阅读说明：本技术 一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1及其应用 (Key gene PeSCE1 for controlling adventitious root formation and plant height development of poplar and application thereof ) 是由 刘思安 胥猛 祁浩然 吴玲 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1及其应用,关键基因PeSCE1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。本发明以“南林895”杨不定根为材料,通过RACE技术克隆了PeSCE1基因,利用Gateway技术构建过量表达载体35S::PeSCE1并转入杨树中。PeSCE1转基因杨树的不定根数目明显减少,株高也明显降低。这表明PeSCE1基因是调控杨树不定根形成和株高发育的关键基因,在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。(The invention discloses a key gene PeSCE1 for controlling adventitious root formation and plant height development of poplar and application thereof, wherein the nucleotide sequence of the key gene PeSCE1 is shown as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of an expression protein thereof is shown as SEQ NO. 2. The invention takes Nanlin 895 poplar adventitious roots as a material, clones PeSCE1 gene by RACE technology, and constructs an overexpression vector 35S by Gateway technology, namely PeSCE1 and transfers the overexpression vector into poplar. The number of the indefinite roots of the transgenic poplar PeSCE1 is obviously reduced, and the plant height is also obviously reduced. The result shows that the PeSCE1 gene is a key gene for regulating the formation of adventitious roots and the plant height development of poplar trees and has important application value in the fields of forest genetic engineering and clone forestry.)

一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1及其 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1及其应用。

背景技术

杨树是重要的速生工业用材树种和绿化造林树种之一，对无性系林业可持续发展发挥了重要作用。在育苗过程中，杨树通常采用扦插育苗，因此插穗生根的难易程度直接影响造林成活率，且事关无性系的适应性和抗逆性。尽管大多数杨树都比较容易扦插生根，然而仍有许多优良无性系扦插生根困难。而树高对于用材树种的重要性不言而喻，是育种家一直以来进行品种改良的一个重要性状。随着林木遗传改良工作和基因工程技术的发展，人们对于杨树扦插繁殖的重要性有了新的认识，意识到从理论和实践上加强对扦插生根的机理研究有其必要性和迫切性。

泛素是一类与蛋白降解相关的小肽，小泛素相关修饰物(small ubiquitin-likemodifier，SUMO)是结构构象和连接机制都与泛素系统相似的众多类泛素修饰的一种。SUMO化是一种重要的翻译后修饰，参与SUMO化的酶主要有三种：SUMO活化酶(E1活化酶，SAE)、SUMO结合酶(E2结合酶，SCE1)和SUMO连接酶(E3连接酶，SIZ和MMS21/HPY2)。这三种酶经过活化、结合、连接的配合进行SUMO化过程。在植物中，SUMO化在植物的生长发育和胁迫响应中扮演着必不可少的角色。在拟南芥中，SUMO化在干旱、低温等非生物胁迫以及生长发育中都起着重要作用。在水稻中，SUMO化参与了冷胁迫、ABA胁迫响应以及生长发育调控。而SUMO化过程中的关键酶基因SCE1目前研究的仍然较少，在林木中有关SCE的功能研究鲜有报道。

在杨树中尚未有PeSCE1的研究报道，克隆和研究该基因的功能，不仅有助于理解该基因对杨树不定根形成和植株高度的调控机制，而且还能促进林木分子育种的发展进程，对杨树无性系造林以及木材产量的增加有着不可估量的价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1。本发明的另一目的是提供控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1在改良杨树不定根数量和株高中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1，其核苷酸序列如SEQNO.1所示。

控制杨树不定根形成和株高发育的PeSCE1表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

含有所述的控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1的载体。

作为一种实施方案：

所述载体，在PeSCE1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeSCE1基因在杨树体内高效表达。

所述载体，在PeSCE1基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeSCE1基因的转录。

所述载体组装NPTⅡ基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用卡那霉素进行转基因杨树的筛选。

所述载体组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeSCE1基因表达框架和筛选标记基因NPTⅡ整合至杨树受体细胞染色体中。

含有所述的控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1、或所述载体的宿主细胞。

本发明最后提供了所述控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1在改良杨树不定根数量和株高中的应用。

本发明以南林895杨不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeSCE1基因。同时，采用Gateway克隆技术构建其杨树过量表达载体35S::PeSCE1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeSCE1可在杨树体内高效表达，从而调控杨树不定根的形成和株高的发育。

有益效果：本发明通过将PeSCE1基因转入杨树，过量表达PeSCE1基因的转基因杨不定根数目明显减少，株高也明显降低，说明PeSCE1是控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因。通过对该基因的表达水平进行调控能够获得不定根数目和株高不同的杨树，因此在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。

附图说明

图1是构建好的植物表达载体35S::PeSCE1的结构示意图；

图2是过量表达PeSCE1基因的转基因杨树分子检测；

图3是过量表达PeSCE1基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较图；图中CK未转基因杨；

图4是过量表达PeSCE1基因的转基因杨与未转基因杨的不定根数量统计。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1通过RACE技术克隆PeSCE1基因

基于申请人前期杨树不定根表达谱芯片研究结果，使用Oligo 6设计3’末端的RACE引物，进行3’RACE，获得3’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’RACE，获得5’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。

引物序列：

3'RACE反应程序

(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：

(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物；

(3)3'RACE巢式PCR；

反应体系为：

反应程序：

(4)纯化片段与克隆载体的连接反应

采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进。

反应体系(5μl)：

反应条件：16℃30min；4℃过夜。

(5)大肠杆菌转化

⑴将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；

⑵取5μl纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；

⑵42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；

⑶加入800μl LB液体培养基，37℃&100rmp摇菌1h；

⑷4000rmp离心3min，吸掉上层800μl培养基，混匀剩余菌液；

⑸将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

(6)阳性克隆筛选及测序分析

从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃&250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。

反应体系:

反应程序：

菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定。

5'RACE反应程序

(1)RNA处理(RNA Processing)

⑴CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：

⑵轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1h；

⑶加入以下试剂到CIP反应离心管：

Ammonium Acetate Solution 15μl

Nuclease-free Water 115μl

acid phenol:chloroform 150μl

⑷充分涡旋，室温高速离心(≧10000g)5min；

⑸转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μl氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≧10000g)5min；

⑹转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μl异丙醇，充分涡旋，冰浴10min；

⑺最大转速离心20min，用0.5ml预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀；

⑻以11μlNuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；

⑼TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：

⑽轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物；

⑾5'RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：

⑿轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

(2)反转录(Reverse Transcription)

⑴将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；

⑵轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

(2)5'RACE巢式PCR

反应体系、反应条件与3'RACE的巢式PCR一致。

(3)PCR产物克隆测序，实验操作与3'RACE克隆一致。

采用BioEdit软件对3'RACE和5'RACE序列进行比对拼接，并使用FGENESH预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，再次进行PeSCE1基因的全长扩增和测序验证。其中，PeSCE1 ORF正向引物为：5’-ATGTCAGGAGGAGGCATAG CTCGT-3”’，PeSCE1 ORF反向引物为：5’-TCAGAGCGTAGGTGGGTATAGC-3”’；高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μl；2.5mM dNTP Mixture8.0μl；25mM Mg²⁺5.0μl；LA Taq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl；正向引物(10μM)2μl；反向引物(10μM)2μl；模板(895杨cDNA)1μl；加无菌ddH₂O补足50μl。反应程序：预变性94℃ 3分钟－(94℃ 40秒－55℃ 30秒－72℃ 30秒)×35个循环－72℃ 10分钟。

PeSCE1全长cDNA序列为982bp，包含一个486bp的完整阅读框，序列如SEQ NO.1所示。

实施例2PeSCE1基因植物表达载体构建

利用Gateway克隆技术构建PeSCE1基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的PeSCE1 ORF引物)，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PeSCE1基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector(Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μl；pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector 1μl；加无菌ddH₂O补足6μl。反应程序为：室温静置30min。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PeSCE1基因的入门载体与植物表达载体pBI121进行LR反应。载体质粒如图1所示。反应体系为：linearizedentry clone 100ng；purified destination vector(100ng/μl)1.5μl；LR Clonase IIenzyme mix 2μl；加TE(pH 8.0)补足10μl；。反应条件：25℃ 1h。经LR反应后PeSCE1基因导入植物表达载体pBI121中，在PeSCE1基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeSCE1基因在杨树体内高效表达；在PeSCE1基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeSCE1基因的转录；在载体质粒上组装NPTⅡ基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeSCE1基因表达框架和筛选标记基因NPTⅡ整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为35S::PeSCE1，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeSCE1可在杨树体内高效表达。

实施例3PeSCE1基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的35S::PeSCE1过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105中，通过农杆菌介导将PeSCE1基因转入杨树。实验结果如图1～4所示，其中，图1是构建好的植物表达载体35S::PeSCE1的结构示意图；图2是过量表达PeSCE1基因的转基因杨树分子检测；图3是过量表达PeSCE1基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较图；图4是过量表达PeSCE1基因的转基因杨与未转基因杨的不定根数量统计。从结果可以明显得出，过量表达PeSCE1基因的转基因杨不定根数目明显减少，株高也明显降低，说明PeSCE1基于是控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因。通过对该基因的表达水平进行调控能够获得不定根数目和株高不同的杨树，因此在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种控制杨树不定根形成和株高发育的关键基因PeSCE1及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 982

<212> DNA/RNA

<213> PeSCE1(PeSCE1)

<400> 1

gaggtcgcgt taaaagcact ctaaattaca tactgccatt tatcaaccag ttagtcagtc 60

tctgcacaga gatagagatc gatcatgtca ggaggaggca tagctcgtgg tcgtcttgct 120

gaagagagaa aggcatggcg taagaatcac cctcacggtt ttgtggctaa gcctgataat 180

gctccagatg gttctctaga tttgatgatg tggaagtgca ttatacctgg caaacccggg 240

actgattggg agggtggcta cttccccctc actcttcatt tcagtgagga ctacccaagc 300

aaacctccaa agtgcaagtt cccccaaggt ttcttccacc ctaatgtcta cccttcagga 360

actgtgtgct tatctatcct caatgaggac tatggctgga gaccagccat tactgtgaag 420

caaatattaa ttggcattca ggatttactt gatcaaccaa atccttctga tcctgcacaa 480

actgatggct atcagctttt tgtccaggac cctgctgagt acaggagaag ggtgcgccaa 540

caagccaagc tatacccacc tacgctctga tgcaatagtt gcttcaccat gcctgcaact 600

tattagttag atcccatcat atatgtccaa gcctgatcta agtagcagag tgatttagca 660

tgggtactag ttaattgtga attatagtta cgcttcccat ttctgtatta aaggatgttt 720

tttagtcatg ctttgcgaca atgctcctcc ctgcattgca agttagcaac aagacaactg 780

ttgagtatca aacctatctt gattgcccat taagattgtt atttatgcct ccagcgaaac 840

agcacgatat gtggaaaagg attgctaggg aaacgtgact gatgctgctg gaattggtta 900

aagcaagtgt aagctatgct atgtttttat atttatgaga gcgtgtatga tattgaataa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 982

<210> 2

<211> 161

<212> PRT

<213> PeSCE1表达蛋白(PeSCE1(PeSCE1))

<400> 2

Met Ser Gly Gly Gly Ile Ala Arg Gly Arg Leu Ala Glu Glu Arg Lys

1 5 10 15

Ala Trp Arg Lys Asn His Pro His Gly Phe Val Ala Lys Pro Asp Asn

20 25 30

Ala Pro Asp Gly Ser Leu Asp Leu Met Met Trp Lys Cys Ile Ile Pro

35 40 45

Gly Lys Pro Gly Thr Asp Trp Glu Gly Gly Tyr Phe Pro Leu Thr Leu

50 55 60

His Phe Ser Glu Asp Tyr Pro Ser Lys Pro Pro Lys Cys Lys Phe Pro

65 70 75 80

Gln Gly Phe Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu

85 90 95

Ser Ile Leu Asn Glu Asp Tyr Gly Trp Arg Pro Ala Ile Thr Val Lys

100 105 110

Gln Ile Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Leu Asp Gln Pro Asn Pro Ser

115 120 125

Asp Pro Ala Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Leu Phe Val Gln Asp Pro Ala

130 135 140

Glu Tyr Arg Arg Arg Val Arg Gln Gln Ala Lys Leu Tyr Pro Pro Thr

145 150 155 160

Leu