阅读说明：本技术 一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置及方法 (Point diffraction digital holographic microscopic device and method based on polarization grating ) 是由 郜鹏 温凯 郑娟娟 马英 刘立新 王宇 张美玲 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置及方法,包括激光器、光强控制单元、显微物镜、第一薄透镜、反射镜、光栅、第二薄透镜、针孔滤波器、偏振片和CMOS相机。本发明还公开了一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微方法。该点衍射数字全息显微装置和方法具有稳定性高、可实时振幅/相位成像等优点,可以被广泛应用于生物医学成像、工业检测等多个领域。(The invention discloses a point diffraction digital holographic microscopic device and a method based on a polarization grating. The invention also discloses a point diffraction digital holographic microscopy method based on the polarization grating. The point diffraction digital holographic microscopy device and the method have the advantages of high stability, real-time amplitude/phase imaging and the like, and can be widely applied to multiple fields of biomedical imaging, industrial detection and the like.)

一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置及方法

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体地说，涉及一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置及方法。

背景技术

自从17世纪光学显微镜出现以来，光学显微技术已经成为人们观测微观世界的重要手段。然而，传统的光学显微只能获取观察样品的强度信息，对于透明样品则是无能为力。为克服传统光学显微镜成像对比度较低的缺点，荧光显微技术，利用化学染料或荧光蛋白对细胞进行特异性标记，可实现对细胞特定结构或功能集团的高衬度、选择性成像。因此，人们越来越渴望能发明一种可在自然状态下观察细胞的成像技术。

相位成像，作为一种无标记的显微技术应运而生，该技术利用光波除振幅之外的另一重要特性——相位，不仅可以高衬度地观测透明样品，还可以定量获得物体三维形貌、内部结构与折射率分布等信息。然而，与传统强度成像不同，相位分布是肉眼看不见的，必须采用特殊的成像手段才能获得。夏克-哈特曼(Shack-Hartman)波前传感器，通过测量带有畸变波前经微透镜阵列后各个子焦点的偏移量，可以重构出经微透镜阵列前的波前分布。然而，该方法受到微透镜物理尺寸的限制，其空间分辨率很低，因此很少应用于显微领域。

1942年，泽尼克提出采用环状光源照明样品，同时采用一环状相位板延迟物光波零频分量的相位，从而将样品的相位信息转换为强度信息，实现了相衬显微。随后，Normarski提出了微分干涉相衬显微技术，该技术将物光被分成平行的两份，两份光在某方向上错开一定的距离从而发生干涉。干涉图样反应的是被测相位在剪切方向上的导数。这两种显微技术都提高了透明样品在显微镜下的图像衬度。然而，这两种技术中，图像的强度与样品的相位之间存在非线性的对应关系，从相衬图像中无法获得样品真实的相位分布。

单光束相位显微技术，通过施加一定的约束，使得样品的相位分布在衍射过程中转化为强度调制。通过一定的算法可以从衍射图样中恢复原先的相位信息。例如，基于光强传输方程(Transport of Intensity Equation,TIE)的相位测量技术，通过记录焦平面附近、具有不同离焦量的三幅强度图像，无需迭代运算即可定量获取被测光波的相位信息。该方法具有非干涉、结构简单、适用于部分相干照明、无需相位解包裹等优点。空域叠层成像(Psychography)技术，通过移动一聚焦光束照明样品的不同部位，并记录相应的衍射图像，利用迭代算法可从衍射图像中恢复样品的相位信息。傅里叶叠层显微成像(FourierPsychographic Microscopy,FPM)技术，将相位恢复与合成孔径相结合，通过记录不同角度下的低分辨图像，并利用迭代算法获得大视场和高分辨的振幅和相位图像。该方法不需要精密的机械扫描装置，但是仍需要拍摄大量的强度图像和繁杂的计算过程来再现相位，这制约了FPM在高速和实时成像方面的发展。总体上讲，基于光波衍射约束的单光束相位成像的精度远低于光学干涉的相位精度。

数字全息显微技术，将光学干涉和光学显微技术相结合，利用物光与参考光之间的干涉来恢复待测样品的振幅和相位信息。该技术具有很高的相位测量精度，例如，可以达到λ/100。然而，该方法需要使用相干性较好的光源来满足物光和参考光之间的相干条件，也因此带来了散斑噪声降低了成像质量。此外，该方法需要引入额外的参考光路，不仅使得光路比较复杂，而且使得实验对环境的振动十分敏感。因此，数字全息显微对实验环境提出了尤为苛刻的要求。Popescu提出了一种物参共路的离轴点衍射相位显微方法，实现了对生物细胞的实时定量测量。该方法利用一衍射光栅将物光分成两份，其中一份经过频谱面上的针孔滤波后变成参考光，另外一份仍被用作物光；利用物光和参考光之间的干涉图样可以再现出被测样品的振幅和相位信息。在该光路中，物光和参考光经历了完全相同的光学路径，因此克服了环境扰动对测量结果的影响。2010年我们提出了一种基于双光栅的同轴点衍射相位显微方法，通过第一个光栅实现分光，同时通过沿光栅矢量方向移动第二个光栅中可以实现相移。与传统的离轴点衍射相位显微方法相比，该方法采用同轴光路，提高了相位成像的空间分辨率。然而，需要说明的是：现有的点衍射相位显微技术，都是通过对物光波进行滤波形成参考光，因此参考光的光强与被测样品有关，无法保证所有样品的干涉图样都有高的条纹对比度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置及方法，可用于测量微小物体的三维形貌或折射率分布。该光路具有抗振动性好、可实时振幅/相位定量显微成像、结构简单等优点。

其技术方案如下：

一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置，包括激光器1、光强控制单元2、待测样品3、显微物镜4、第一薄透镜5、反射镜6、光栅7、第二薄透镜8、第一针孔滤波器9、偏振片10和CMOS相机11，待测样品3放在由显微物镜4和第一薄透镜5组成的望远镜系统的前焦面上，放大的实像将出现在该系统的后焦面上。光栅7放在样品的像面，并且被透镜8成像到CMOS相机11上。此时，光栅7和CMOS相机感光面满足成像关系：此处，f′为第二薄透镜8的焦距，l为光栅7到第二薄透镜8的距离，l′为CMOS接收面到第二薄透镜8的距离。第一针孔滤波器9放置在第二薄透镜8的后焦平面处，对-1级衍射光进行针孔滤波，形成不再含有物光信息的光束，作为参考光。

进一步，所述激光器1发出的激光为线偏振光，或偏振度大5：1的椭圆偏振光。

进一步，所述光强控制单元2，由一连续可调衰减器和一个1/4波片组成。当偏振片10的偏振方向与激光器1的偏振方向垂直时，通过旋转1/4波片可以调整物光和参考光的相对光强。

进一步，所述光栅7为偏振衍射光栅，将入射光向±1级衍射(其它衍射级光强较小，可以忽略)，其±1级衍射光的偏振态不同(例如：±1级分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光)，两者光强随着入射光的偏振变化而出现相反的变化趋势(一个增大，另一个则减小；反之亦然)。为了保证物光波高频分量不因衍射分光而丢失，光栅7的周期应小于2Mδ。这里M、δ分别为纤维物镜4和第一薄透镜5组成望远镜系统的放大率和空间分辨率。

进一步，第一针孔滤波器9由一个“大孔”和一个“小孔”组成，分别对±1级衍射光的频谱进行滤波。其中，“大孔”不改变+1级衍射光的频谱(被用作物光)，“小孔”对-1级衍射光进行低通滤波(仅保留零频分量)，形成不再含有物光信息的光束，作为参考光。

进一步，偏振片10，使得+1衍射光(物光)和-1级衍射光(参考光)具有相同的偏振方向，以便物光和参考光能发生干涉。

进一步，CMOS相机11用于接收+1衍射光(物光)和-1级衍射光(参考光)干涉产生的干涉图样。相机的像素大小应小于物光和参考光形成干涉条纹周期的1/3。

本发明所述基于偏振光栅的点衍射数字全息显微方法，包括以下步骤：

步骤1、打开激光器1和CMOS相机11，通过调节光强控制单元2中的连续衰减器使得CMOS相机11中光强达到接近饱和状态。

步骤2、放置待测样品3放置于显微物镜4的前焦面位置，通过轴向调节样品的轴向位置，使得CMOS相机11上出现样品清晰的像。

步骤3、微调第一针孔滤波器9中“小孔”的横向位置，使得参考光的光强均匀。调节光强控制单元2中的1/4波片，使得CMOS相机11中全息图样的条纹对比度达到最大值，此时物光和参考光的光强接近相同。

步骤4、利用CMOS相机11采集到样品的全息图样

步骤5、利用公式对用的方法对所记录的离轴数字全息图进行重构，恢复待测样品3的振幅和相位分布信息。

本发明的有益效果：

传统光学显微只能获取观察样品的强度信息，对于透明样品则是无能为力。数字全息显微仪(Digigal Holographic Microscopy,DHM)作为一种无标记的显微技术，可以在自然状态下对活体透明细胞提供高衬度相位成像。本发明提出了基于偏振光栅的点衍射数字全息显微方法。该方法不仅具有传统数字全息显微相位测量精度高的优点，而且还具有以下优点：首先，采用物参共路的光学结构，克服了环境振动对相位成像的影响(稳定性高)；其次，物参共路的结构使得该方法可采用低相干光源来抑制相干噪声；最后，该方法利用偏振衍射光栅的偏振特性，通过旋转一偏振片或四分之一波片来调节图像对比度，克服传统点衍射相位显微条纹对比度低的缺点。综上所述，该点衍射数字全息显微装置和方法具有稳定性高、可实时振幅/相位成像等优点，可以被广泛应用于生物医学成像、工业检测等多个领域。

附图说明

图1为物参共路径数字全息显微光路图；

图2为物参同路径数字全息显微光路图，

图3为偏振光栅对入射光的衍射分光；

图4为对-1衍射级的低通滤波；

图5为被测样品本身对参考光光强的影响。其中，放置样品前，物光(O,图A)和参考光(R,图B)的光强分布，放置样品(百合成熟花药)后，物光(O,图C)和参考光(R,图D)的光强分布；

图6为旋转1/4波片对物光和参考光光强的调节作用。(a)旋转1/4波片过程中物光和参考光平均光强变化曲线；(b)当1/4波片的主轴方向与水平方向分别为0°、30°、60°、90°时物光、参考光，以及干涉图样的强度分布；

图7百合花花药的成像结果；(a)记录的离轴数字全息图；(b)IR_D的频谱分布以及窗函数所选择的区域(虚线所示)；(c)和(d)再现的强度和相位分布；

图8小鼠的乳腺癌细胞的成像结果；(a)再现的振幅图像；(b)再现的相位图像

图9装置本身的稳定性测试。(a)未放置样品时装置本身的相位分布(rad)；(b)视场中一点(黑色方框所示)的相位随时间的变化曲线。(a)中的刻度尺：10μm；相位跃变轮廓线间距：1弧度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

参照图1，一种基于偏振光栅的点衍射数字全息显微装置，包括以下器件：

所用器件说明：

1.激光器1，波长在可见光范围，输出激光功率稳定，要求具有适当的相干长度。

2.光强控制单元2，由一连续可调衰减器和一个1/4波片组成。

3.第一薄透镜5，第二薄透镜8要求为消色差双胶合透镜。

4.第一针孔滤波器9，用于限制照明光的照明发散角。

5.显微物镜4，对样品进行扩束放大，实现显微成像。

6.光栅7，为偏振衍射光栅，可将入射光向±1级衍射，并且±1级的衍射光分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光。该光栅在±1级上具有很高的衍射效率。

7.第二针孔滤波器13。为了方便安装固定，可以在一块金属薄片加工出一小孔和一大孔。小孔即针孔滤波器，应具有合适直径(如25μm)用于对-1级衍射光进行低通滤波，应能保证滤波后的光束在CCD视场内光强近似均匀。为实现此目的可以参考：直径d≤1.22λf/D。其中，λ为照明光的波长，f为第二薄透镜8的焦距，D为第二薄透镜8前光束的直径。大孔用来使+1级衍射光频谱全部通过。

8.偏振片10，使得+1衍射光(物光)和-1级衍射光(参考光)具有相同的偏振方向，发生干涉。

9.CMOS相机11，普通黑白CMOS，具有合适灰度阶、像素尺寸和像素数量。

该发明所提出的光路如图1所示。激光器1发出的激光经过一个连续可调衰减器和1/4波片后，被用作照明光。待测样品3放在由显微物镜4和第一薄透镜5组成的望远镜系统的前焦面上，因此放大的实像将出现在该系统的后焦面上。偏振光栅7放置在该像面上，通过衍射将物光分为完全相同的两束沿±1衍射级方向传播的光波。如图3所示，±1衍射光分别为左旋圆偏振光和右旋圆偏振光，并且其±1衍射光的强度与入射光的偏振方向有关。光栅7以及样品的实像被第二透镜8成像到CMOS相机11面上。如图4所示，沿着±1衍射方向传播的两物光的频谱出现在第二透镜8的后焦平面上。其中，+1级衍射光经过第一针孔滤波器9上的大孔，其频谱不受影响，被用作物光。-1级衍射光被第一针孔滤波器9上的针孔滤波，变成球面光(不再带有物光信息)，被用作参考光。经过偏振片10后，物参光具有相同的偏振方向，并发生干涉。CMOS相机11放在光栅经第二透镜8成像的像面上接收物光和参考光的干涉图样。通过旋转四分之一波片可以调节物光和参考光的相对强度。综上所述：由于物光和参考光历经完全相同的光学元件，因此该装置对环境的振动影响较小。

原光路为线性走向，虽然结构简单但占空间较大。为了减小装置的体积，可以在原光路中加入反射镜6来折转光路，如图1所示。该折转光路还具有倒置显微镜的优点，如便于从下面观测培养皿中的贴壁细胞。此外，当激光器发出的光束较小时，可加入扩束准直系统对光束进行扩束。如图2所示，该扩束系统由薄第一透镜12和第二透镜14组成，并在第一透镜12的后焦面上放置一第二针孔滤波器13对光束进行低通滤波，用以提高照明光束质量。相比图1物参共路径数字全息显微光路图，额外添加了一扩束系统。该扩束系统包括第一透镜12、第二针孔滤波器13和第二透镜14。这里第二针孔滤波器13是为了限制照明光的照明发散角，以进一步提高光束质量。

本发明的原理如下：

激光器1发出的光波为沿着水平方向偏振的线偏振光，记为当该入射光经过主轴方向与水平方向成θ角度的四分之一波片(2)后，其偏振态可表示：

该照明光经过样品后，形成物光波，该物光波被显微放大系统(4-5)成像到偏振光栅7上。该偏振光栅通过衍射将物光波分成多份，分别沿着不同级衍射光方向传播。其中，±1级衍射光的光强占比均大于40％，分别被用作物光和参考光(通过对-1衍射光进行频谱滤波形成)。除±1级衍射光外的其它衍射级在第二薄透镜8的焦平面上都被遮挡。此外，该偏振光栅具有优异的偏振衍射特性：±1级衍射光具有不同的偏振态，两者的相对光强与入射光的偏振态有关。我们利用琼斯矩阵在理论上对该偏振衍射特性进行分析，该偏振光栅的复透过率可表示为：

这里，τ_o和τ_e分别表示o光和e光的透过率，Δn_o和Δn_e分别表示光栅对o光和e光的折射率；d(x,y)表示光栅厚度分布；分别表示偏振光栅对o光和e的空间相位调制函数。这里k₀＝2π/λ,Ψ_e(x,y)表示随空间变化的各向异性的主轴方向。我们可以将的各个偏振分量展开为傅里叶级数：这里，i和j的取值为1和2，l为表示衍射级的整数，K＝2π/Λ为光栅矢量,Λ为光栅周期。那么，沿着光栅+1级传播的光波的传递矩阵可表示为：

沿着光栅-1级传播的传递矩阵可表示为：

当入射光束A穿过样品(形成物光O(x,y))并被这一光栅所衍射时，±1级衍射光可以分别表示为：

这里忽略了常数项A_O表示照明光A经过样品后的复振幅分布。经过光栅衍射后沿着+1级方向传播(被用作物光)，-1级衍射光D_-1被针孔滤波后形成复振幅变为A_R的参考光，其偏振方向未发生变化。当物光和参考光经过偏振片10后变成偏振方向相同的线偏振光，两者在CCD面上发生干涉。具体而言，当偏振片(10)的偏振方向与x轴成45°时，其透过率函数可写为：

物光和参考光经过偏振片(10)后的复振幅可表示为：

对于我们所选用的偏振光栅而言，在此情况下，(7)式可写为：

从(8)式可以看出，和的相对光强与入射光的偏振态(由1/4波片的主轴方向决定)有关。从图6可以看出，和的相对光强随着θ的变化规律呈现相反趋势(增大时，减小)，符合(8)式中预言的cos²θ和sin²θ强度关系。

在CCD面上，和发生干涉，其强度分布可表示为：

K表示CCD面上干涉条纹的载频量，表示物光和参考光之间的相位差。

采用传统的离轴数字全息再现方法，可以再现出物光的复振幅

这里，d₀表示离焦距离，即CCD到样品像面的距离；R_D＝exp(-iKx)为数字参考光，可以通过测量条纹的载频量K′来确定。ΙR_D主要用于补偿物光与参考光之间夹角引起的频谱移动。FT{·}和IFT{·}分别表示傅里叶变换和逆傅里叶变换。(ξ,η)表示频率域内的坐标。为窗函数，在所选择的区域内取值为1，其它区域取值为0，用于选择物光实像的频谱分布。利用再现的复振幅O_r(x,y,d₀)和关系可以得到样品的振幅像|O_r(x,y)|和相位像最后，通过还可以计算出被测样品的三维形貌d(x,y)和折射率分布

如前所述，传统点衍射相位显微技术通过对物光波进行滤波形成参考光，因此参考光的光强与具体被测样品有关。为了验证这一点，在图5中，我们对放置样品前后和对沿着±1衍射方向传播的物光和参考光光强分别进行了测量。图5中第一排展示了放置样品前，物光(O,左图)和参考光(R,右图)的光强分布。图5中第二排展示了放置样品(百合成熟花药)后，物光(O,左图)和参考光(R,右图)的光强分布。比较上下两排图像可知：当样品空间结构比较复杂时，(通过针孔滤波产生的)参考光的光强比较小。这是因为：当样品结构比较复杂时，物光的能量大都分布在高频分量，对参考光的光强没有贡献。

同时，从(8)式中可以看出：通过旋转四分之一波片的主轴方向，可以调节物光和参考光之间的相对光强，来优化干涉图样的对比度。为了验证这一点，在实验中我们将1/4波片的主轴方向旋转至不同角度(相对于水平方向)，并且将偏振片10旋转至竖直方向，测量了物光、参考光以及干涉图样的在不同情况下的强度分布，如图6所示，从而得到优化干涉图样条纹对比度的效果。当入射光方向为水平方向(并且偏振片10的偏振方向沿水平方向)时，通过旋转1/4波片的主轴方向，可以将O和R的光强比从1：6调节到6：1。因此，通过调节1/4波片使得物光和参考光的光强相同(如1/4波片位于30°时)，此时干涉图样的对比度达到最大值。

实施例

实验中，激光器1为LQB晶体固体激光器(λ＝532nm,1875M-532-(10-50)-5V,镭蓝激光,武汉,中国)，出射光斑直径：4mm；波长范围：532nm±5nm(半高全宽10nm)；线偏振且偏振方向为水平方向；价格：150RMB。显微物镜4的放大倍率为20X，数值孔径NA＝0.4(平场物镜,20×LWD,南京英星,南京,中国)。第一薄透镜5焦距f₁＝150mm(AC254-150-A,ThorlabsInc.,USA)；第二薄透镜8的焦距为f₂＝50mm(GCL-010652,大恒光电,北京,中国)。针孔滤波器的针孔直径为50μm(GC0-01020,大恒光电,北京,中国)；光栅7的周期Λ＝6.3μm(#12-677,爱特蒙特光学,深圳,中国)。因为(1/Λ＝1/6.3＝0.16μm^-1)＞(2ν_max＝2/(0.61λ/NΑ)/M＝0.12μm^-1，M为物镜放大倍率)，所以该装置可以在保留物镜最大分辨率的前提下分开不同衍射光的频谱，以便独立地对+1级衍射光进行滤波。CMOS相机11(3000×4000pixels,pixel size 1.85μm,DMK 23U274,The Imaging Source Asia Co.,Ltd.,China)成像系统总的放大倍率为82.2X。

在第一个实验中，我们以百合成熟花药(Lily mature anther，LIOO光学，北京京昊永成商贸有限公司，北京)作为被测样品,得到样品的离轴全息图I(x,y)，如图7(a)所示。通过对IR_D(x,y)进行傅里叶变换，所得到的频谱分布如图7(b)所示。利用窗函数选择图7(b)中虚线包围的频谱并进行逆变换，可以得到该样品对应的强度图像(图7(c))和相位图像(图7(d))。对比图7(c)和7(d)，我们不难发现对于该透明样品，相位图像比强度图像更能展现样品的细节结构，例如，在相位图像中我们可以看到花药纤维层细胞的细胞壁结构。需要说明的是，这里在再现过程中未进行数字再调焦，即利用公式(10)中离焦距离为d＝0mm。事实上，在成像时如被测样品出现离焦，还可以通过在再现过程中改变d的值，实现对样品进行数字再调焦。

在第二个实验中，利用本发明所述装置对小鼠的乳腺癌细胞进行了振幅和相位成像。图8(a)和8(b)分别为该样品对应的振幅图像和相位图像。比较两图可知，在可见光照明下，活体细胞的强度图像对比度很低，不易对细胞进行观测。通过相位成像不仅可以清晰地看到细胞的轮廓，而且还可以定量获得细胞对应的光程差分布。

为了进一步研究该光路的稳定性，我们进行了长达180min的空载测量(未加样品)，每隔20秒记录一次。然后，对这540幅离轴全息图分别进行相位再现，从而确定装置对应的相位分布(如图9(a)所示)随时间的浮动情况。首先，我们跟踪了CCD视场内某一点(大小对应一个像素)的相位变化，如图9(b)所示。定量统计结果表明：该点在180min内相位围绕平均值的均方差为0.075rad，对应于0.012λ，说明了该装置具有长时间的稳定性。

本发明利用偏振光栅对物光波进行衍射分束，其±1级衍射光分别具有大于40％的衍射效率，可分别作为物光和参考光，具有较高的光强利用率。对偏振光栅的-1级衍射光进行针孔滤波，产生不带有物光信息的参考光，通过记录物光和参考光之间的干涉图样，可以再现被测样品的振幅和相位信息。由于物光和参考光经历完全相同的光学器件，因此该测量方法具有不受环境扰动的优点。偏振光栅的±1级衍射光具有不同的偏振特性，通过旋转四分之一波片或偏振片可以调节±1级衍射光的强度，从而调节干涉图样的对比度。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。