一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用

文档序号：1485962 发布日期：2020-02-28 浏览：37次 >En<

阅读说明：本技术 一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用 (OPpA gene modified recombinant strain for producing L-tryptophan and construction method and application thereof ) 是由赵春光孟刚魏爱英贾慧萍苏厚波杨立鹏郭小炜田斌于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用。本发明将大肠杆菌中野生型oppA基因中引入点突变,使SEQ ID NO:1的第817位碱基由腺嘧啶(A)突变为鸟嘌呤(G)所得到的核苷酸序列。本发明还提供一种重组菌株是将该多核苷酸序列导入产L-色氨酸的大肠杆菌菌株中获得,重组菌株中包括含有点突变的oppA基因,与未经修饰的菌株相比具有更优异的产L-色氨酸能力。(The invention provides an oppA gene modified L-tryptophan-producing recombinant strain, a construction method and application thereof. The invention introduces point mutation into wild oppA gene in Escherichia coli, and makes the 817 th base of SEQ ID NO:1 mutated from adenine (A) to guanine (G) to obtain nucleotide sequence. The invention also provides a recombinant strain obtained by introducing the polynucleotide sequence into an Escherichia coli strain for producing L-tryptophan, wherein the recombinant strain comprises an oppA gene containing point mutation and has more excellent L-tryptophan production capability compared with an unmodified strain.)

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，广泛应用于饲料行业中。

L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L- 色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展，发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L- 色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。

通过微生物生产L-色氨酸是从PEP(磷酸烯醇式丙酮酸(PhospoEnolPyruvate))与E4P(赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-Phosphate))的聚合产生的DAHP(3-脱氧D-***庚酮糖酸-7-磷酸 (3-DeoxyD-arabino-heptulosonate-7-phosphate))起始的，PEP是糖酵解(glycolysis)的中间产物， E4P是磷酸戊糖途径的中间产物。然后，从分支酸(chorismate)经共同的芳香族生物合成途径来生物合成L-色氨酸。目前，获得L-色氨酸高产菌株的方法主要包括诱变筛选育种或者基因工程育种，如何有目的地获得L-色氨酸高产菌株将对于提高L-色氨酸产量有重大意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种重组菌株及其构建方法与应用。本发明的重组菌株通过对于大肠杆菌中oppA基因开放阅读框编码区的核苷酸序列进行点突变，获得L-色氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-色氨酸能力更强。本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括野生型oppA基因编码序列第817位碱基发生突变而形成的核苷酸序列，所述野生型oppA基因编码序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述野生型oppA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1中第817位碱基由腺嘧啶(A)突变为鸟嘌呤 (G)；具体地，所述多核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。

根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供包括上述多核苷酸序列的重组载体。

根据本发明的重组载体，是将上述多核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

本发明的第四方面，提供一种大肠杆菌重组菌株，其含有如第一方面所述的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。

作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明的第五方面，还提供一种大肠杆菌重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型oppA基因开放阅读框区域的多核苷酸序列，使其第817位碱基发生突变，得到包含突变oppA编码基因的大肠杆菌重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第817位碱基由腺嘧啶(A)突变为鸟嘌呤(G)；具体地，所述突变后的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型oppA基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第817位碱基发生突变，得到突变的oppA基因开放阅读框区域多核苷酸序列；

(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变oppA编码基因的大肠杆菌重组菌株。

根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的oppA基因编码区构建：根据大肠杆菌的基因组序列，合成两对扩增oppA基因编码区片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型oppA基因编码区SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的oppA基因编码区核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为oppA ^S273G，所述大肠杆菌基因组可以来源于E.coli K12 W3110菌株，其基因组序列可以从NCBI网站获取。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

P1:5'CG GGATCC TGTACCC GCAGGCGTCAC 3'(BamHI)(SEQ ID NO:5)；

P2:5'GGTGAAATCGACATGACGAATAACGGCATGCCGATCGAATTGTTCCAGAAGC 3'(SEQ IDNO:6)；

P3:5'GCTTCTGGAACAATTCGATCGGCATGCCGTTATTCGTCATGTCGATTTCACC 3' (SEQ IDNO:7)；

P4:5'AAGGAAAAAA GCGGCCGC CCACGGTTTCACCAGACG 3'(NotI)(SEQ ID NO:8)；

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)的PCR定点突变法是以宿主菌株基因组序列为模板，分别以引物P1和P2及P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有oppA基因编码区分离的大小为740bp和750bp DNA片段，分别为oppA Up和oppA Down。将上述两条DNA 片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得oppA ^S273G；所述宿主菌株可以是本领域已知的产 L-色氨酸的大肠杆菌菌株，例如E.coli 1-1703。

在本发明的一个实施方案中，所述oppA ^S273G核苷酸序列大小为1490bp。

在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火 30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。

在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃ 退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。

根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，即将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的oppA ^S273G和pKOV质粒，分别用限制性内切酶(例如BamHI/NotI)进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后经粘性末端连接，获得重组质粒pKOV-oppA ^S273G。

根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒pKOV-oppA ^S273G转化至宿主菌株，得到重组菌株。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3) 中，是将重组质粒转化至宿主菌株。本发明的第六方面，本发明还提供如第五方面的方法所获得的菌株。而且，上述方法均可用于构建如第四方面所述的重组菌株。

本发明进一步提供上述重组菌株在L-色氨酸制备中的应用，或者提供一种提高L-色氨酸发酵量的方法；或者提供一种生产L-色氨酸的方法。

根据本发明所述的重组菌株在L-色氨酸制备中的应用或方法，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-色氨酸。

有益效果

本发明通过对现有产L-色氨酸的大肠杆菌菌株中oppA基因编码序列引入点突变获得重组型菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-色氨酸。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

实施例1包含突变的oppA基因的转化载体pKOV-oppA ^S273G的构建

OPPA酶由oppA基因编码。在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如W3110等)中，野生型的oppA基因ORF序列如Genbank登录号为AP009048.1中第1302896-1304527位所示 (SEQID NO:1)。根据NCBI公布的大肠杆菌W3110的基因组序列，合成两对扩增oppA 基因编码区片段的引物，以通过等位基因置换在菌株E.coli 1-1703的背景中的oppA基因中引入点突变，使其第817位核苷酸由A突变为G，相应地其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:3 中第273位氨基酸由Ser突变为Gly(SEQ ID NO:4)。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P1:5'CG GGATCC TGTACCC GCAGGCGTCAC 3'(BamHI)(SEQ ID NO:5)；

P2:5'GGTGAAATCGACATGACGAATAACGGCATGCCGATCGAATTGTTCCAGAAGC 3'(SEQ IDNO:6)；

P3:5'GCTTCTGGAACAATTCGATCGGCATGCCGTTATTCGTCATGTCGATTTCACC 3' (SEQ IDNO:7)；

P4:5'AAGGAAAAAA GCGGCCGC CCACGGTTTCACCAGACG 3'(NotI)(SEQ ID NO:8)；

以工程宿主菌E.coli 1-1703基因组为模板，以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，获得长度分别为740bp和750bp的两条DNA片段(oppA Up和oppA Down片段)。PCR 体系：10×Ex Taq Buffer 5ul，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，MgCl₂(25mM)4ul，引物(10pm) 各2ul，Template 1ul，Ex Taq(5U/μl)0.25ul，总体积50ul，所述PCR扩增按如下方式进行： 94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、以及72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延伸10min。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增长约1490bp的片段(oppA ^S273G)。PCR体系：10×Ex TaqBuffer 5ul，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，MgCl₂(25mM)4ul，引物(10pm) 各2ul，Template1ul，Ex Taq(5U/μl)0.25ul，总体积50ul，所述PCR扩增按如下方式进行： 94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、以及72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延伸10min。将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的oppA ^S273G和pKOV质粒(购至Addgene公司)分别用BamHI/NotI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得载体pKOV-oppA S273G，并将载体pKOV-oppA^S273G送测序公司进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO:11所示，将含有正确点突变(A-G)的载体pKOV-oppA ^S273G保存备用。

实施例2包含点突变的oppA ^S273G的菌株的构建

将构建好的质粒pKOV-oppA ^S273G转入工程宿主菌E.coli 1-1703菌株中。具体过程为：在30℃、100rpm，复苏2h，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，30℃培养18h，挑选长出的单克隆菌体，接种于LB液体培养及中，37℃、200rpm培养8h后，涂布于氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基上，42℃培养12h。挑选1-5个单菌落接种于 1mL LB液体培养基，涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上，30℃培养24h，挑选单克隆，并分别划线于固体LB培养基和氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基。对于在固体 LB培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的固体LB培养基不能生长的菌株进行PCR 扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：

P5：5'CAGGTAACCTATTTGCCTATTG 3'(SEQ ID NO:9)

P6:5'CTGCGCTTTCACTTTATTAAC 3'(SEQ ID NO:10)

上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pKOV-oppA S273G扩增片段为阳性对照，野生型扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)。长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结构不同，电泳时迁移率也会有所差异，片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增阳性菌株的目的片段，并连接到PMD19-T载体，测序。通过测序结果序列比对，碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功。最终得到发生点突变的重组子，该菌株命名为YPT-W-412。

测序结果如SEQ ID NO:12所示。

实施例3色氨酸发酵实验

将构建菌株YPT-W-412接种在含有25mL种子培养基(配方见表1种子配方)的250mL带有挡板的三角瓶(corner-baffled flask)中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中培养8h。然后从中取出1mL种子培养液转接到含有24mL具有生产培养基(配方见表1发酵配方)的250mL带有角挡板的三角瓶中，放置于37℃、转速为220rpm的摇床中继续培养36h。当培养完成时，通过HPLC测定L-色氨酸的产生。以工程宿主菌E.coli 1-1703作为对照组，实验重复三次，结果如表2所示。

表1培养基配方

成分	种子配方g/L	发酵配方g/L
			葡萄糖	20	7.5
磷酸氢二钾	5.6	7.5
			七水硫酸镁	1.6	2
柠檬酸钠	1.6	-
			柠檬酸	-	2
酵母提取物	1.1	1
			硫酸铵	1.2	1.6
维生素B1	0.0013	0.0013
			生物素	0.003	0.0003
硫酸亚铁	0.028	0.075
			硫酸锰	0.012	0.0016
硫酸钠	-	0.05
			硫酸锌	-	0.003
氯化钴	-	0.0004
			硫酸铜	-	0.002

表2色氨酸发酵实验结果

结果如表2所示，原始工程宿主菌中色氨酸产量为11.4g/L，改造后的菌株YPT-W-412 在培养基中产生12.6g/L的L-色氨酸，与改造前的菌株相比，产量有所提高。因此，在大肠杆菌中对oppA ^S273G进行点突变，有助于L-色氨酸产量的提高。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> 一种oppA基因改造的产L-色氨酸重组菌株及其构建方法与应用

<130> CPCN19110593

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaccaaca tcaccaagag aagtttagta gcagctggcg ttctggctgc gctaatggca 60

gggaatgtcg cgctggcagc tgatgtaccc gcaggcgtca cactggcgga aaaacaaaca 120

ctggtacgta acaatggttc agaagttcag tcattagatc cgcacaaaat tgaaggtgtt 180

ccggagtcta atatcagccg agacctgttt gaaggcttac tggtcagcga tcttgacggt 240

catccagcac ctggcgtcgc tgaatcctgg gataataaag acgcgaaagt ctggaccttc 300

catttgcgta aagatgcgaa atggtctgat ggcacgccag tcacagcaca agactttgtg 360

tatagctggc aacgttctgt tgatccgaac actgcttctc cgtatgccag ttatctgcaa 420

tatgggcata tcgccggtat tgatgaaatt cttgaaggga aaaaaccgat taccgatctc 480

ggcgtgaaag ctattgatga tcacacatta gaagtcacct taagtgaacc cgttccgtac 540

ttctataaat tacttgttca cccatcaact tcaccggtgc caaaagccgc tatcgagaaa 600

ttcggcgaaa aatggaccca gcctggtaat atcgtcacca acggtgccta taccttaaaa 660

gattgggtcg taaacgaacg aatcgttctt gaacgcagcc cgacctactg gaacaacgcg 720

aaaaccgtta ttaaccaggt aacctatttg cctattgctt ctgaagttac cgatgtcaac 780

cgctaccgta gtggtgaaat cgacatgacg aataacagca tgccgatcga attgttccag 840

aagctgaaaa aagagatccc ggacgaagtt cacgttgatc catacctgtg cacttactat 900

tacgaaatta acaaccagaa accgccattc aacgatgtgc gtgtgcgtac cgcactgaaa 960

ctaggtatgg accgcgatat cattgttaat aaagtgaaag cgcagggcaa catgcccgcc 1020

tatggttaca ctccaccgta tactgatggc gcaaaattga ctcagccaga atggtttggc 1080

tggagccagg aaaaacgtaa cgaagaagcg aaaaaactgc tggctgaagc gggttatacc 1140

gcagacaaac cgttgaccat caacctgttg tataacacct ccgatctgca taaaaagctg 1200

gcgattgctg cctcttcatt gtggaagaaa aacattggtg taaacgtcaa actggttaac 1260

caggagtgga aaacgttcct cgacacccgt caccagggta cttttgatgt ggcccgtgca 1320

ggctggtgtg ctgactacaa cgaaccaact tccttcctga acaccatgct ttcgaacagc 1380

tcgatgaata ccgcgcatta taagagcccg gcctttgaca gcattatggc ggaaacgctg 1440

aaagtgactg acgaggcgca gcgcacagct ctgtacacta aagcagaaca acagctggat 1500

aaggattcgg ccattgttcc tgtttattac tacgtgaatg cgcgtctggt gaaaccgtgg 1560

gttggtggct ataccggcaa agatccgctg gataatacct atacccggaa tatgtacatt 1620

gtgaagcact aa 1632

<210> 2

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2