的EK-C-SS-Dox和Free Dox的RPMI-1640细胞培养液加入其中，每个孔加入200μL，每个不同浓度样品做5复孔平行实验。细胞继续培养4h后，移除含有药物的培养基，重新加入不含药物的RPMI-1640培养基。将96孔板放回细胞培养箱继续培养，细胞培养20h后，移除培养基，加入含有0.5μg/mL MTT的培养液，每个孔加入200μL。细胞培养4h后，移除含有MTT的培养液，然后每个孔加入150μL DMSO溶液，振荡一段时间后，放入酶标仪，在 570nm波长下检测96孔板中每个孔的OD值。未加任何药物只加PBS缓冲液的细胞作为阴性对照组，加入空白培养液不加细胞的为调零组。根据细胞相对生存率公式来计算不同样品的细胞生存率。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的细胞毒性典型结果见图12，说明载药胶束与Free Dox相比，在生理pH 7.4变成肿瘤微环境pH6.7 时对乳腺癌细胞(MCF-7)的体外抑制效果有显著提高。

(十一)乳腺癌细胞(MCF-7)对载药胶束的内吞及其细胞摄取机制研究

MCF-7细胞的培养方法参照实施例5(十)。

利用MCF-7细胞对载药胶束的摄取机制的研究，具体操作步骤如下：将上述培养的MCF-7 细胞按细胞密度5×10⁵个/孔接种到6孔板中，然后放入恒温细胞培养箱继续培养20h。用 RPMI-1640细胞培养液(pH 6.7，用HCL调节)配制下列各种细胞抑制剂：30μg/mL的盐酸氯丙嗪、15μg/mL的金雀异黄酮、133μg/mL的盐酸阿米洛利、30μg/mL以及7.5mM的甲基-β-环糊精。然后称取一定质量的载药胶束冻干粉溶于上述含有细胞抑制剂的细胞培养液中，使得Dox的当量浓度为10μg/mL。细胞培养20h后取出并弃掉6孔板中的培养基，加入上述配制的含有细胞抑制剂的细胞培养基各2mL继续培养30min，然后弃去培养基，再每个孔中加入2mL同时含有载药胶束和细胞抑制剂的细胞培养液。继续培养2h后移除培养基，用无菌PBS溶液冲洗2-3次，用胰酶将细胞消化下来，离心除去上清，加入500μL无菌PBS溶液重悬，然后用流式细胞仪(FCM)来检测细胞对载药胶束的内吞情况。只加载药胶束不加细胞抑制剂样品组作为阴性对照组，另外一组加入载药胶束但不加入细胞抑制剂先放入 4℃冰箱30min，然后再加入2mL只含有载药胶束的细胞培养液放入4℃冰箱继续培养2h，然后用FCM检测。FCM检测过程中，细胞采集个数为10000个。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞摄取典型结果见图13，说明甲基-β-环糊精(MβCD)对纳米药物摄取有部分抑制，低温可完全抑制，而其他介导途径抑制不明显，说明载体是通过憎水性与膜相互作用下的能量依赖型摄取方式。

(十二)载药胶束对巨噬细胞(RAW-264.7)抗免疫吞噬行为研究

选用RPMI-1640细胞培养液(含10％FBS和1％的双抗)对巨噬细胞(RAW-264.7)进行培养，培养条件为5％CO²和37℃。根据细胞的生长情况，待细胞贴壁铺满以后，进行传代，传代时只需用移液枪吹打无需加入胰酶消化。最后选用处于对数生长期的RAW-264.7细胞用于抗免疫吸附实验。

将上述培养的RAW-264.7细胞按细胞密度5×10⁵个/孔接种到6孔板中，然后放入恒温细胞培养箱继续培养20h。将一定量的载药胶束冻干粉和Doxil溶于RPMI-1640细胞培养液，使Dox的当量浓度为10μg/mL，同时用RPMI-1640细胞培养液配制浓度为10μg/mL FreeDox 的溶液。细胞培养结束后，移除6孔板中的培养基，重新加入上述配制的含药物的细胞培养基各2mL。继续培养4h后，移除含有药物的培养基，加入无菌PBS溶液轻轻晃动冲洗2次，然后加入2mL新鲜细胞培养液用移液枪吹打1-2min，离心除去上清，加入500μL无菌PBS 溶液重悬。然后用流式细胞仪(FCM)来检测RAW-264.7细胞对市售Doxil和我们制备的载药胶束的内吞情况，其中Free Dox组作为阳性对照组。FCM检测过程中，细胞采集个数为10000个。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的抗巨噬细胞(RAW-264.7)免疫吞噬典型结果见图14，说明该载体抗免疫吞噬能力比市售Doxil有显著提高。

(十二)载药胶束的体内清除实验

动物实验参照浙江大学动物饲养与使用委员会的相关规定进行。选取体重约18-22g的ICR雌鼠为模型来研究载药胶束在小鼠体内的血浆清除实验，将小鼠随机分成3组，每组数量为3只。将载药胶束冻干粉、市售Doxil、游离盐酸阿霉素溶于1×PBS溶液中，注射剂量为10mg/kg的阿霉素当量浓度，每只小鼠注射200μL，给药方式为尾静脉注射给药。在设定的时间点，分别在给药2min、1h、2h、4h、6h、12h、24h后，通过眼眶采血的方式每只小鼠取血20μL放入装有肝素钠的离心管中，然后向含有小鼠血液的离心管加入370μL 酸化后的甲醇溶液，再将上述离心管放入37℃的恒温空气浴摇床200rpm条件下振荡孵育24 h。最后在4℃，3500rpm条件下离心5min，利用荧光分光光度计在激发波长为485nm，发射波长为593nm条件下测量其荧光值，根据在游离阿霉素在酸化的甲醇中的标准曲线来计算不同时间点血液中的药物浓度。

利用荧光分光光度计建立阿霉素标准曲线：用含1％浓盐酸的甲醇溶液配置浓度分别为 0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL阿霉素溶液，然后在激发波长为485nm，发射波长为593nm条件下测量其荧光值，并绘制阿霉素荧光强度-浓度标准曲线。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内清除典型结果见图15，说明该载体比市售Doxil有更长的体内循环时间，和显著提高在血液中的药物浓度。

(十三)载药胶束在小鼠活体中的体内分布

体重为18-22g的Balb/c裸鼠购于上海斯莱克动物有限责任公司。荷瘤裸鼠模型的构建：选用RPMI-1640细胞培养液(含10％FBS和1％的双抗)对MCF-7细胞进行培养，培养条件为5％CO₂和37℃。当细胞增殖到一定数量以后，用胰酶进行消化，37℃条件下消化2min，然后加入完全培养基终止消化并进行细胞计数，离心去掉上清后，然后加入100μL无菌PBS和100μL基质胶混合溶液重悬。用一次性灭菌注射器上述吸取200μL(约5×10⁶个细胞)细胞溶液以皮下注射的方式，在裸鼠的下肢附近进行荷瘤。当肿瘤体积达到50mm³时，进行组织分布实验。肿瘤体积计算公式为V＝1/2*ab²，其中，a为肿瘤长边长，b为肿瘤短边长。

称取一定质量被Cy5.5-NHS标记过的载药胶束冻干粉，溶于PBS无菌溶液中，用注射器吸取200μL上述溶液(Dox的当量浓度为8mg/kg)，通过尾静脉注射到小鼠体内，在不同的设定时间点：2h、4h、6h、12h、24h、48h，将小鼠用异氟烷气体麻醉后，通过小动物活体成像仪对药物的体内分布进行实时监测。

分别在给药2h、5h、10h后，将小鼠断颈处死，并进行解剖，剥取出小鼠的肿瘤跟脏器组织，然后用小动物活体成像仪进行荧光拍照，并使用IVIS Spectrum Software进行荧光定量校正，精确计算出药物在各组织器官中的富集数量。设置仪器的激发波长为670nm，发射波长为710nm，曝光时间为4s，光圈D模式。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内分布典型结果见图16，说明该纳米药物主要集中在肿瘤处，而且大大降低了常规纳米药物大量聚集的肝脏和肾等健康器官，显示优秀的体内肿瘤靶向性。

(十四)载药胶束体内抑瘤效果研究

选取体重18-22g的Balb/c裸鼠并随机分成3组，每组6只，其中5只用来监测小鼠体重变化和生存率，另外一只用来做组织病理学分析。然后每组小鼠进行皮下注射200μL含 5×10⁶个MCF-7细胞的PBS溶液。待肿瘤体积长到约100mm³时，进行尾静脉注射给药，每 4天给药一次，分别给予剂量为8mg/kg Dox当量浓度的载药胶束作为实验组，同样Dox当量浓度的Doxil组作为阳性对照组，注射PBS组为阴性对照组。隔天称量并记录各组小鼠的体重变化，并且用游标卡尺对肿瘤长径(a)和短径(b)进行测量，从而计算并记录肿瘤体积(V)的变化。给药18天后，从每组中各取出一只小鼠进行处死，并取出脏器和肿瘤进行组织病理学分析。肿瘤体积(V)的计算公式为：

V＝1/2*ab²，

其中，a为肿瘤长边长，b为肿瘤短边长。

基于EK-C多肽骨架以二硫键连接的含酰肼负电荷偏置多肽的阿霉素接枝纳米药物的体内抑瘤效果见图17b，给药后裸鼠体重变化结果见图17a，说明该纳米药物比Doxil更优秀的抑瘤能力，肿瘤体积迅速缩小，且毒性更小，裸鼠体重与PBS控制组相似，更健康。

由实施例1至实施例5制备得到的任一种纳米药物使用与实施例6相同的表征方法，其抑瘤效果近似，均使肿瘤生长明显慢于非治疗组。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不应被理解为限制了本发明的保护范围，显然本发明不限于以上实施例，任何在本发明权利要求基础上的改动和变形，都在本发明的保护范围内。