具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案进行详细的描述，以使本领域技术人员能够更加清楚的理解本发明，但并不因此限制本发明的保护范围。

本发明提出一种空心光束显微成像系统，整体包括：光源调节单元、空心光束调制单元和暗场成像单元。

具体的所述光源调节单元包括激光器1、线偏振片17和第三半波片16，用于提供激光束输出，所述激光器1输出的激光束为高斯激光束，通过线偏振片17后转换为线偏振光，在通过第三半波片16进行偏振方向旋转调节。

优选的所述激光器1为连续可调谐的环形钛宝石激光器，输出波长调谐范围为740nm-850nnm，功率优选为600mw。所述激光器产生的激光束的波长处于非线性相位调制单元的吸收波长处。

所述第三半波片16设置于线偏振片17的后方，半波片属于本领域熟知的光学元件，可以对线偏振光进行旋转。 线偏振光垂直入射到半波片，透射光仍为线偏振光，假如入射时振动面和晶体主截面之间的夹角为θ，则透射出来的线偏振光的振动面从原来的方位转过2θ角。在本光路中通过旋转第三半波片17来改变激光器输出激光束经第一偏振分光立方体2后水平偏振态和竖直偏振态的分束比例，如下所述，偏振分光立方体透射一种偏振态（如水平偏振态）的光束，反射另一种偏振态（如竖直偏振态）的光束，通过旋转半波片能够改变入射到偏振分光立方体上的线偏振激光束的偏振方向，进而改变该入射线偏振光经偏振分光立方体分出的两束偏振态相互垂直的偏振光的分束比例，具体到本光路，通过旋转第三半波片16调节被线偏振片转换后的线偏振激光束的偏振方向，进而能够对该线偏振激光束经第一偏振分光立方体2分出的水平偏振态的非线性基础激光束和竖直偏振态的非线性调制激光束的分束功率比例进行调节，达到同时改变非线性基础激光束和非线性调制激光束强度的目的。

所述空心光束调制单元用于产生尺寸可控的空心光束，包括非线性基础激光光路单元、非线性调制激光光路单元和非线性相位调制单元，结合附图1所示，所述空心光束调制单元具体包括第一偏振分光立方体2、聚焦透镜3、第一半波片4、第二偏振分光立方体5、非线性相位调制单元6、第一反射镜9、第二半波片8、第二反射镜10和第三偏振分光立方体7。其中所述第一偏振分光立方体2、聚焦透镜3、第一半波片4、第二偏振分光立方体5组成非线性基础激光光路单元，所述第一偏振分光立方体2、第一反射镜9、第二半波片8、第二反射镜10和第三偏振分光立方体7组成非线性调制激光光路单元，所述非线性相位调制单元6采用装有乙醇的比色皿，乙醇为无水乙醇，作为与激光束进行非线性作用的光学介质。来自非线性基础激光光路单元的非线性基础激光束和来自非线性调制激光光路单元的非线性调制激光束共线反向入射至比色皿的无水乙醇中，并在其中发生基于非线性相位调制的非线性作用而产生尺寸可控的空心光束，所产生的空心光束由第二偏振分光立方体5反射输出至暗场成像单元。

所述光源调节单元的激光器1分别与所述非线性基础激光光路单元和非线性调制激光光路单元耦合产生共线反向传输的非线性基础激光束和非线性调制激光束，并入射至非线性相位调制单元中，具体的所述激光器1、线偏振片17、第三半波片16、第一偏振分光立方体2、聚焦透镜3、第一半波片4、第二偏振分光立方体5和非线性相位调制单元6依次设置于同一直线光路上，所述第一偏振分光立方体2、第一反射镜9、第二半波片8、第二反射镜10和第三偏振分光立方体7依次设置于同一U形光路上，其中各光学元件的光学特性和光路设置位置如下：

所述第一偏振分光立方体2设置于第三半波片16的正后方，其光学特性为：基于光束偏振态的不同进行光束分光，具体的所述第一偏振分光立方体2透射水平偏振方向的光束，并反射竖直偏振方向的光束，通过第一偏振分光立方体2将经第三半波片后输出的激光束中的水平偏振分量以偏振分光方式耦合到非线性基础激光光路单元中，将激光束中的竖直偏振分量以偏振分光方式耦合到非线性调制激光光路单元中，具体经第三半波片输出的激光束入射到第一偏振分光立方体2后，透过第一偏振分光立方体2的激光束具有水平偏振态，该水平偏振态激光束作为非线性基础激光束；输出激光束入射到第一偏振分光立方体2后被第一偏振分光立方体2垂直反射的激光束具有竖直偏振态，该竖直偏振态激光束作为非线性调制激光束。

所述聚焦透镜3设置于第一偏振分光立方体2的透射分光输出端的正后方，并将来自第一偏振分光立方体2的非线性基础激光束聚焦至装有乙醇溶液的比色皿中；优选的所述聚焦透镜3的焦距为200mm。

所述第一半波片4设置于所述聚焦透镜3的正后方，通过旋转第一半波片4能够调整第一偏振分光立方体2透射输出的非线性基础激光束的线偏振方向，使其偏振方向偏离水平方向，进而使得该非线性基础激光束经第二偏振分光立方体5再次分出的水平偏振方向的光束强度（功率）得到调节（减小），因此通过旋转调节第一半波片4并结合第二偏振分光立方体5能够单独对入射到叉相位调制单元6中的非线性基础激光束的功率进行调节。

所述第二偏振分光立方体5设置于第一半波片4的正后方，光学特性为基于光束偏振态的不同进行光束分光，具体的所述第二偏振分光立方体2透射水平偏振态的光束，并反射竖直偏振态的光束。在光路中的作用是使具有水平偏振分量的非线性基础激光束透射输出至叉相位调制单元6中，并能够与第一半波片4协同作用调节入射到叉相位调制单元6中的非线性基础激光束功率，同时所述第二偏振分光立方体5能够使基于非线性相位调制产生的具有竖直偏振态的空心光束反射输出至暗场成像单元中。

所述第一反射镜9为直角反射镜，面向第一偏振分光立方体2的反射分光输出端设置，并对第一偏振分光立方体2输出的竖直偏振光提供90°的反射。

所述第二反射镜10为直角反射镜，所述第二反射镜10的反射面与第一反射镜9的反射面相互垂直，来自第一反射镜9的反射光束入射至第二反射镜10的反射面，并经第二反射镜的反射面垂直反射（90°反射）至第三偏振分光立方体7。

所述第二半波片8设置于第一反射镜9和第二反射镜10之间，其作用于第一半波片作用类似，通过旋转第二半波片8能够调整第一偏振分光立方体2反射输出的非线性调制激光束的线偏振方向，使其偏振方向偏离竖直方向，进而使得该非线性调制激光束经第三偏振分光立方体7再次分出的竖直偏振方向的光束强度（功率）得到调节（减小），因此通过旋转调节第二半波片8并结合第三偏振分光立方体7能够单独对入射到叉相位调制单元6中的非线性调制激光束的功率进行调节。

所述第三偏振分光立方体7的光束输入端正对第二反射镜10的反射输出端，且所述第三偏振分光立方体7的反射输出端正对所述第二偏振分光立方体5的透射输出端，所述第三偏振分光立方体7的光学特性为基于光束偏振态的不同进行光束分光，具体的所述第三偏振分光立方体7透射水平偏振态的光束，并垂直反射竖直偏振态的光束。所述第三偏振分光立方体7在光路中的作用是将第二反射镜10反射输出的竖直偏振的非线性调制激光束向着第二偏振分光立方体5的透射输出端反射输出，从而经由第三偏振分光立方体7反射输出的竖直偏振非线性调制激光束与第二偏振分光立方体5透射输出的水平偏振非线性基础激光束达到共线反向传输，并以共线反向方式共同入射到非线性相位调制单元6中；同时所述第三偏振分光立方体7对来自第二偏振分光立方体5的水平偏振非线性基础激光束提供透射输出，优选的可在透射输出端设置光线收集器。

所述非线性相位调制单元6采用装有非线性介质（优选为无水乙醇（纯度>99%））的比色皿，并设置于第二偏振分光立方体5的透射输出端和第三偏振分光立方体7的反射输出端之间，经第二偏振分光立方体5透射输出的具有水平偏振态的非线性基础激光束和经第三偏振分光立方体7反射输出的具有竖直偏振态的非线性调制激光束共同入射至装有乙醇的比色皿中，且非线性基础激光束和非线性调制激光束在装有乙醇的比色皿中反向共线传输。非线性基础激光束和非线性调制激光束在无水乙醇中发生交叉相位非线性调制作用：交叉相位非线性调制是指当两个甚至多个相同或不同频率的光场同时作用于非线性介质时，其中一种较强光场将会引起非线性介质折射率的分布发生变化，进而使得其他光场的光束在通过该非线性介质时会发生非线性相移，以达到利用较强光场对其他光场的非线性相位调制目的。具体对本发明而言，当较强的非线性基础激光束作用于非线性介质乙醇时引起乙醇折射率分布发生改变，使得非线性调制激光束在入射到乙醇溶液出射端面处的相位分布发生改变（相移），最终使得携带了非线性相移的非线性调制激光束的远场出射光强重新分布，得到由中心暗斑和同心圆组成的空心光束，对应于中心暗斑相当于代替了现有技术中的挡光板，保证了可以实现暗场成像，而且通过调节非线性基础激光束的强度能够调节乙醇折射率分布的改变程度，进而达到对非线性调制激光束相移程度的调控，最终反映在对产生的空心光束尺寸的调控，同时利用非线性基础激光束和非线性调制激光束共线反向传输使得非线性基础激光束经非线性相移而产生的空心光束同样沿与非线性基础激光束相反的方向传输，很好的实现了与非线性基础激光束的分离输出。

下面具体给出非线性基础激光束和非线性调制激光束在乙醇溶液中发生的非线性非线性相位调制的原理过程。理论上，当激光束通过非线性介质时（这里为乙醇），非线性介质会吸收激光的能量，导致介质的局部加热升温，产生温度梯度，从而导致热扩散。紧接着因为光波在介质中传播从而导致介质的密度分布发生变化，最终改变了折射率。

在稳态条件下，热致非线性折射系数n₂由如下公式表示：

n₂= （1）；

其中为给定介质的折射率对温度的依赖关系，为吸收系数，为给定介质的热传导系数，为光束的半径。

考虑到热致非线性过程，介质的折射率对光强的依赖特性如下公式表示：

n=n₀+n₂I，I=I₁+I₂ （2）。

其中n为总折射率，n₀为线性折射率，I为总光强，I₁为基础激光光强，I₂为调制激光光强。

因为相比于基础激光，调制激光的功率很弱，所以可以忽略非线性调制激光束对整个过程的影响，所以可以得到：n=n₀+n₂I₁ （3）。

此时，当非线性调制激光束经过非线性介质乙醇时，在介质的出射面会产生附加相移。假设调制光传输方向为正方向即z轴，介质的右端面为坐标原点。介质出射端面处，因为非线性折射率导致的附加相移由如下公式表示：

（4）。

其中I₁(r,z)为基础光的光强分布，I₁₀为基础光的中心光强，k₀为波矢，为基础光不同位置处的光斑半径，为基础光的束腰半径，r为径向坐标，l为样品池的有效长度。

因此，透过非线性介质的调制光的光电场复振幅E₂(r,z)可表示为：

（5）

其中E20为入射调制光的光电场的复振幅，R(z)为对应位置的波前曲率半径。

因为在基础光对调制光相移调制的过程中，起作用的主要是基础光的焦点处，所以公式4可近似为,其中。

基于上述原理可知产生空心光束的现象是由于热致非线性效应导致的非线性相位调制。基础光激光通过非线性介质时，导致介质的折射率发生变化，当调制光经过非线性介质时，在介质的出射面会产生负的横向附加相移。因为携带附加相移，调制光在远场便会将原来入射时的高斯光束分布转化为空心光束。同时上述折射率及相移分布公式中均与基础光束强度相关，进而能够通过调节非线性基础激光束强度实现对非线性调制激光束产生的空心光束尺寸的调节。

所述的暗场成像单元包括扩束镜11、非球面透镜12、载物台13、载玻片14和显微物镜15，其中所述扩束镜11正对所述第二偏振分光立方体5的反射输出端设置，非线性基础激光束和非线性调制激光束在比色皿中通过非线性相位调制产生的具有竖直偏振态的空心光束被第二偏振分光立方体5反射后输出至扩束镜11，在所述扩束镜11的正后方设置有非球面透镜12。通过所述扩束镜11和非球面透镜12来调节空心光束的出射发散角，使空心光束的出射发散角大于所选用显微物镜15的孔径角，确保暗场成像。具体的调节空心光束出射发散角的方法是：根据显微物镜15的孔径角选择好扩束镜11的扩束比例和非球面透镜12的焦距，将产生的空心光束依次通过所述扩束镜11和非球面透镜12，调整非球面透镜12的位置使得非球面透镜12输出的空心光束的出射发散角大于显微物镜15的孔径角，优选的通过扩束镜后，空心光束的半径约为2~3cm。所述载玻片14设置于所述非球面透镜12的光束输出端后方，所述载玻片14设置于所述载物台13，待成像样品设置于载玻片14上，且待成像样品在载玻片14上位于非球面透镜12输出光束的焦点附近，这样经非球面透镜12聚焦于载玻片表面的空心光束在经过样品后发散输出。所述显微物镜15的光束输入端正对载玻片上的样品设置，且显微物镜15相对于载玻片的输入孔径角小于经载玻片后空心光束的出射发散角，这样空心光束的中心暗场起到了相当于现有透射式照明中挡光板的作用，但是却避免了挡光板对照明光强的削弱作用，同时空心光束较大的出射发散角保证了进入显微物镜的有效光束为样品颗粒散射光束，进而提高了暗场成像质量。此外利用非球面透镜将空心光束聚焦在样品的表面，且针对不同厚度的样品，可以通过调节基础光强度来调节空心光束的大小，进而对样品的不同深度处进行快速的聚焦，实现了对样品的快速对焦暗场成像。

本发明进一步提出一种基于空心光束显微成像系统进行的空心光束显微成像方法，包括以下步骤：

步骤一、从光源调节单元输出的线偏振高斯激光束透过第一偏振分光立方体2获得一束水平偏振的非线性基础激光束，所述非线性基础激光束依次通过聚焦透镜3和第一半波片4后入射到第二偏振分光立方体5，透过所述第二偏振分光立方体5的非线性基础激光束聚焦于装有无水乙醇的比色皿中；

步骤二、从光源调节单元输出的激光束经由第一偏振分光立方体2反射后获得一束竖直偏振的非线性调制激光束，该非线性调制激光束经第一反射镜9和第二反射镜10反射后入射到第三偏振分光立方体7，期间经过第二半波片8，非线性调制激光束经第二偏振分光立方体7垂直反射后入射到装有无水乙醇的比色皿，通过调试非线性调制激光束和非线性基础激光束的光路使得入射到所述比色皿的非线性调制激光束与非线性基础激光束的传播方向相反且为共线传播；非线性基础激光束作用于比色皿中无水乙醇并基于非线性效应改变无水乙醇的折射率分布，进而非线性调制激光束在穿过折射率分布发生改变的无水乙醇后，非线性调制激光束在乙醇出射端面处的相位分布发生相应改变，最终使得比色皿出射的非线性调制激光束的远场光强重新分布，得到由中心暗斑和同心圆组成的空心光束，所产生的该空心光束具有竖直偏振态并沿着非线性调制激光束的传输方向入射到第二偏振分光立方体5，经第二偏振分光立方体5反射后进入扩束镜11，空心光束依次通过扩束镜11和非球面透镜12后进入显微物镜；

步骤三、旋转第三半波片16调节激光器1输出的激光束经由第一偏振分光立方体2反射的非线性调制激光束和透过第一偏振分光立方体3的非线性基础激光束的分束比例，将所述非线性调制激光束和非线性基础激光束的分束比例调节到预定值；

步骤四、通过旋转第一半波片4动态调整非线性基础激光束入射到比色皿内无水乙醇中的功率强度，并通过旋转第二半波片8将非线性调制激光束入射到比色皿内无水乙醇中的功率强度调节到合适值（固定），直至显微物镜上观察到明显的空心光束。

步骤五、进一步的调整非球面透镜12的位置使非球面透镜出射光线的发散角大于显微物镜15的孔径角，当在显微物镜中看到只有一个亮点的暗背景，即可确定此时发散角已经大于孔径角。

步骤五、然后将样品放置在非球面透镜的焦点附近的载玻片14上，用显微物镜15观察样品。

步骤六、确定非球面透镜12、载物台13和显微物镜15的位置之后，通过调节各半波片的角度来调节空心光束尺寸，最终实现对样品的快速对焦（由前述公式3可知，非线性折射率随基础光强的增加而增加，由公式4可知，基础光功率增加时，非线性附加相移也会增加，对应空心光束的中间暗斑的尺寸也会相应增加。因此通过旋转半波片调节非线性基础激光束的功率能够对非线性调制激光束经非线性作用产生的空心光束的尺寸进行调节，而空心光束尺寸的改变会使得聚焦到样品上的光通量发生变化，进而实现样品池中不同位置的样品成像，达到不用移动样品池，即可进行不同位置处的样品成像，实现了暗场成像下的快速对焦。

综上本发明提出一种全新的空心光束显微成像系统和成像方法，首创的基于非线性相位调制技术实现快速对焦暗场成像，通过非线性基础激光束改变非线性介质的折射率，进而使得非线性调制激光束在通过折射率改变的非线性介质后产生空心光束，以此来代替现有透射式照明中的挡光板，同时不会对暗场光强造成影响，同时基于非线性介质的交叉相位调试使得可以通过改变基础光强度来改变空心光束的尺寸，进而实现对样品的快速对焦，同时创新的组合使用空心光束、扩束镜和非球面透镜作为聚光装置，使得显微成像系统的光透过率很高，并且非球面透镜的发散角较大，有利于物镜对样品散射进行高质量光成像，因此本发明所述的空心光束显微成像系统属于对现有显微成像系统的重大突破，具有广阔的市场推广应用前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施方案，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施方案所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。