一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法

文档序号：1586824 发布日期：2020-02-04 浏览：46次 >En<

阅读说明：本技术 一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法 (Double-reporter gene probe for monitoring pre-mRNA splicing efficiency and preparation method thereof ) 是由王福郭镔郑海锋解锦荣陈思王希楠施潇蕊毛文杰于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法,所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C,所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组,所述的片段A为Fluc,所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成,所述的片段C为Rluc。所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。通过对本发明的报告基因分子影像探两种荧光素酶产生的信号比值Fluc/Rluc进行分析,实时、无创地分析在体pre-mRNA的剪接效率,为调控pre-mRNA剪接的药物研究提供了有效的筛选工具。(The invention discloses a double-reporter gene probe for monitoring the splicing efficiency of pre-mRNA and a preparation method thereof, wherein the probe comprises a vector pcDNA3.1 and a gene segment A, B, C, the gene segment A, B, C is recombined with a linearized pcDNA3.1 vector according to an A-B-C sequence, the segment A is Fluc, the segment B consists of exon 1, Intron and exon 2, and the segment C is Rluc. The nucleotide sequence of the probe is shown as SEQ ID NO. 5. By analyzing the signal ratio Fluc/Rluc generated by the two luciferases by the reporter gene molecule image probe, the splicing efficiency of in-vivo pre-mRNA is analyzed in real time and noninvasively, and an effective screening tool is provided for the research of medicines for regulating and controlling the splicing of the pre-mRNA.)

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种监测pre-mRNA的双报告基因影像探针及制备方法。

背景技术

Pre-mRNA剪接过程的化学本质包含两步转酯反应。该化学反应在细胞中难以自行发生，需要剪接体的参与完成。剪接体是指进行Pre-mRNA剪接时形成的多组分复合物，主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。它是在剪接过程的各个阶段随着SNRNA的加入而形成的。也就是说在完整的pre-mRNA上形成的一个剪接中间体。剪接体本身需要一些小核RNA参与。这些小核RNA不会翻译出任何蛋白，但对于调控遗传活动起到重要作用。因为许多人类疾病都可以归咎于基因的错误剪接或针对剪接体的调控错误。据知人类35％的遗传紊乱是由于基因突变导致单个基因的可变剪接引起的。还有一些疾病的起因是剪接体蛋白的突变影响了许多转录本的剪接。还有一些癌症也与剪接因子的错误调控有关。

现在研究者们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段，初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程，以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。但由于剪接体高度的动态性和复杂性，一直以来缺乏可靠的系统来检测剪接效率。因此本发明开发了一种双荧光素酶报告基因影像探针，实时监测pre-mRNA剪接效率，为研究pre-mRNA的剪接提供稳健、快速和方便的检测工具。

本发明运用分子影像手段，开发了基于双荧光素酶报告基因的显像系统定量分析pre-mRNA的剪接效率。为实时、快速、定量的研究剪接效率提供了检测工具。通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，无创、重复的提供活体实时、动态、可视化的分子剪接信息，同时进行定量研究，将其中的两种荧光信号进行分析，可实时评估剪接体在体内的剪接过程及剪接效能，检测体内基因表达情况。对剪接相关的基因进行成像，对于优化基因治疗方案和评估疗效起着关键作用。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，根据两种荧光素酶所产生的荧光强度，监测剪接过程的发生发展及剪接效率。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。

所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述的片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的另一方面，提供了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，包括以下步骤：

1)用KpnI和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；

2)PCR扩增A、B、C片段；

3)基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；

4)重组载体经转化、提取质粒、酶切鉴定，获得Dual-Luc报告基因探针。

所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。

步骤(2)中扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果为：

本发明构建了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，由于其能够很好地在生物体内表达，具有以下优点：

(1)为模拟活体剪接加工过程的动态变化提供了一种实时、无创的监测工具。

(2)克服了传统方法体外含量分析可能与体内实际作用出现偏差的不足。

(3)由于报告基因系统靶向性强、安全性好、高通量、价格相对低廉、操作方便等优点，为作用于剪接体的药物研究提供了有效的筛选工具，在新药研制、观测生物体内生理病理过程有着非常重要的价值。

附图说明

图1是本发明Dual-Luc报告基因探针的原理图；

图2是本发明分子探针的结构图；

图3是不同浓度Pladienolide B作用下报告基因活性检测；

图4是Pladienolide B作用后不同时间点报告基因活性检测；

图5是Dual-Luc报告基因系统在体活性检测。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1Dual-Luc报告基因探针的构建

1.1实验材料

1.1.1主要仪器

PCR扩增仪：北京东胜创新生物科技有限公司；Centrifuge 5415D台式离心机：Eppendorf；高速冷冻离心机：Beckman coulter；数显恒温水浴锅：江苏国华电器有限公司；THZ-92A台式恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；紫外分析仪：北京君意东方电泳设备公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备公司；Genosens 800凝胶成像系统：上海勤翔科技有限公司；超净工作台：上海一恒科技有限公司；恒温振荡培养箱：江苏太仓实验设备厂。

1.1.2酶和试剂

1.1.3实验所用溶液

LB培养基：10g Nacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物溶于1L双蒸水，高压灭菌。

琼脂糖凝胶制备：5.6g琼脂糖，置于500ml锥形瓶，加入1×TAE 480ml，加热完全溶解后再冷却50-60℃，倒入事先准备好的制胶板中。

TAE琼脂糖凝胶电泳液：50×TAE贮存液配置：242g Tris，57.1ml乙酸，37.2gNa₂EDTA.2H₂O溶于1L水，并调PH至8.0。

1×TAE：电泳时将50×TAE配置成1×工作液使用。

2×上样缓冲液：0.5mol/L(PH6.8)Tris-Hcl 2ml，甘油2ml，20％SDS(W/V)2ml，0.1％溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇1.0ml，双蒸水2.5ml，室温存放备用。

1.1.4实验所用菌株和载体

菌株：XL10-gold。

载体:pCDNA3.1(+)。

1.2实验过程

1.2.1实验方案设计及引物合成

根据全基因序列，合成引物进行PCR扩增。本实验中所使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司引物合成部合成。

1.2.3克隆

30ul，150ng/ul待切的载体，NheI/PstI各1ul酶，5ul Buffer，加水补齐至50ul体系，放入恒温培养培养箱2-3h后，回收所需的载体骨架备用。

将上述PCR扩增得到的基因全长PCR序列和载体各4ul，加同源重组酶重组1.4ul，同源重组酶Buffer 1.2ul，混匀，室温放置45min，立即转化挑取单克隆进行鉴定测序，测序结果如SEQ ID NO.5所示。

获得Reporter探针，报告基因结构如图2，其包含Fluc、Exon 1、Intron、Exon 2、Rluc。该分子探针的原理如图1所示，首先将Reporter转染到细胞内，然后在剪接体及多种蛋白的参与下进行剪切,正常切除后萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶都能正常表达。但是在剪接酶抑制剂的存在的条件下，Dual-Luc的剪接受到抑制，不能发生剪接，Dual-Luc表达出萤火虫荧光素酶后被Intron序列中的终止密码子TAG终止，不能表达出海参荧光素酶。荧光素酶催化底物形成两种荧光强度的比值能够反映剪接的发生发展进程及剪接效率。实时反映剪接进程中剪接过程的动态变化,克服了目前常用的检测手段的有创、操作繁琐、不能在体提供剪接完整动态变化的缺陷，为在体内监测剪接效率的发生发展提供了有效的监测工具。

实施例2一种用于监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因影像探针在体分子显像监测

1.1 Pladienolide B作用下Dual-Luc荧光活性检测

24孔板培养293细胞，待细胞汇集到80％时，使用Lipofectamine 2000，将1μg的Dual-Luc质粒DNA转染293细胞。24小时后分别加入DMSO、10nM、100nM、1000nMPladienolide B，12小时候后收集细胞，用100μl/孔细胞裂解液裂解细胞。取10μl裂解后的液体，加入10ul的底物使用Glomax-20/20Luminometer进行荧光强度测定。

1.2 Dual-Luc影像探针在体影像监测

培养4T1细胞，待细胞汇集到80％时，转染Dual-Luc质粒，24小时后收集细胞，确保每只小鼠注射量达到1×10⁸个，在小鼠(n＝3)右侧皮下接种细胞，同时腹腔注射Pladienolide B，分别在Pladienolide B作用0、12小时进行信号采集。

1.3结果验证

不同浓度Pladienolide B作用下报告基因活性检测如图3所示，Pladienolide B作用12小时后，与DMSO组比较，Pladienolide B作用后Rluc/Fluc的比值显著性降低，并且随着药物浓度增多，Rluc/Fluc的比值随着药物的增多而降低，不同药物浓度组Rluc/Fluc的比值具有显著性差异。即说明本发明构建的Dual-Luc探针能够响应外源化合物的作用，并且能够很好地区分由于药物剂量不同带来的荧光强度的差异。

不同时间点报告基因活性检测如图4所示，1000nM的Pladienolide B作用于Dual-Luc探针，不同时间点探针产生的荧光强度发生变化，12小时时达到最小比值，之后逐渐增强。即本发明构建的Dual-Luc报告基因系统能够动态的进行剪接发生发展进程的监测，提供实时动态的监测结果。

Dual-Luc报告基因系统在体活性检测如图5所示，为了监测Dual-Luc探针在体显像，在裸鼠右侧植入Dual-Luc报告基因转染的4T1细胞。药物作用不同时间后，对荧光信号区域的生物发光强度进行软件分析，探针的荧光强度随着时间的变化产生动态的变化。因此，结果表明，本发明的探针能够用于外源化合物刺激后在体内剪接效率的研究。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 西安电子科技大学

<120> 一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccgatg ctaagaacat taagaagggc cctgctccct tctaccctct ggaggatggc 60

accgctggcg agcagctgca caaggccatg aagaggtatg ccctggtgcc tggcaccatt 120

gccttcaccg atgcccacat tgaggtggac atcacctatg ccgagtactt cgagatgtct 180

gtgcgcctgg ccgaggccat gaagaggtac ggcctgaaca ccaaccaccg catcgtggtg 240

tgctctgaga actctctgca gttcttcatg ccagtgctgg gcgccctgtt catcggagtg 300

gccgtggccc ctgctaacga catttacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatt 360

tctcagccta ccgtggtgtt cgtgtctaag aagggcctgc agaagatcct gaacgtgcag 420

aagaagctgc ctatcatcca gaagatcatc atcatggact ctaagaccga ctaccagggc 480

ttccagagca tgtacacatt cgtgacatct catctgcctc ctggcttcaa cgagtacgac 540

ttcgtgccag agtctttcga cagggacaaa accattgccc tgatcatgaa cagctctggg 600

tctaccggcc tgcctaaggg cgtggccctg cctcatcgca ccgcctgtgt gcgcttctct 660

cacgcccgcg accctatttt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat tctgagcgtg 720

gtgccattcc accacggctt cggcatgttc accaccctgg gctacctgat ttgcggcttt 780

cgggtggtgc tgatgtaccg cttcgaggag gagctgttcc tgcgcagcct gcaagactac 840

aaaattcagt ctgccctgct ggtgccaacc ctgttcagct tcttcgctaa gagcaccctg 900

atcgacaagt acgacctgtc taacctgcac gagattgcct ctggcggcgc cccactgtct 960

aaggaggtgg gcgaagccgt ggccaagcgc tttcatctgc caggcatccg ccagggctac 1020

ggcctgaccg agacaaccag cgccattctg attaccccag agggcgacga caagcctggc 1080

gccgtgggca aggtggtgcc attcttcgag gccaaggtgg tggacctgga caccggcaag 1140

accctgggag tgaaccagcg cggcgagctg tgtgtgcgcg gccctatgat tatgtccggc 1200

tacgtgaata accctgaggc cacaaacgcc ctgatcgaca aggacggctg gctgcactct 1260

ggcgacattg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg cctgaagtct 1320

ctgatcaagt acaagggcta ccaggtggcc ccagccgagc tggagtctat cctgctgcag 1380

caccctaaca ttttcgacgc cggagtggcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440

cctgccgccg tcgtcgtgct ggaacacggc aagaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500

tatgtggcca gccaggtgac aaccgccaag aagctgcgcg gcggagtggt gttcgtggac 1560

gaggtgccca agggcctgac cggcaagctg gacgcccgca agatccgcga gatcctgatc 1620

aaggctaaga aaggcggcaa gatcgccgtg tat 1653

<210> 2

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggaagtac acgagaagct ccgaggatgg ctgaagtcca acgtctctga tgcggtggct 60

cagagcaccc gtatcattta tggaggtgag tggctttggt tcccggctga ggtggagtgg 120

gctgaggact agactgagcc ctcggacatg gaggtgggga tggggcagac tcatcccatt 180

cttgaccaag cccttgttct gctcccttcc caggctctgt gactggggca acctgcaagg 240

agctggccag c 251

<210> 3

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcttccaagg tgtacgaccc cgagcaacgc aaacgcatga tcactgggcc tcagtggtgg 60

gctcgctgca agcaaatgaa cgtgctggac tccttcatca actactatga ttccgagaag 120

cacgccgaga acgccgtgat ttttctgcat ggtaacgctg cctccagcta cctgtggagg 180

cacgtcgtgc ctcacatcga gcccgtggct agatgcatca tccctgatct gatcggaatg 240

ggtaagtccg gcaagagcgg gaatggctca tatcgcctcc tggatcacta caagtacctc 300

accgcttggt tcgagctgct gaaccttcca aagaaaatca tctttgtggg ccacgactgg 360

ggggcttgtc tggcctttca ctactcctac gagcaccaag acaagatcaa ggccatcgtc 420

catgctgaga gtgtcgtgga cgtgatcgag tcctgggacg agtggcctga catcgaggag 480

gatatcgccc tgatcaagag cgaagagggc gagaaaatgg tgcttgagaa taacttcttc 540

gtcgagacca tgctcccaag caagatcatg cggaaactgg agcctgagga gttcgctgcc 600

tacctggagc cattcaagga gaagggcgag gttagacggc ctaccctctc ctggcctcgc 660

gagatccctc tcgttaaggg aggcaagccc gacgtcgtcc agattgtccg caactacaac 720

gcctaccttc gggccagcga cgatctgcct aagatgttca tcgagtccga ccctgggttc 780

ttttccaacg ctattgtcga gggagctaag aagttcccta acaccgagtt cgtgaaggtg 840

aagggcctcc acttcagcca ggaggacgct ccagatgaaa tgggtaagta catcaagagc 900

ttcgtggagc gcgtgctgaa gaacgagcag taa 933

<210> 4

<211> 2837

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4