阅读说明：本技术 2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用 (Application of 2-deoxy-3-deoxyphosphogluconate aldolase in controlling yield of 1-deoxynojirimycin ) 是由 陈守文 蔡冬波 芦玉 冀志霞 马昕 陈建刚 李鑫 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程领域,具体涉及2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用,本发明通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组内的<I>kdgA</I>基因,成功得到了缺失<I>kdgA</I>基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12Δ<I>kdgA</I>。相对于解淀粉芽胞杆菌LX-12,本发明所构建得到的工程菌株LX-12ΔkdgA发酵后1-脱氧野尻霉素产量至少提高了21%,为提高1-脱氧野尻霉素产量提供了一种新的方法。(The invention belongs to the field of genetic engineering, and particularly relates to application of 2-deoxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase in controlling the yield of 1-deoxy nojirimycin kdgA Gene, successfully obtained deletion kdgA Resolution of genesBacillus amyloliquefaciens LX-12 delta kdgA . Compared with Bacillus amyloliquefaciens LX-12, the yield of the 1-deoxynojirimycin is improved by at least 21% after the constructed engineering strain LX-12 delta kdgA is fermented, and a novel method is provided for improving the yield of the 1-deoxynojirimycin.)

2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产 量中的应用

技术领域

本发明属于微生物遗传育种领域，具体涉及2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用，本发明通过敲除2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素产量，为解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素提供了一种策略。

背景技术

随着人们生产生活方式的改变和发展，糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的第三号杀手，对全球的健康和经济带来了重大的威胁，在亚洲尤其是中国地区这一问题尤为严重。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)一种多羟基哌啶类生物碱，具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为高效的糖苷酶抑制剂，在药物开发中受到广泛重视。在之前的研究中，1-脱氧野尻霉素大多从桑叶中提取，其成本高、不利于产业化生产，因此利用微生物合成1-脱氧野尻霉素已成为当今研究热点。然而，目前微生物合成1-脱氧野尻霉素的产量低，还不能满足市场的需求。

KdgA编码2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶，其在解淀粉芽胞杆菌中的调控网络和调控具体的基因还没有相关报道。本专利通过敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12中2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖醛酸醛缩酶基因kdgA，使其在解淀粉芽孢杆菌中不表达，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素的产量。本发明首次通过敲除2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖醛酸醛缩酶基因kdgA来提高1-脱氧野尻霉素产量，为1-脱氧野尻霉素高产提供一种新方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，包括利用本发明的常规技术，将解淀粉芽胞杆菌中编辑2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的kdgA基因敲除、突变或沉默，以降低或者失活其酶活力，敲除后的菌株提高解淀粉芽孢杆菌1-脱氧野尻霉素的发酵生产产量，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株。

以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌LX-12的保藏编号为CCTCCNO：M2015234。

以上所述的应用中，解淀粉芽胞杆菌基因kdgA的敲除方法，包括以下步骤：

(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12(CCTCC NO：M2015234)的基因组DNA为模板，PCR扩增出kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂；

(2)通过重叠延伸PCR将kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔkdgA；

(6)将敲除质粒T2(2)-ΔkdgA转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

(7)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到kdgA基因的上游同源臂或kdgA基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(8)挑选kdgA基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与kdgA基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12ΔkdgA；以上所述的应用中，优选的，在应用过程中以敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌工程菌株发酵生产1-脱氧野尻霉素时，其发酵培养基配方为：

60-100g/L豆粕；50-80g/L玉米淀粉；0.5-1.0g/L KH₂PO₄；0.3-0.6g/L MgSO₄·7H₂O；0.1-0.3g/LFeSO₄·7H₂O；0.01-0.05g/L MnSO₄·H₂O，其余为水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本发明构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的1-脱氧野尻霉素产量提高了20％以上。本发明的研究结果表明：敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA中的kdgA基因为提高1-脱氧野尻霉素产量提供了一种新的方法。

附图说明

图1为实施例1步骤(1)得到的kdgA基因上游同源臂和kdgA基因下游同源臂的琼脂糖凝胶图；

其中，泳道M为DNA marker，泳道1为kdgA基因的上游同源臂，泳道2为kdgA基因的下游同源臂。

图2为实施例1步骤(5)得到的敲除质粒T2(2)-ΔkdgA进行菌落PCR验证图；

其中，泳道M为DNA marker，泳道1为敲除质粒T2(2)-ΔkdgA进行菌落PCR验证的条带。

图3为实施例1步骤(8)得到的敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的验证条带。

其中，泳道M为DNA marker，泳道1为解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的验证条带，泳道2为解淀粉芽胞杆菌LX-12的对照条带。

其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明是以敲除解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12的kdgA基因为例，来证实2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的效果；其他本领域的常规方式，例如kdgA基因siRNA，kdgA基因RNAi慢病毒、kdgA基因突变的方式，只要能将2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的酶活丧失或者下降，都能提高解淀粉芽孢杆菌生产1-脱氧野尻霉素的能力。

上述解淀粉芽孢杆菌指得是野生型就能产1-脱氧野尻霉素的菌株。

实施例1：

kdgA基因缺失的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12ΔkdgA的获得：

所述的kdgA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出kdgA基因的上游同源臂(引物为kdgA-F1、kdgA-R1)和kdgA基因的下游同源臂(引物为kdgA-F2、kdgA-R2)，大小分别为658bp、622bp；

kdgA-F1：GGGAGCTC GCTGCATGCCGTTTCCCCCGATCT、

kdgA-R1：CCAGCGAAACGTGATATTCATGTCTCGCTCCTCCTTTAATCAAA、

kdgA-F2：TTTGATTAAAGGAGGAGCGAGACATGAATATCACGTTTCGCTGG、

kdgA-R2：GCTCTAGATGGCCATTTGAATGCCGTGTTC；

(2)以kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物kdgA-F1、下游同源臂引物kdgA-R2为引物，通过重叠延伸PCR将kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂连接到一起，得到目的基因片段1236bp；

(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)准备质粒T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)的酶切基因片段和步骤(4)的线性质粒片段经DNA连接酶(通常为T4DNA连接酶)进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1382bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子，命名为：敲除载体T2(2)-ΔkdgA；

(6)将敲除载体T2(2)-ΔkdgA转入解淀粉芽胞杆菌HX-12中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1382bp处出现电泳条带，证明敲除载体T2(2)-ΔkdgA成功转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中。此时，该转化子为阳性转化子(即转入了敲除载体T2(2)-ΔkdgA的解淀粉芽胞杆菌LX-12)；

其中，T2-F和T2-R的序列为:

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、

T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；

(7)将步骤(6)得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和ΔkdgA-KYR为引物(或以T2-R与ΔkdgA-KYF为引物)进行菌落PCR检测，若扩增出1486bp或2122bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，ΔkdgA-KYF和ΔkdgA-KYR的序列为:

ΔkdgA-KYF：GAACATGCTATGCCTGCCGGAAA、

ΔkdgA-KYR：ACGTAATACAGTTGGCGGGTGAAT；

(8)将步骤(7)得到的PCR检测出现1486bp条带的单交换菌株和步骤7)得到的PCR检测出现2122bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为ΔkdgA-KYF和ΔkdgA-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在2126bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子仍为原始菌株解淀粉芽胞杆菌LX-12；在1456bp处出现电泳条带时，说明LX-12的基因组上的kdgA基因被成功敲除，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的kdgA敲除菌株，即解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA。

实施例2：

kdgA基因缺失的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12ΔkdgA在1-脱氧野尻霉素发酵生产中的应用：

本实施例所用的发酵培养基如下：

表1发酵培养基配方

种子发酵的具体步骤为：先将解淀粉芽胞杆菌(解淀粉芽胞杆菌LX-12或解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA)活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL液体LB培养基的PA瓶中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将活化后的菌液以体积百分比按3％接种量接种于种子发酵培养基，并于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养液；(此处的种子发酵培养基的配方是LB培养基(配方：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，10g/L NaCl，pH 7.20))

生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入50mL的表1中的发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2.5％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养72小时，得到发酵后培养液。

采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述生产发酵的菌液中1-脱氧野尻霉素的产量进行测定。测定条件具体为：采用RP-HPLC-UV法测定，色谱柱为ZORBAX SB-C18(规格：5μm,4.6×150mm)，检测器为UVD 170U紫外检测器，检测波长254nm，流动相为乙腈-0.1％醋酸(11:16，V/V)，流速为1.0mL/min，进样量20μl。试验完毕先用流动相冲洗色谱柱30min除去杂质，再用乙腈冲洗30min，最后甲醇平衡30min保存。根据1-脱氧野尻霉素标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中1-脱氧野尻霉素的产量(见表2)。

表2

从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的解淀粉芽胞杆菌LX-12来说，采用本发明的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的生产发酵的菌液中1-脱氧野尻霉素效价有了大幅提升(提高20％以上)，说明：本发明的技术方案在提高解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素产量方面具有重大应用价值。

序列表

<110> 武汉骏安生物科技有限公司

<120> 2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgccta agtacgccat ttacgaaaaa cttctgcatg cacaagtggt ggctgtcata 60

aggggacaaa acagccaaga ggcgcttgaa gtttcaaaag cggccatttc aggaggtatc 120

agcgccattg agcttacata cacaactcct gaagtggaag atgtctttaa ggaactccgg 180

catcaagata ttcttcttgg agccggttct gtaatggata cagaaacggc gagacacgcc 240

attttatcag gtgcctcatt tatcgtcagc tctcattttg taaaagagat agcatctcta 300

tgcaaccagt acagcgtacc gtatcttccg ggatgcatga gcgtgtctga tatggctttg 360

gcgctcgaag ccggatgtga tgtggtaaag ctgttccccg ctaattcgtt tgacccttca 420

tttatcaagt cggtcaacgg tcctttgccg aatgtccgca ttatgccgac cgggggtatc 480

tcattaaaca gcatgaatga ctggctctct gccggagcgg tcgcggtcgg tgtgggaagc 540

gacttgacaa aagcttatca aaagggcggc tatgaagctg ccgtatccct cagcaaagaa 600

tacgtctgcc gaaaaaacga atatacgggg gtgtaa 636

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Pro Lys Tyr Ala Ile Tyr Glu Lys Leu Leu His Ala Gln Val

1 5 10 15

Val Ala Val Ile Arg Gly Gln Asn Ser Gln Glu Ala Leu Glu Val Ser

20 25 30

Lys Ala Ala Ile Ser Gly Gly Ile Ser Ala Ile Glu Leu Thr Tyr Thr

35 40 45

Thr Pro Glu Val Glu Asp Val Phe Lys Glu Leu Arg His Gln Asp Ile

50 55 60

Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val Met Asp Thr Glu Thr Ala Arg His Ala

65 70 75 80

Ile Leu Ser Gly Ala Ser Phe Ile Val Ser Ser His Phe Val Lys Glu

85 90 95

Ile Ala Ser Leu Cys Asn Gln Tyr Ser Val Pro Tyr Leu Pro Gly Cys

100 105 110

Met Ser Val Ser Asp Met Ala Leu Ala Leu Glu Ala Gly Cys Asp Val

115 120 125

Val Lys Leu Phe Pro Ala Asn Ser Phe Asp Pro Ser Phe Ile Lys Ser

130 135 140

Val Asn Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Ile Met Pro Thr Gly Gly Ile

145 150 155 160

Ser Leu Asn Ser Met Asn Asp Trp Leu Ser Ala Gly Ala Val Ala Val

165 170 175

Gly Val Gly Ser Asp Leu Thr Lys Ala Tyr Gln Lys Gly Gly Tyr Glu

180 185 190

Ala Ala Val Ser Leu Ser Lys Glu Tyr Val Cys Arg Lys Asn Glu Tyr

195 200 205

Thr Gly Val

210

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggagctcgc tgcatgccgt ttcccccgat ct 32

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagcgaaac gtgatattca tgtctcgctc ctcctttaat caaa 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttgattaaa ggaggagcga gacatgaata tcacgtttcg ctgg 44

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctagatg gccatttgaa tgccgtgttc 30

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaagcagca gattacgc 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaacatgcta tgcctgccgg aaa 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgtaataca gttggcgggt gaat 24