阅读说明：本技术 抗人IgG4单克隆抗体及利用该抗体的人IgG4测定试剂 (Anti-human IgG4 monoclonal antibody and human IgG4 measurement reagent using same ) 是由 照内友也 松木友里 稻垣量光 佐佐木大介 柏仓春香 于 2018-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供表位存在于SEQ ID NO:4所示的人IgG4的CH3的,针对人IgG4的单克隆抗体、产生其的杂交瘤、使用该单克隆抗体的IgG4的检测方法及在其中使用的试剂盒。(The present invention provides a monoclonal antibody against human IgG4 having an epitope present in CH3 of human IgG4 shown in SEQ ID NO. 4, a hybridoma producing the same, a method for detecting IgG4 using the monoclonal antibody, and a kit for use therein.)

具体实施方式

】

本发明的实施方式涉及的单克隆抗体例如以纯化人IgG4作为免疫原，免疫动物，由通过使该动物产生的产生抗人IgG4抗体的细胞和骨髓瘤疡细胞融合而得到的杂交瘤产生。使用的动物不限定，可为人以外的动物，例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、等。特别是，IgG的亚型优选是IgG1、IgG2a、IgG2b、及IgG3的小鼠。

上述杂交瘤可由以下的方法得到。即，通过将人IgG4使用弗氏的完全、不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、百日咳佐剂等已经公知的而一同混合，制作致敏用佐剂液而分数次向小鼠、大鼠等的动物每隔1～3周腹腔内皮下、或者尾静脉施用而进行免疫。致敏抗原量设为在1μg～100mg之间，一般而言优选50μg左右。免疫次数一般是2～7次，已知各种各样的方法。接下来，将来源于脾脏等的产生抗体的细胞和骨髓瘤疡细胞(骨髓瘤细胞)等在试管内有增殖能力的细胞融合。产生抗体的细胞可从小鼠、裸鼠、大鼠等的脾脏等得到。

作为上述融合法，可通过由已经公知的Kohler和Milstein的定法(Nature.256,495.1975)使用聚乙二醇(PEG)融合。仙台病毒也可由电融合法进行融合。

作为从上述融合的细胞选择产生识别人IgG4的抗体的杂交瘤的方法，可如以下一样进行。即，从上述融合的细胞由有限稀释法从由在HAT培养基及HT培养基中生存的细胞制作的集落选择杂交瘤。在来自接种在96孔等的融合细胞的集落培养上清中含对于人IgG4的抗体时，可在将人IgG4固定化于板上的测定板上放置上清，反应后由使抗小鼠免疫球蛋白-HRP标记抗体等的第2次标记抗体反应的ELISA法选择针对人IgG4的产生单克隆抗体的克隆。在标记抗体的标记物质中，除了HRP之外，可使用碱性磷酸酶等的酶、荧光物质、放射性物质等。另外，通过同时进行由作为对照仅结合作为封闭剂的BSA的测定板的ELISA，可进行人IgG4特异性抗体的筛选。即，可选择在人IgG4板阳性、用由BSA的ELISA阴性的克隆。

作为本发明的实施方式涉及的杂交瘤，在产生识别人IgG4的单克隆抗体的杂交瘤之中，优选产生特别与人IgG4结合，不与其他人免疫球蛋白(其他IgG(IgG1、IgG2、IgG3)、IgA(IgA1,IgA2)、IgD、IgE及IgM)结合的抗体的杂交瘤。

其中“与人IgG4结合，不与其他人免疫球蛋白结合”是指例如，简言之，在通常的ELISA中，在以下述以外的测定条件作为相同时，在作为固相抗原含人IgG4时以不含任何的人免疫球蛋白的作为对照(空白)之时的吸光度的比示40以上、优选50以上、更优选为100以上，并且，在作为固相抗原含人IgG4以外时，以不含任何的人免疫球蛋白的作为对照(空白)之时的吸光度的比示5以下，优选2以下，。

另外，是指对于人IgG4示比其他人免疫球蛋白高的结合亲和性，也可使用结合速度常数和解离常数而进行评价。具体而言，在根据本发明的优选的实施方式的抗体中，以4.0×10⁵以上、通常4.0×10⁵～6.0×10⁵的结合速度常数、以及5.0×10^-10以下，通常5.0×10^-10～3.0×10^-10的解离常数结合于人IgG4的重链恒定区的特定的表位。

上述杂交瘤可用通常在细胞培养中使用的培养基、例如α-MEM、RPMI1640、ASF、S-clone等培养，从其培养上清回收单克隆抗体。另外，预先对杂交瘤所来源的动物、裸鼠进行姥鲛烷处理，通过向该动物腹腔内注射细胞而使腹水贮留，也可从该腹水回收单克隆抗体。

作为从上述的上清、腹水回收单克隆抗体的方法，可使用通常的方法。例如，可举出由硫酸铵、硫酸钠等的盐析法或层析、离子交换层析、由蛋白A、蛋白G等的亲和性层析等。

可由使用本发明的实施方式涉及的单克隆抗体的免疫测定法高灵敏度并且特异性地检测受试体中的人IgG4。作为成为对象的受试体，可举出从受试体采集、单离的血液、血清、血浆等。也可为全身的病变组织、例如，自垂体、泪腺、唾液腺、甲状腺、前列腺、支气管上皮、肺泡隔壁、胰腺管、后腹膜、胆管壁、或者类风湿性关节炎滑膜的活体检查样品。

“免疫测定法”是指利用抗原和抗体的反应，对生物学试样之中所含的物质的水平进行测定的生物化学试验测定法。

作为由使用本发明的实施方式涉及的单克隆抗体的“免疫测定法”的检测方法，可举出夹心ELISA法、化学发光酶联免疫测定法(CLEIA法)、荧光免疫测定法(FIA)、乳胶(颗粒)凝集法(比浊法)等，更优选为乳胶(颗粒)凝集阻止法。

“ELISA法”是指ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay)/EIA(EnzymeImmunoAssay))，将试样中所含的物质的浓度使用酶反应而检测定量的方法。通过在信号中使用基于酶反应的显色发光来对对象进行检测测定。

“竞争结合ELISA法”是指对“标记的抗原”和“试样中的存在的抗原”在竞争结合条件下以何比例与抗体结合进行测定的ELISA法。

“免疫透射比浊法”是指使抗原抗体反应，使免疫复合物的沉降物形成，向该凝集块照射光而将由散射的照射光的衰减(吸光度)用自动分析器测量而对受试体中所含的抗原量进行测定的方法。

“免疫散射比浊法”是指使抗原抗体反应，使免疫复合物的沉降物形成，向该复合物照射光，通过对散射的光进行测定，检测受试体中所含的抗原的方法。

“乳胶(颗粒)凝集法”是指将抗体固相化于乳胶颗粒，在抗原存在下使乳胶颗粒凝集，通过对此凝集进行观察，检测抗原的方法。

“乳胶(颗粒)凝集阻止法”是指将抗原固相化于乳胶颗粒，将“与乳胶颗粒结合的抗原”和“试样中的存在的抗原”在竞争结合条件下以何比例与抗体结合，对乳胶颗粒的凝集进行观察，间接检测“试样中的存在的抗原”的方法。

在任何的情况中，在其凝集的观察中均可测量由散射的照射光的衰减(吸光度)(免疫透射比浊法)，也可测定散射的光(免疫散射比浊法)。

在本申请发明的实施方式中，“与乳胶颗粒结合的抗原”无必然与“存在于试样中的抗原”相同分子的必要，只要是在与本申请发明涉及的抗体或其抗原结合片段片的结合中与“存在于试样中的抗原”竞争结合的分子即可。当相反定义时，将本申请发明涉及的抗体使用“乳胶(颗粒)凝集阻止法”时，优选“与乳胶颗粒结合的抗原”及“存在于试样中的抗原”含该抗体的表位。

表位(epitope)是指抗体识别的抗原的一部分。人IgG4通过由可变区域VL和恒定区CL构成的轻链2分子；及由可变区域VH和恒定区CH1、铰链区域、恒定区CH2及恒定区CH3构成的重链2分子组成的具有约146000的分子量的异源四聚体分子，抗体不识别其整体，仅识别抗原的比较小的一部分而结合。为了作为表位发挥功能，需要至少10氨基酸残基、更优选为5氨基酸残基的长度。将此抗体结合部分也称为“表位”或“抗原决定基(antigenicdeterminant)”。

本发明的实施方式涉及的抗体被要求识别IgG4，而不识别IgG1、IgG2及IgG3。由于轻链在IgG1～IgG4上共同，表位优选处于重链、尤其是，重链恒定区。IgG1、IgG2、IgG3及IgG4的重链恒定区优选以各示于SEQ ID NO:1、2、3及4，SEQ ID NO:1～3和SEQ ID NO:4的相同性低的部分作为表位，在后述的实施例中证实的通过，特别，存在于人IgG4的CH3区域、更具体而言，SEQ ID NO:4所示的人IgG4的重链恒定区的第221位至第327位的氨基酸序列的范围内，含第299位的谷氨酸的表位在无向其他IgG亚类的交叉反应地达成向IgG4的特异性的结合上优选。换言之，本发明的优选的实施方式涉及的抗体的表位由SEQ ID NO:4所示的人IgG4的重链恒定区的第221位至第327位的氨基酸序列的全部或一部分构成，含第299位的谷氨酸。从而，根据本发明的优选的其他实施方式，也提供含表位的肽、更具体而言，由SEQ ID NO:4所示的人IgG4的重链恒定区的第221位至第327位的氨基酸序列的全部或一部分(通常，5个至50个、优选10个至30个)构成，含第299位的谷氨酸的肽。

“乳胶(颗粒)凝集法”，在通常情况下，如果不使用表位不同的多个单克隆抗体(多克隆)，则不发生凝集，但由于是IgG4本身、轻链和重链的异源二聚体的二聚体，即使是单克隆抗体，也可应用于凝集反应。再者，当向乳胶颗粒吸附多个抗体分子时，抗体分子即使是一价抗体分子(抗原(识别)结合部位是每1分子1个)，也可发生凝集。

“1价抗体”是可将天然的抗体用木瓜蛋白酶处理的Fab片段或使轻链可变区域和重链可变区域基因工程学地结合的scFV(single-chain variable fragment)等。

一方面，在“乳胶(颗粒)凝集阻止法”的情况中，使用多个多克隆抗体等的结合常数、表位、特异性不同的抗体时，由于有在测定系内的反应中出偏差的可能性，多克隆抗体是不适宜。

再者，由于如果使用的抗体是一价抗体分子，则不发生经抗体(吸附抗原)的乳胶颗粒间的凝集反应，同样不适宜。抗原(识别)结合部位需要每1分子2个以上，需要是天然的免疫球蛋白类型(IgG(2价)、IgA(4价)、IgD(2价)、IgE(2价)及IgM(10价))或可由胃蛋白酶处理得到的F(ab’)₂(2价)或上述“1价抗体”的多聚体抗体。

“抗原(识别)结合部位”表示可与抗原结合的抗体的最小部位。不限于此，指含重链及轻链的互补性决定区域(CDR)的部位。也可含作为轻链的可变区域的V_L区域和作为重链的可变区域的V_H区域。这些也可基因工程学地或经SS键等而结合。

乳胶原本是指聚合物树脂的胶体状水分散物，在本申请中，“乳胶颗粒”是指有均一的粒径的聚合物树脂。只要是可在通常的免疫测定法中使用的乳胶颗粒，就不特别限定，优选以聚苯乙烯作为主材料。

在本申请中使用的乳胶颗粒的粒径可为50nm～500nm、优选75nm～306nm、更优选为100nm～111nm。

在实施本发明的实施方式涉及的测定方法之时，作为用于对人IgG4进行免疫测定的试剂盒，可使用含(1)本发明抗体、(2)单离的人IgG4或其肽片段及(3)固相支持体的试剂盒而进行。

在此试剂盒中，分别制作固相支持体和单离的人IgG4或其肽片段溶液，对IgG4进行测定时，可向固相支持体吸附抗体，也可在预先向固相支持体吸附抗体的状态下提供。在此试剂盒中，使受试体中的单离的人IgG4或其肽片段与抗体结合之后，为了除去不吸附在固相支持体的成分，优选含清洗液。作为清洗液，可使用例如，含表面活性剂的Tris缓冲液。

再者，也可根据需要，向本发明的试剂盒加含受试体稀释液。作为受试体稀释液，可使用例如，Tris等的缓冲液。根据需要，也可向该缓冲液加EDTA·2Na等的鳌合剂、食盐等的无机盐。

“单离的人IgG4或其肽片段”如上所述，由于作为“与乳胶颗粒结合的抗原”使用，有含本发明抗体的表位的必要。也可单离纯化天然的IgG4分子，但也可克隆基因工程学地制作的其“肽片段”、例如，人IgG4的轻链或重链的恒定区的一部分或全部。该人IgG4的重链的恒定区的一部分或全部可含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的一部分或全部。

在本发明的实施方式中，也可由使用本发明的单克隆抗体的夹心测定ELISA法测定IgG4。此时，作为单克隆抗体，除了本发明抗体之外，也可使用对于其他IgG4的不同的抗体来实施。对由夹心测定的IgG4进行测定的方法的具体例如下所述。首先，作为第一抗体向固相支持体、例如，板吸附本发明抗体，与受试体、例如，血清中的IgG4反应，清洗固相支持体，接下来，使吸附的IgG4和生物素化的第2抗体、例如生物素化的对于别的IgG4的单克隆抗体或多克隆抗体反应，与过氧化物酶标记链霉亲和素反应之后，过氧化物酶反应、接下来，通过进行显色反应，可检测IgG4。另外，通过使用将第2抗体由过氧化物酶或碱性磷酸酶等直接酶标记，可进行同样的测定。另外，与第2次标记抗体结合的物质也可由测定方法，不限于酶，放射线同位素、荧光物质、磁性物质、胶体等。

在本发明的实施方式中，在进行使用本发明抗体的夹心测定ELISA之时，可使用夹心测定ELISA用的试剂盒而实施。

在用夹心测定ELISA法实施本发明的测定方法之时，例如，作为用于对IgG4进行免疫测定的试剂盒，即使通过使用含(i)固相支持体、(ii)本发明抗体、(iii)被标记的对于不同的IgG4的抗体、及(iv)用于检测标记的成分的试剂盒，也可对IgG4进行测定。

用于检测标记的成分是指用于对抗体被标记进行测定的成分，当标记是生物素时，是含过氧化物酶标记链霉亲和素、四甲基联苯胺的过氧化物酶底物、及过氧化氢的试剂，当标记是碱性磷酸酶时，是含p-硝基苯基磷酸的试剂。在此试剂盒中，也可根据需要，含清洗液。

在本发明中，在使用此试剂盒之时，在使受试体中的IgG4与抗体结合之后，为了除去不吸附在固相支持体的成分，优选含清洗液。作为清洗液，可使用例如，含表面活性剂的Tris缓冲液。再者，也可根据需要，向本发明的试剂盒加含受试体稀释液。作为受试体稀释液，可使用例如，Tris等的缓冲液。也可根据需要，向该缓冲液加EDTA·2Na等的鳌合剂、食盐等的无机盐。

再者，在本发明中，也可将受试体中的人IgG4的存在由利用本发明的单克隆抗体的组织免疫染色法检测。即，例如，从人的垂体、泪腺、唾液腺、甲状腺、前列腺、支气管上皮、肺泡隔壁、胰腺管、后腹膜、胆管壁、类风湿性关节炎滑膜组织等由通常的方法，调制例如冷冻切片，使其与本发明的单克隆抗体反应，接下来，例如，与用过氧化物酶或碱性磷酸酶等的酶标记的第二抗体反应，接下来，通过使显色，可特异性地检测IgG4的存在。

这样的由组织免疫染色法的检测可使用含(i)本发明的单克隆抗体、(ii)标记的第二抗体及(iii)显色试剂作为构成成分的试剂盒而实施。作为被标记的第二抗体，例如，可举出用过氧化物酶或碱性磷酸酶等的酶标记的动物来源的抗IgG抗血清、抗IgG多克隆抗体等，作为显色试剂，使用用于使在标记中使用的酶显色的通常使用的显色底物等的试剂。

在本发明中，在进行使用本发明抗体的化学发光酶联免疫测定法(CLEIA法)、荧光免疫测定法(FIA)或乳胶凝集法时，可各使用公知的化学发光酶联免疫测定法(CLEIA法)用试剂盒、荧光免疫测定法(FIA)用试剂盒或乳胶凝集法用的试剂盒而实施。

【实施例】

由以下的实施例、比较例及参考例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。

＜实施例1＞单克隆抗体的制作和评价

(1)单克隆抗体制作用抗原的选择和准备

基于公知的方法(例如Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497)而制作产生识别人IgG4的单克隆抗体的杂交瘤。作为抗原使用的IgG4从人血清调制。具体而言，将人血清由硫酸铵沉淀分级分离－透析后，根据CaptureSelectIgG4 Affinity Matrix(ThermoFisherScientific株式会社)的制品附带文书，纯化IgG4抗原。

(2)免疫

使与从人血清由上述的方法纯化的0.5mg/mL人IgG4同体积量的弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)充分混合直至乳化，制作乳化悬浮液。对4周龄Balb/c小鼠进行二乙基醚麻醉，将上述的乳化悬浮液以每1只50μg的人IgG4实施腹腔内施用。约2周间隔，向各自小鼠注射与上述同样地用弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)制作的乳化悬浮液6次。作为最终免疫，从上述第6次的注射起约3周后，同样地注射乳化悬浮液。

(3)杂交瘤的确立

在自最终免疫起3天后，将在二乙基醚麻醉下外科摘出的脾脏无菌分散，调制脾脏细胞。使用聚乙二醇而将脾脏细胞数和骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)数的融合比率以5:1实施融合。将融合细胞分散于10％FBS(HyClone公司)ASF(COSMO-BIO株式会社)HAT(COSMO-BIO株式会社)培养基，分注到48孔板(住友Bakelite)而在37℃、5％CO₂条件进行培养。在以下的筛选中使用的杂交瘤集落数是4481。

(4)筛选

将得到的杂交瘤的筛选以称为(1)向IgG4的结合能确认、(2)特异性确认、(3)向免疫学凝集阻止法的适应性确认的3阶段实施。

(1)向IgG4的结合能评价

将作为上述抗原使用的纯化的人IgG4以成为0.1μg/孔的方式分注到96孔板(Nunc)。用振荡器在700rpm、25.0℃的条件下振荡1小时。去废液而用300μL的PBST(10mM磷酸二氢钠；150mM氯化钠；0.05％聚氧乙烯(20)山梨坦单月桂酸酯；pH7.4)清洗3次后，添加100μL的封闭缓冲液(10mM磷酸二氢钠；150mM氯化钠；1％BLOCK ACE粉末(大日本住友制药)；pH7.4)，1晚以上于4℃保存。同样地用PBST清洗后，添加各100μL杂交瘤集落的培养上清，用与上述同条件振荡。同样地用PBST清洗后，添加各100μL用抗体稀释缓冲液(10mM磷酸二氢钠；150mM氯化钠；0.05％聚氧乙烯(20)山梨坦单月桂酸酯；0.05％牛血清白蛋白；pH7.4)稀释10000倍的抗小鼠IgG(H+L)HRP标记抗体(Life Technologies)，用与上述同条件振荡。同样地用PBST清洗后，添加100μL的SureBlue(KPL)。于室温静置15分钟之后，添加100μL的0.5mol/L硫酸(和光纯药工业)。用酶标仪(BIO-RAD)测定波长450nm。合计4481孔中，选定确认到向IgG4的结合能的192孔。使选定的杂交瘤单克隆化，持续培养。

(2)特异性评价

评价从(1)中选定的克隆产生的抗体的特异性。以成为1μg/mL的方式用PBS(-)调整骨髓瘤人IgG1(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG2(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG3(Sigma-Aldrich)、骨髓瘤人IgG4(EMD Millipore)。向96孔板(Thermo Fisher)添加各100μL调整的试样。与上述(1)同样地进行利用振荡器的振荡往后的操作。192克隆中，选定与骨髓瘤人IgG1、2、3相比，与骨髓瘤人IgG4示强的反应的8克隆。

(3)向免疫学颗粒凝集阻止法的适应性评价

在从(2)中选定的克隆产生的抗体中，评价向免疫学凝集阻止法的应用性。

(1)第一试剂(R1)的调制

向2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲溶液1以成为15μg/mL的浓度的方式加各自含如上所述选定的8克隆来源的产生抗体的溶液而作为第一试剂。

(2)第二试剂(R2)的调制

向2％浓度的粒径107nm的聚苯乙烯制的乳胶颗粒溶液18mL加从人血清由通常的方法粗纯化的人IgG4 0.35mg/mL溶液18mL，于室温搅拌1小时而向乳胶颗粒物理吸附人IgG4。其后，进行以20,000rpm离心90分钟分离，废弃上清而回收沉淀物。向此沉淀物加含3％浓度的牛血清白蛋白的包被缓冲液24mL而使悬浮，进行超声波处理而完全地分散之后，于室温搅拌1小时。接下来，向再进行离心分离而得到的沉淀物加12mL的HEPES缓冲溶液2，悬浮而进行超声波处理而完全地分散之后，得到用HEPES缓冲溶液2调整到乳胶浓度0.12％的人IgG4致敏乳胶颗粒悬浮液而作为对于各第一试剂而共同的第二试剂使用。

再者，各试剂的组成如下。

HEPES缓冲溶液1

25mM 2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工业)；100mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(埼京化成工业)；150mM氯化钠(和光纯药工业)；1mM EDTA·2Na(和光纯药工业)；3.3％葡聚糖70(东京化成工业)；0.1％BLOCK ACE(大日本住友制药)；0.09％叠氮化钠(和光纯药工业)；pH7.40。

包被缓冲液

25mM 2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工业)；150mM氯化钠(和光纯药工业)；1mM EDTA·2Na(和光纯药工业)；3％牛血清白蛋白(MerckMillipore)；0.09％叠氮化钠(和光纯药工业)；pH7.50。

HEPES缓冲溶液2

500mM 2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(埼京化成工业)；25mM 2-吗啉代乙磺酸(和光纯药工业)；1mM EDTA·2Na(和光纯药工业)；150mM L-精氨酸盐酸盐(和光纯药工业)；0.075％ProClin950(Sigma-Aldrich)；pH6.00。

(3)吸光度变化量的测定

作为标准试样，使用将人IgG4浓度各自调整到0.0、1.6、6.3、12.5、25.0、50.0mg/dL的标准人血清。再者，在0.0mg/dL中使用生理盐水。使用日立7180型自动分析装置，使试样3μL与第一试剂120μL、第二试剂120μL反应，在主波长570nm、副波长800nm在18～28测光点间(相当于R2添加后约1分钟后至4分钟后)，对由2端点法的吸光度变化量进行测定(n＝2)。从8克隆中5克隆产生的抗体在0.0mg/dL时显示最大的吸光度变化量，随着人IgG4浓度升高而吸光度变化量减少。从而，5个克隆(MaI4-09、MaI4-08、MaI4-01、MaI4-06、MaI4-03)示向免疫学凝集阻止法的适应性。一方面，关于其他3个克隆(MaI4-02、MaI4-04、MaI4-05)，在确认不到0.0mg/dL时的最大的吸光度变化量、及伴随人IgG4浓度升高的吸光度变化量的减少，不适应于免疫学凝集阻止法(图1)。产生显示向免疫学凝集阻止法的适应性的抗体的5克隆之中，选定产生0.0mg/dL时的吸光度变化量高的抗体的上位2克隆，在往后的解析中使用。

(4)保藏

在上述选定的杂交瘤MaI4-08及MaI4-09以2015年9月1日的日期，在2015年9月1日以保藏号NITE AP-02112(MaI4-08)及NITE AP-02113(MaI4-09)由独立行政法人制品评价技术基盘机构内专利微生物保藏中心接收，在2015年9月14日生存确认后，赋予保藏号NITEP-02112(MaI4-08)及NITE P-02113(MaI4-09)(2015年9月30日发行保藏证)。

接下来，记载确定保藏的内容。

保藏机关的名称－地址

[1]名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构产业技术综合研究所专利微生物保藏中心

地址：日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)

保藏日：2015年9月1日

[2]保藏号NITE P-02112(杂交瘤MaI4-08)

[3]NITE P-02113(杂交瘤MaI4-09)

其后，为了将相同的杂交瘤国际保藏，对于独立行政法人制品评价技术基盘机构内专利微生物保藏中心而进行微生物移管请求，2018年6月8日以保藏号NITE BP-02112(MaI4-08)及NITE BP-02113(MaI4-09)接收。

(5)由细胞培养法的单克隆抗体的产生

作为从上述杂交瘤产生抗体的方法，基于公知的方法(例如单克隆抗体：生物化学实验法东京化学同人)而进行。具体而言，为了产生单克隆抗体，有体外培养及体内培养。作为体外培养，有在培养液中的杂交瘤的培养等，一方面，作为体内培养方法，有制作小鼠腹水的方法等，选择体外培养，取得含单克隆抗体的培养液上清。

(6)单克隆抗体的纯化

作为从上述纯化单克隆抗体的方法，基于公知的方法(例如单克隆抗体：生物化学实验法东京化学同人)而进行。作为单克隆抗体的纯化，一般是亲和性层析纯化，使用负载蛋白G或蛋白A等的琼脂糖柱，选择负载蛋白G的蛋白G琼脂糖柱(GE Healthcare)，进行纯化。对在得到的单克隆抗体中的280nm的吸光度进行测定，确认抗体浓度。调整浓度后，用0.45μm以下滤器过滤灭菌。

(7)抗体的确认

将MaI4-08、MaI4-09产生抗体各自根据Iso-Gold Rapid Mouse-MonoclonalIsotyping Kit(有κ和λ)(BioAssay Works)的制品附带文书，实施同种型的鉴定。同种型如表1。

【表1】

杂交瘤识别表示	重链	轻链
			MaI4-08	IgG1	κ
MaI4-09	IgG1	κ

(8)由ELISA的特异性的评价

以成为1μg/mL的方式用PBS(-)调整骨髓瘤人IgA1(Abcam)、骨髓瘤人IgA2(Abcam)、骨髓瘤人IgD(Abcam)、骨髓瘤人IgE(Abcam)、骨髓瘤人IgM(Abcam)、骨髓瘤人IgG1(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG2(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG3(Sigma-Aldrich)、骨髓瘤人IgG4(EMD Millipore)。向96孔板(Thermo Fisher)添加各100μL调整的试样。用振荡器在700rpm、25.0℃的条件下振荡1小时。去废液而用300μL的PBST清洗3次后，添加100μL的封闭缓冲液，1晚以上于4℃保存。同样地用PBST清洗后，各自添加各100μL以成为1μg/mL的方式用抗体稀释缓冲液调整的MaI4-08、MaI4-09产生抗体，用与上述同条件振荡。同样地用PBST清洗后，添加各100μL用抗体稀释缓冲液稀释4000倍的抗小鼠IgG HRP标记抗体(Abcam)，用与上述同条件振荡。同样地用PBST清洗后，添加100μL的SureBlue(KPL)。MaI4-08、MaI4-09各自在5、3分钟后添加100μL的0.5mol/L硫酸(和光纯药)。用酶标仪(BIO-RAD)测定波长450nm。结果，与其他调整试样相比，在骨髓瘤人IgG4中确认到强的信号(表2及3、图2及3)。

【表2】

	(-)	IgA1	IgA2	IgD	IgE	IgM	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
											(-)	0.058	0.052	0.051	0.055	0.052	0.053	0.049	0.045	0.048	0.050
MaI4-08	0.042	0.043	0.043	0.042	0.041	0.042	0.048	0.047	0.044	2.044

【表3】

	(-)	IgA1	IgA2	IgD	IgE	IgM	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4
											(-)	0.040	0.041	0.043	0.047	0.049	0.044	0.046	0.042	0.045	0.041
MaI4-09	0.048	0.058	0.050	0.051	0.050	0.055	0.063	0.064	0.052	2.284

(9)单克隆抗体的氨基酸序列解析

MaI4-08、MaI4-09各自由Fusion Antibodies公司的流程进行mRNA的提取、克隆及测序。解析的结果，MaI4-08的可变区域是SEQ ID NO:5(重链可变区域)及SEQ ID NO:6(轻链可变区域)，MaI4-09的可变区域是SEQ ID NO:7(重链可变区域)及SEQ ID NO:8(轻链可变区域)，CDR的氨基酸序列成为如表4。

【表4】

＜实施例2＞使用MaI4-08、MaI4-09产生抗体的测定试剂调制及测定

(1)试剂的调制

(1)第一试剂(R1)的调制

以成为15μg/mL的浓度的方式向2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲溶液1加MaI4-08或MaI4-09产生抗体溶液，作为第一试剂。另外，作为对照试剂，调制将MaI4-05产生抗体及市售抗体HP6025(MerckMillipore)同样地添加到HEPES缓冲溶液1中的溶液。

(2)第二试剂(R2)的调制

向2％浓度的粒径107nm的聚苯乙烯制的乳胶颗粒溶液18mL加从人血清由通常的方法粗纯化的人IgG4 0.35mg/mL溶液18mL，于室温搅拌1小时而向乳胶颗粒物理吸附人IgG4。其后，进行以20,000rpm离心90分钟分离，废弃上清而回收沉淀物。向此沉淀物加24mL含3％浓度的牛血清白蛋白的包被缓冲液而使悬浮，进行超声波处理而完全地分散之后，于室温搅拌1小时。接下来，向再进行离心分离而得到的沉淀物加12mL的HEPES缓冲溶液2而使悬浮而进行超声波处理而完全地分散之后，得到用HEPES缓冲溶液2调整到乳胶浓度0.12％的人IgG4致敏乳胶颗粒悬浮液而作为对于各第一试剂而共同的第二试剂使用。

再者，各试剂的组成如下。

【表5】HEPES缓冲溶液1(pH7.40)

2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸	埼京化成工业25mM
		3-(环己基氨基)-1-丙磺酸	埼京化成工业100mM
氯化钠	和光纯药工业150mM
		EDTA·2Na	和光纯药工业1mM
葡聚糖70	东京化成工业3.3％
		BLOCK ACE	大日本住友制药0.1％
叠氮化钠	和光纯药工业0.09％

【表6】包被缓冲液(pH7.50)

【表7】HEPES缓冲溶液2(pH6.00)

2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸	埼京化成工业	500mM
			2-吗啉代乙磺酸	和光纯药工业	25mM
EDTA·2Na	和光纯药工业	1mM
			L-精氨酸盐酸盐	和光纯药工业	150mM
ProClin950	Sigma-Aldrich	0.075％

(2)吸光度变化量的测定

作为标准试样，使用将人IgG4浓度各自调整到1.6、6.3、12.5、25、50mg/dL的标准人血清。由于在本测定中以将受试体试样的测定稀释20倍而进行测定作为前提，最终的标准试样浓度成为20倍，成为31.3、125、250、500、1000mg/dL。往后记载的试样浓度作为全部20倍的最终的试样浓度。在人IgG4浓度0.0mg/dL的试样中，使用含0.85％氯化钠的生理盐水。人IgG4浓度的测定使用日立7180型自动分析装置，使试样3μL与第一试剂120μL、第二试剂120μL反应，在主波长570nm、副波长800nm处在18～28测光点间(相当于R2添加后约1分钟后至4分钟后)，对由2端点法的吸光度变化量进行测定(n＝2)。

(3)测定结果

使用上述试剂而测定人IgG4浓度时的吸光度变化量各自示于表8以及图4、5、6、及7。

【表8】

如表8以及图4～7所示，作为在第一试剂中使用的小鼠抗人IgG4单克隆抗体，使用MaI4-08产生抗体或MaI4-09产生抗体时，随着人IgG4浓度变高而吸光度变化量减少。一方面，使用由MaI4-05产生抗体及市售抗体HP6025调制的对照试剂时，见不到人IgG4浓度依赖性的吸光度变化。从以上得知，用MaI4-05产生抗体及市售的抗体HP6025调制的试剂应用于利用自动分析装置的乳胶(颗粒)凝集阻止法是困难的。一方面得知，用MaI4-08及MaI4-09产生抗体调制的试剂是能应用于乳胶(颗粒)凝集阻止法，对于使用自动分析装置的人IgG4浓度测定有用。

(4)稀释直线性的评价

对于作为在第一试剂中使用的小鼠抗人IgG4单克隆抗体使用MaI4-08产生抗体或MaI4-09产生抗体的情况而进行稀释直线性的评价。作为试样，以将人IgG4浓度调整到1000mg/dL的标准人血清由含0.85％氯化钠的生理盐水阶段稀释的试样作为受试体使用。在人IgG4浓度0.0mg/dL的试样中直接使用生理盐水。人IgG4浓度的测定使用日立7180型自动分析装置，使试样3μL与第一试剂120μL、第二试剂120μL反应，在主波长570nm、副波长800nm处在18～28测光点间(相当于R2添加后约1分钟后至4分钟后)，对由2端点法的吸光度变化量进行测定(n＝2)。从表6的结果制成校准曲线，算出试样中的人IgG4浓度。

(5)向前带现象的抗性的评价

对于作为在第一试剂中使用的小鼠抗人IgG4单克隆抗体使用MaI4-08产生抗体或MaI4-09产生抗体的情况而进行向前带现象的抗性评价。作为试样，将人IgG4浓度调整到8000mg/dL的标准人血清由含0.85％氯化钠的生理盐水阶段稀释，作为受试体使用。人IgG4浓度的测定使用日立7180型自动分析装置，使试样3μL与第一试剂120μL、第二试剂120μL反应，在主波长570nm、副波长800nm处在18～28测光点间(相当于R2添加后约1分钟后至4分钟后)，对由2端点法的吸光度变化量进行测定(n＝2)。从表6的结果制成校准曲线，算出试样中的人IgG4浓度。

(6)对于人IgG4的特异性的评价

对于作为在第一试剂中使用的小鼠抗人IgG4单克隆抗体使用MaI4-08产生抗体或MaI4-09产生抗体的情况而进行对于人IgG4的特异性的评价。作为试样，使用调整到3000mg/dL的骨髓瘤人IgG4溶液(EMD Millipore)。另外，作为对照试样，使用同样地调整的骨髓瘤人IgG1溶液(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG2溶液(EMD Millipore)、骨髓瘤人IgG3溶液(Sigma-Aldrich)。在空白试样中使用生理盐水。人IgG4浓度的测定使用日立7180型自动分析装置，使试样3μL与第一试剂120μL、第二试剂120μL反应，在主波长570nm、副波长800nm处在18～28测光点间(相当于R2添加后约1分钟后至4分钟后)，对由2端点法的吸光度变化量进行测定(n＝2)。从表6的结果制成校准曲线，算出试样中的人IgG4浓度。

(7)测定结果

结果各自示于图8～13、表9及10。

【表9】

【表10】

在第一试剂中使用本发明的杂交瘤产生的小鼠抗人IgG4单克隆抗体时，以0～1000mg/dL的校准范围有充分的稀释直线性确证(图8及9)。另外，对于前带现象，见不到至8000mg/dL测定值的降低(图10及11)。再者，基本上确认不到与IgG1、IgG2、IgG3的反应性(图12及13、表9及10)。

如上所述，新得知不仅筛选阶段，即使是作为抗IgG4单克隆抗体报告的抗体(HP6025)(非专利文献6)，也有不适宜于免疫学颗粒凝集阻止法的抗体。为明确适宜于免疫学颗粒凝集阻止法的抗体和不适宜的抗体的差异，进行抗体的相互作用的解析及表位解析。

＜实施例3＞相互作用的解析

以成为1mg/mL的方式调制MaI4-08及MaI4-09的产生抗体和作为对照的MaI4-05产生抗体及HP6025。另外，调制从人血清纯化的1mg/mL的IgG4。沿株式会社住化分析中心的流程，将IgG4用胺偶联法固定化于芯片，进行使用Biacore机种的传感图取得。得到的结合速度常数(k_a)、解离速度常数(k_d)及解离常数(KD)成为如表11。

【表11】

	k<sub>a</sub>[M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>]	k<sub>d</sub>[S<sup>-1</sup>]	KD[M]
				MaI4-08	5.492E+05	2.229E-04	4.058E-10
MaI4-09	4.419E+05	1.444E-04	3.268E-10
				MaI4-05	2.858E+04	6.492E-05	2.272E-09
HP6025	1.669E+03	6.814E-04	4.084E-07

3种抗体之中，MaI4-05产生抗体的结合速度常数k_a是MaI4-08及MaI4-09产生抗体的10分之1以下，HP6025抗体的结合速度常数k_a是MaI4-08及MaI4-09产生抗体的100分之1以下。

＜实施例4＞表位的解析

从Uniprot取得人IgG4重链恒定区的氨基酸序列(P01861、SEQ ID NO:4)。设计向使得到的氨基酸序列部分缺损的各自SEQ ID NO:4及25～35所示的氨基酸序列H1～12(图14)的N末端连接GST标签的肽。H1(SEQ ID NO:4)是由人IgG4重链恒定区全长的氨基酸序列构成。H2是由人IgG4重链恒定区的第1～274位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:25)。H3是由人IgG4重链恒定区的第1～220位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:26)。H4是由人IgG4重链恒定区的第1～165位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:27)。H5是由人IgG4重链恒定区的第1～110位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:28)。H6是由人IgG4重链恒定区的第1～55位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:29)。H7是由人IgG4重链恒定区的第56～327位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:30)。H8是由人IgG4重链恒定区的第111～327位的氨基酸序列构成(SEQ IDNO:31)。H9是由人IgG4重链恒定区的第166～327位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:32)。H10是由人IgG4重链恒定区的第221～327位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:33)。H11是由人IgG4重链恒定区的第275～327位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:34)。H12是由人IgG4重链恒定区的第99～220位的氨基酸序列构成(SEQ ID NO:35)。

另外，设计在人IgG4重链CH3区域中的氨基酸序列(H10、SEQ ID NO:33)中，向将部分人IgG4特异序列部分取代为人IgG1重链恒定区的对应的氨基酸的各自SEQ ID NO:36～44所示的氨基酸序列H31-39(图15)的N末端连接GST标签的肽。H31是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第235位的谷氨酰胺残基取代为精氨酸残基(SEQ ID NO:36)。H32是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第289位的精氨酸残基取代为赖氨酸残基(SEQ ID NO:37)。H33是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第299位的谷氨酸残基取代为谷氨酰胺残基(SEQ ID NO:38)。H34是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第325位的亮氨酸残基取代为脯氨酸残基(SEQ ID NO:39)。H35是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第235位的谷氨酰胺残基取代为精氨酸残基，将第289位的精氨酸残基取代为赖氨酸残基，将第299位的谷氨酸残基取代为谷氨酰胺残基，将第325位的亮氨酸残基取代为脯氨酸残基(SEQ ID NO:40)。H36是将人IgG4重链恒定区的第221～327位的氨基酸序列中的IgG4特异序列取代为全部对应的IgG1的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。H37是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第289位的精氨酸残基取代为赖氨酸残基，将第325位的亮氨酸残基取代为脯氨酸残基(SEQ ID NO:42)。H38是基于H10的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第289位的精氨酸残基取代为赖氨酸残基，将第299位的谷氨酸残基取代为谷氨酰胺，将第325位的亮氨酸残基取代为脯氨酸残基(SEQ ID NO:43)。H39是基于H36的氨基酸序列，将人IgG4重链恒定区的第299位的谷氨酰胺残基取代为谷氨酸残基(SEQ ID NO:44)。

基于设计的各氨基酸序列，由GenScript公司的流程设计适宜于在大肠杆菌中的蛋白质表达的碱基序列，制作插入各碱基序列的载体pGEX-6P-1(GE Healthcare·Bioscience)。向大肠杆菌BL21株导入制作的表达质粒而得到转化体。用通常的方法培养转化体，诱导由IPTG的蛋白质表达。用离心分离集菌后，用通常的溶解液溶解，进行超声波处理。向得到的溶解液6μL添加SDS样品缓冲液6μL。各调制的试样进行于95℃加热5分钟处理。向添加SDS电泳缓冲液的5～20％电泳凝胶(ATTO)的各孔添加各10μL上述的大肠杆菌破碎试样。另外，将分子量标准品(Bio-Rad)也同样地添加到孔中而进行电泳。电泳结束后，将电泳凝胶用转录缓冲液转印到PVDF膜(MerckMillipore)。向膜封闭缓冲液浸渍PVDF膜，于室温振荡30分钟。对于MaI4-08、MaI4-09、MaI4-05产生抗体的氨基，使用POD标记试剂盒(同人化学研究所)而实施POD标记处理。将得到的标记抗体用PBST各自稀释1000倍。将PVDF膜用PBST清洗后，向PVDF膜添加各自调制的上述抗体溶液，于室温反应1小时。将PVDF膜用PBST清洗后，使用ECL Prime Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)，用Image Quant Las4000检测信号。

结果得知，MaI4-08及MaI4-09产生抗体的任一方均在H-1、H-7、H-8、H-9及H-10中确认到信号。从而MaI4-08及MaI4-09产生抗体的表位存在于人IgG4的重链恒定区的第221位至第327位的氨基酸序列(图16及图17)。

再者，关于MaI4-08、MaI4-09产生抗体，在保留第299位的谷氨酸的条件(H-10、H-31、H-32、H-34、H-37)下确认到信号，在将第299位的谷氨酸取代为谷氨酰胺的条件(H-33、H-35、H-36、H-38)中确认不到信号。从而得知，MaI4-08、MaI4-09产生抗体的表位存在于必含人IgG4重链恒定区的第299位的谷氨酸残基的人IgG4重链恒定区的第221位至第327位的氨基酸序列(图18及图19)。

一方面，MaI4-05产生抗体仅在含第99～110位的氨基酸序列、即铰链区域的序列(H-1、H-2、H-3、H-4、H-5、H-7、H-12)确认到信号。从而得知，MaI4-05产生抗体的表位存在于人IgG4重链恒定区的99至第110位的氨基酸序列(图20)。

接下来示H-1～H-12、以及H-31～H-39的氨基酸序列。

【表12】

另外，各试剂的组成如下。

【表13】

SDS样品缓冲液

Tris	Sigma-Aldrich	125mM
			SDS	和光纯药工业	4％
蔗糖	和光纯药工业	10％
			溴酚蓝	NACALAI TESQUE	0.01％
DTT	Sigma-Aldrich	200mM

SDS电泳缓冲液

转录缓冲液

Tris	Sigma-Aldrich	3.03g/L
			甘氨酸	和光纯药工业	14.1g/L
SDS	和光纯药工业	0.1g/L

PBST(pH7.4)

磷酸二氢钠	和光纯药工业	10mM
			氯化钠	和光纯药工业	150mM
聚氧乙烯(20)山梨坦单月桂酸酯	和光纯药工业	0.05％

膜封闭缓冲液(pH7.4)

磷酸二氢钠	和光纯药工业	10mM
			氯化钠	和光纯药工业	150mM
聚氧乙烯(20)山梨坦单月桂酸酯	和光纯药工业	0.05％
			脱脂乳	和光纯药工业	5％

【产业上的利用可能性】

如以上详细地说明，在本发明的免疫测定法中，通过使用对于测定对象目的物质(人IgG4)高反应性及选择性的的抗体而使用来除去反应系中的竞争结合物质(IgG1～3等)的影响，可对目的物质特异性地进行精密测定。当使用本发明的抗人IgG4抗体时，能对试样中的人IgG4特异性地进行检测测定，在IgG4关联疾病等的诊断或临床检查的领域中极其有效。