细胞膜穿透肽
阅读说明：本技术 细胞膜穿透肽 (Cell membrane penetrating peptides ) 是由 远藤英树 石坂幸人 石黑亮 高品智记 山本卓 佐久间哲史 于 2018-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明的课题在于提供具有向细胞内的迁移性的细胞膜穿透肽。本发明人提供由序列号1所示的氨基酸序列构成的细胞膜穿透肽、由序列号2所示的氨基酸序列构成的细胞膜穿透肽和由序列号3所示的氨基酸序列构成的细胞膜穿透肽、以及包含该细胞膜穿透肽和功能性分子的复合物。(Disclosed is a cell membrane-penetrating peptide having a migration property into a cell. The present inventors provide a cell membrane-penetrating peptide comprising the amino acid sequence represented by sequence No. 1, a cell membrane-penetrating peptide comprising the amino acid sequence represented by sequence No. 2, and a cell membrane-penetrating peptide comprising the amino acid sequence represented by sequence No. 3, and a complex comprising the cell membrane-penetrating peptide and a functional molecule.)
技术领域
本发明涉及细胞膜穿透肽。
背景技术
细胞膜穿透肽是具有穿透细胞膜而移动至细胞内部的功能的肽。作为细胞膜穿透肽，以来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT为代表，已知穿透素(Penetratin)、寡聚精氨酸(Oligoarginine)、转运素(Transportan)、膜转导序列(membrane transductionsequence)等多种序列(Pharmacol.Ther.,2015,Vol.154,p.78-86)。另外，报道了从HIV-1的病毒蛋白R蛋白中含有的肽序列中发现的细胞膜穿透肽RIFIHFRIGC(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/108505号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供具有向细胞内的迁移性的新的细胞膜穿透肽。
用于解决问题的方法
本发明人在细胞膜穿透肽的制作方面反复进行了相当深入的研究，结果制作出新的细胞膜穿透肽(实施例1和2)，并发现该细胞膜穿透肽具有向细胞内的迁移性(实施例3和4)。结果，提供了上述细胞膜穿透肽，完成了本发明。
即，本发明包含以下的发明作为医学上或产业上有用的物质或方法。
[1]一种肽，其选自由下述(1)～(3)组成的组：
(1)由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽；
(2)由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽；和
(3)由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽。
[2]如[1]所述的肽，其由序列号1所示的氨基酸序列构成。
[3]如[1]所述的肽，其由序列号2所示的氨基酸序列构成。
[4]如[1]所述的肽，其由序列号3所示的氨基酸序列构成。
[5]一种复合物，其包含[1]所述的肽和功能性分子。
[6]一种多核苷酸，其包含编码[1]所述的肽的碱基序列。
[7]一种多核苷酸，其包含编码[5]所述的复合物的碱基序列。
发明效果
本发明的细胞膜穿透肽能够用于使任意的蛋白质穿透至细胞内。
附图说明
图1示出CPP-EGFP蛋白向细胞内的摄入能力。纵轴表示全部细胞中观察到由EGFP所致的发光的细胞数的比率。对照表示仅添加有溶剂的细胞组。误差线表示重复的3个被测试样的测定值的标准偏差。
图2示出由CPP-TALE-Activator引起的人TERT mRNA表达上升效果的比较。纵轴表示将作为对照的人TERT mRNA相对表达量设为1时的、由各被测试样引起的人TERT mRNA相对表达量。误差线表示重复的3个被测试样的测定值的标准偏差。
图3示出由NTP-TALE-VPR和TALE-VPR引起的人TERT mRNA表达上升效果的比较。纵轴表示将作为对照的人TERT mRNA相对表达量设为1时的、由各被测试样引起的人TERTmRNA相对表达量。误差线表示重复的3个被测试样的测定值的标准偏差。
图4A示出绿色荧光蛋白荧光检测体积排阻色谱(Green Fluorescent ProteinFluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography，GFP-FSEC)分析的结果。图中纵轴表示利用荧光强度测定的GFP融合蛋白量，横轴表示缓冲液的排除体积。示出(1)NTP-GST-EGFP、(2)NTP(C10Q)-GST-EGFP、(3)NTP(I8Q)-GST-EGFP、(4)NTP(ICQ2)-GST-EGFP各试样的结果。
图4B是将图4A所示的4个试样的结果重叠表示的图。
具体实施方式
以下对本发明进行详述。以下的实施方式是用于对本发明进行说明的例示，并非旨在将本发明仅限定于该实施方式。本发明只要不脱离其主旨，则可以以各种方式来实施。另外，本说明书包含作为本申请优先权要求的基础的2017年12月11日提交的日本专利申请(日本特愿2017-236660号)的说明书和附图中记载的内容。
1.本发明的细胞膜穿透肽
本发明的细胞膜穿透肽为选自由下述(1)～(3)组成的组中的肽。
(1)由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽；
(2)由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽；和
(3)由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽。
本说明书中的“细胞膜穿透肽”是指具有穿透细胞膜的功能的肽。是否穿透细胞膜可以使用公知的细胞膜穿透评价系统来确认。作为该评价系统，可以列举例如使用包含高灵敏度绿色荧光蛋白(EGFP)和被测肽的复合物的细胞内标记蛋白检测系统、以及使用包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽、转录调节因子和被测肽的复合物的基因表达评价系统。在使用包含EGFP和被测肽的复合物的情况下，例如可以以被摄入细胞内的EGFP的发光作为指标来评价被测肽的细胞膜穿透性。在使用包含DNA结合多肽、转录调节因子和被测肽的复合物的基因表达评价系统中，可以以靶标基因的表达量作为指标来评价被测肽的细胞膜穿透性。作为具体的评价方法，可以使用例如后述实施例3和4中记载的方法。
2.本发明的复合物
本发明的复合物为包含本发明的细胞膜穿透肽和功能性分子的复合物。
能够与本发明的细胞膜穿透肽组合的功能性分子广泛存在，只要显示功能性分子所具有的功能，则本发明的复合物中包含的功能性分子没有特别限定，可以列举例如低分子化合物、多核苷酸、多肽、脂质、糖质和其他高分子化合物、磁性粒子、脂质体等生理活性物质。
作为本发明的复合物中包含的多核苷酸，可以使用例如任意长度的DNA或核糖核酸(包括RNA、适配体)。该所使用的DNA或核糖核酸可以为天然物或人造物。多核苷酸可以为单链或双链。也可以使用多种多核苷酸。
在多核苷酸为DNA的情况下，可以使用编码显示生理活性的多肽的DNA。作为显示生理活性的多肽，可以列举例如激素、生长因子、酶、细胞因子、疫苗用抗原肽、受体、抗体、转录因子、结构蛋白、融合多肽等。
在多核苷酸为RNA的情况下，可以列举例如核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、时序小RNA(small temporal RNA，stRNA)、干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、前体miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)、小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)、病毒RNA(viralRNA)、反义RNA和信使RNA(messenger RNA，mRNA)。
作为本发明的复合物中包含的多肽，可以列举例如激素、生长因子、酶、细胞因子、疫苗用抗原肽、受体、抗体、转录因子、结构蛋白和融合多肽等。
在一个实施方式中，作为本发明的复合物中包含的融合多肽，可以列举例如被用作基因组编辑技术的融合多肽(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1996、Vol.93、p.1156-1160；Genetics、2010、Vol.186、p.757-761；Science、2013、Vol.339、p.819-823；Science、2013、Vol.339、p.823-826；Methods Mol.Biol.、2016、Vol.1469、p.147-155；Nat.Methods、2013、Vol.10、p.977-979)。在另一个实施方式中，本发明的复合物也包含编码该融合多肽的多核苷酸。
本发明的复合物中包含的细胞膜穿透肽和功能性分子可以直接结合，或者也可以通过接头间接地结合。
只要本发明的复合物穿透细胞膜且显示出功能性分子的功能，则用于将细胞膜穿透肽和功能分子结合的接头不受限定。
关于本发明的复合物的大小(直径、长度等)，只要是能够穿透细胞膜的大小则没有限定，例如为约0.1nm～约500nm的范围。另外，作为本发明的复合物中包含的功能性分子的长度，在功能性分子例如为RNA的情况下，可以列举约5000个核苷酸以下的长度，在功能性分子为DNA的情况下，可以列举约2万碱基对(以下简记为bp)以下的长度，在功能性分子为多肽的情况下，可以列举约3000个氨基酸以下的长度，但并不限定于此。
3.本发明的多核苷酸
本发明的多核苷酸包括：包含编码本发明的细胞膜穿透肽的碱基序列的多核苷酸、和包含编码本发明的复合物的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为选自由下述(1)～(3)组成的组中的多核苷酸：
(1)包含编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸；
(2)包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸；和
(3)包含编码由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸为选自由下述(1)～(3)组成的组中的多核苷酸：
(1)包含序列号33的碱基序号274至303的碱基序列的多核苷酸；
(2)包含序列号34的碱基序号274至303的碱基序列的多核苷酸；和
(3)包含序列号35的碱基序号274至303的碱基序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以基于以本发明的细胞膜穿透肽或本发明的复合物的氨基酸序列为基础而设计的碱基序列，利用该技术领域中公知的基因合成方法(例如J.Biol.Chem.、1982、Vol.257、p.9226-9229)进行合成。
4.本发明的表达载体
本发明的表达载体包括：含有包含编码本发明的细胞膜穿透肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码本发明的复合物的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体为选自由下述(1)～(3)组成的组中的、包含本发明的多核苷酸的表达载体：
(1)含有包含编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体；
(2)含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体；和
(3)含有包含编码由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
作为用于表达本发明的多核苷酸的表达载体，只要在真核细胞(例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如埃希氏菌属菌)的各种宿主细胞、或者无细胞蛋白质合成中使用的细胞提取液(以下称为无细胞蛋白质合成液，可以列举例如小麦胚芽提取液、大肠杆菌提取液、兔网织红细胞提取液和昆虫细胞提取液)中表达包含编码本发明的细胞膜穿透肽或本发明的复合物的碱基序列的多核苷酸、并且能够产生由这些多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可以列举例如质粒载体、病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、仙台病毒)等，优选可以使用pEU-E01-MCS(CellFreeSciences)、pET20b(+)(Novagen)、pCold vector-I(Takara Bio)。
本发明的表达载体可以包含以能够发挥功能的方式与本发明的多核苷酸连接的启动子。作为用于在动物细胞中表达本发明的多核苷酸的启动子，可以列举例如来源于巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)、猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)等病毒的启动子、肌动蛋白启动子、延伸因子(elongation factor，EF)1α启动子、热休克启动子等。作为用于在细菌(例如埃希氏菌属菌)中进行表达的启动子，可以列举例如trp启动子、lac启动子、λPL启动子、tac启动子、T3启动子、T7启动子、SP6启动子等。作为用于在酵母中进行表达的启动子，可以列举例如GAL1启动子、GAL10启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。作为用于在包含RNA聚合酶和核苷三磷酸的反应液中进行表达的启动子，可以列举例如上述的T3启动子、T7启动子、SP6启动子等。
在使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞的情况下、或者使用无细胞蛋白质合成液的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子和终止密码子。这种情况下，本发明的表达载体可以包含增强子序列、编码本发明的融合多肽的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接部、多聚腺苷化部位或可复制的单元等。在使用埃希氏菌属菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制的单元。这种情况下，本发明的表达载体可以根据目的包含通常使用的选择标志物(例如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
5.本发明的进行了转化的宿主细胞
本发明的进行了转化的宿主细胞包括：利用包含编码本发明的细胞膜穿透肽的碱基序列的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用包含编码本发明的复合物的碱基序列的表达载体进行了转化的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(1)～(3)组成的组中的、利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞：
(1)利用含有包含编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
(2)利用含有包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；和
(3)利用含有包含编码由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
作为进行转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、能够利用该表达载体进行转化并表达蛋白质，则没有特别限定。作为进行转化的宿主细胞，可以列举例如在本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如动物细胞(例如CHO细胞)、昆虫细胞(例如Sf9)、细菌(埃希氏菌属菌等)、酵母(酵母属、毕赤酵母属等)等)，优选可以使用CHO细胞、HEK293细胞、NS0细胞等动物细胞和埃希氏菌属菌。
对宿主细胞进行转化的方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法等。
6.生产本发明的细胞膜穿透肽的方法
本发明的细胞膜穿透肽可以利用该技术领域中公知的肽合成法或公知的基因工程方法来生产。作为肽合成法，可以列举例如固相合成法(Nature、2011、Vol.480、p.471-479)。作为基因工程方法，可以利用例如Methods in Enzymol.、1987、Vol.154、p.221-533和Philos.Trans.A Math.Phys.Eng.Sci.、2009、Vol.367、p.1705-1726等中所示的方法。
生产本发明的细胞膜穿透肽的方法可以包括：对本发明的宿主细胞进行培养而表达细胞膜穿透肽的步骤；或者使利用本发明的表达载体合成的mRNA与无细胞蛋白质合成液反应而表达细胞膜穿透肽的步骤。另外，生产本发明的细胞膜穿透肽的方法可以在包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养而表达细胞膜穿透肽的步骤、或者使利用本发明的表达载体合成的mRNA与无细胞蛋白质合成液反应而表达细胞膜穿透肽的步骤的基础上，还包括对表达的该细胞膜穿透肽进行回收、优选分离、纯化的步骤。作为分离或纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差异的方法、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱等利用带电的方法、亲和色谱等利用特异亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点差异的方法等。优选的是，培养上清中蓄积的细胞膜穿透肽可以通过各种色谱进行纯化。
进行了转化的宿主细胞的培养可以通过公知的方法来进行。培养条件、例如温度、培养基的pH和培养时间适当进行选择。通过对宿主细胞进行培养，能够生产本发明的细胞膜穿透肽。
本发明的细胞膜穿透肽还包括利用生产本发明的细胞膜穿透肽的方法生产的细胞膜穿透肽。
7.生产本发明的复合物的方法
本领域技术人员可以通过使用该领域中公知的结合方法使本发明的细胞膜穿透肽与功能性分子结合而容易地生产本发明的复合物(Nucleic Acids Res.、2009、Vol.37、p.2574-2583)。
生产本发明的复合物的方法包括利用在功能性分子的末端或内部存在的官能团，通过化学结合方法直接地或者借助接头间接地与细胞膜穿透肽结合的步骤。作为此时的化学结合方式，可以列举例如酰胺键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、S-S键等共价键，除此以外还可以列举离子键、静电键、分子间作用力、氢键等非共价键。
在通过化学结合方法进行结合的情况下，作为接头，只要具有例如在两端具有反应性基团、能够将两个分子连接的结构，则没有特别限定。作为该反应性基团，可以列举例如马来酰亚胺基、N-琥珀酰亚胺酯基、环氧基、亲和素基等。
在一个实施方式中，在功能性分子为DNA或RNA的情况下，可以利用例如二硫键将本发明的细胞膜穿透肽与DNA或RNA结合(FEBS Letters、2004、Vol.558、p.63-68)。另外，在一个实施方式中，可以通过鱼精蛋白等核酸结合性肽将本发明的细胞膜穿透肽与DNA或RNA结合(Theranostics、2017、Vol.7、p.2495-2508)。
在一个实施方式中，在功能性分子为抗体的情况下，可以使用例如马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)法(NanoBiotechnology Protocols、2005、Vol.2、p.88)、利用碳二亚胺的交联法(Methods in Enzymol.、2012、Vol.502、p.102)或共轭法(Wong S、Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking、CRC Press Inc.、Boca Raton、1993)等公知的方法，使本发明的细胞膜穿透肽与抗体结合。
另外，关于本发明的复合物，本领域技术人员可以使用该领域中公知的基因工程方法，由包含编码本发明的细胞膜穿透肽和功能性分子的碱基序列的多核苷酸容易地生产(Appl.Microbiol.Biotechnol.、2006、Vol.72、p.211、Appl.Microbiol.Biotechnol.、2016、Vol.100、p.5719-5728)。
在使用基因工程方法的情况下，生产本发明的复合物的方法包括：对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养而表达复合物的步骤、或者使利用本发明的表达载体合成的mRNA与无细胞蛋白质合成液反应而表达复合物的步骤。另外，生产本发明的复合物的方法可以在包括对本发明的进行了转化的宿主细胞进行培养而表达复合物的步骤、或者使利用本发明的表达载体合成的mRNA与无细胞蛋白质合成液反应而表达复合物的步骤的基础上，还包括对表达的该复合物进行回收、优选分离、纯化的步骤。作为分离或纯化方法，可以使用例如<6.生产本发明的细胞膜穿透肽的方法>中记载的方法。
本发明的复合物还包括利用生产本发明的复合物的方法生产的复合物。
8.本发明的药物组合物
本发明的药物组合物包括包含本发明的复合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂即药剂用赋形剂、药剂用载体等，利用通常使用的方法进行制备。作为这些药物组合物的剂型的示例，可以列举例如注射剂、点滴用剂等非经口剂，可以通过静脉内给药、皮下给药等进行给药。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体、添加剂等。
制剂化中的本发明的复合物的添加量根据患者的症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型或功能性分子而不同，例如可以使用约0.001mg/kg～约100mg/kg。
本发明的药物组合物可以根据本发明的复合物中包含的功能性分子的功能用于各种疾病的预防和/或治疗。例如，在复合物中包含的功能性分子为针对该疾病的治疗用的化合物、多核苷酸或多肽的情况下，本发明的药物组合物能够用于该疾病的治疗或预防。
本发明中，作为治疗或预防的对象的疾病可以根据本发明的复合物中包含的功能性分子的功能来选择，因此没有特别限定，可以列举例如癌症、免疫疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、心血管系统疾病等。
本发明包括包含本发明的复合物的、疾病的预防或治疗用药物组合物。另外，本发明包括包含对患者给药治疗有效量的本发明的复合物的步骤的、治疗或预防疾病的方法。另外，本发明包括用于疾病的预防或治疗的本发明的复合物。另外，本发明包括本发明的复合物在制造疾病的预防或治疗用药物组合物中的应用。
本发明中，患者只要是哺乳动物则没有限定，可以列举例如小鼠、大鼠、狗、猪、猴、人等。
虽然全面地对本发明进行了记载，但在此提供为了进一步获得理解而参考的特定实施例。这些实施例的目的在于例示，并非对本发明进行限定。
实施例
关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则按照附带的规程进行实验。另外，为方便起见，将浓度mol/L表示为M。例如，1M氢氧化钠水溶液是指1mol/L的氢氧化钠水溶液。
在以下的实施例中，有时将各种细胞膜穿透肽统称为“CPP”(CellPenetratingPeptide，细胞穿透肽)。另外，在以下的实施例中，“NTP”是指具有氨基酸序列RIFIHFRIGC(序列号4，国际公开第2008/108505号)的细胞膜穿透肽，是CPP的一种。在以下的实施例中，将NTP的第8位氨基酸残基I置换为Q而得到的肽称为“NTP(I8Q)”或“NTP8Q”，将NTP的N末端起第10位氨基酸残基C置换为Q而得到的肽称为“NTP(C10Q)”或“NTP10Q”，将NTP的N末端起第8位和第10位氨基酸残基均置换为Q而得到的肽称为“NTP(ICQ2)”。
实施例1
CPP-EGFP蛋白的制作
利用以下的方法制作包含各种细胞膜穿透肽(CPP)和EGFP的蛋白质(称为CPP-EGFP蛋白)。
(1)编码CPP-EGFP蛋白的表达质粒的制作
对于由编码从N末端起依次融合有NTP和谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)的包含EGFP的多肽(称为NTP-GST-EGFP，由序列号5所示的氨基酸序列构成)的碱基序列构成的多核苷酸(序列号7)，在5’末端附加限制酶KpnI位点和起始密码子序列，在3’末端附加终止密码子序列和限制酶NotI位点，获得多核苷酸(序列号6)。用KpnI和NotI(Takara Bio)对上述多核苷酸进行限制酶处理，插入到pEU-E01-MCS质粒(CellFreeSciences)的多克隆位点上存在的KpnI和NotI位点之间。将由此得到的表达质粒称为pEU-E01-NTP-GST-EGFP。通过对该表达质粒进行现有的琼脂糖电泳法和序列分析，确认到克隆出了所期望的DNA构建体。
接着，以pEU-E01-NTP-GST-EGFP作为模板，使用由序列号8和9所示的碱基序列构成的引物进行反向PCR(从环状多核苷酸的一个区域朝向外侧设计引物，对环状化的多核苷酸整体进行扩增的PCR法)。由此，合成出包含编码将NTP-GST-EGFP的NTP的第8位氨基酸残基I置换为Q的多肽(称为NTP(I8Q)-GST-EGFP)的碱基序列的多核苷酸。利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒(Takara Bio)将其环状化，由此制作出表达质粒pEU-E01-NTP(I8Q)-GST-EGFP。
同样地，以pEU-E01-NTP-GST-EGFP作为模板，使用由序列号10和11所示的碱基序列构成的引物进行反向PCR。由此，制作出包含编码将NTP-GST-EGFP的NTP的第10位氨基酸残基C置换为Q的多肽(称为NTP(C10Q)-GST-EGFP)的碱基序列的多核苷酸。利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒将其环状化，由此制作出表达质粒pEU-E01-NTP(C10Q)-GST-EGFP。
进一步，以pEU-E01-NTP(C10Q)-GST-EGFP作为模板，使用由序列号12和13所示的碱基序列构成的引物进行反向PCR。由此，制作出包含编码将NTP-GST-EGFP的NTP的第8位和第10位氨基酸残基均置换为Q的多肽(称为NTP(ICQ2)-GST-EGFP)的碱基序列的多核苷酸。利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒将其环状化，由此制作出表达质粒pEU-E01-NTP(ICQ2)-GST-EGFP。通过对这些表达质粒进行现有的琼脂糖电泳法和测序，确认到均得到了所期望的DNA构建体。
(2)CPP-EGFP蛋白的制作
以(1)中制作的4种表达质粒(pEU-E01-NTP-GST-EGFP、pEU-E01-NTP(I8Q)-GST-EGFP、pEU-E01-NTP(C10Q)-GST-EGFP和pEU-E01-NTP(ICQ2)-GST-EGFP)作为模板，利用以下的方法制作CPP-EGFP蛋白，并进行纯化。
使用WEPRO7240G表达试剂盒(CellFree Sciences)，使用(1)中制作的4种表达质粒3μg，以0.29mL的反应液量制作各蛋白质。在此制作的蛋白质的一部分在实施例5中使用。制作后，相对于反应液量添加0.1％的Empigen(注册商标)(Sigma)。进一步，添加用磷酸缓冲生理盐水饱和的谷胱甘肽琼脂糖4B(GE Healthcare)100μL，在4℃下振荡2小时。通过离心分离回收谷胱甘肽琼脂糖，悬浮到冰冷却的包含0.1％的Empigen(注册商标)的磷酸缓冲生理盐水1mL中。再次重复2次进行离心分离的操作。将回收的谷胱甘肽琼脂糖悬浮到含有150mM氯化钠的磷酸缓冲生理盐水1mL中。再次通过离心分离分离出谷胱甘肽琼脂糖。
接着，为了提取与谷胱甘肽琼脂糖结合的CPP-EGFP蛋白，进行以下的操作。即，在上述谷胱甘肽琼脂糖中添加包含30mM还原型谷胱甘肽(和光)的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0-9.0)80μL。每隔几分钟进行吹打的同时，在室温下静置30分钟，然后，通过离心分离回收上清。反复进行2次相同的操作。回收上清，由此获得各CPP-EGFP蛋白。在回收的上清中以终浓度20％添加甘油(Nacalai)并在冰上保存。使用SDS聚丙烯酰胺电泳法和考马斯亮蓝染色法，根据与并行泳动的BSA(Sigma fraction V)的比较推算出该上清中包含的各CPP-EGFP蛋白的浓度。
实施例2
CPP-TALE-Activator的制作
利用以下的方法制作包含CPP、按照与人TERT基因的增强子特异性结合的方式设计的类转录激活因子效应物(TALE)和转录激活因子的融合多肽(称为CPP-TALE-Activator)。需要说明的是，作为阴性对照，制作包含TALE和转录激活因子且不含CPP的融合多肽(以下也称为TALE-Activator)。
(1)表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV的制作
在表达质粒pEU-E01-MCS的多克隆位点，从5’侧起依次插入由编码GST的碱基序列构成的多核苷酸(序列号15)、由编码NTP的碱基序列构成的多核苷酸(序列号14)、由编码TEV蛋白酶的靶标肽(以下表示为TEV)的碱基序列构成的多核苷酸(序列号16)。
具体而言，合成出在由序列号15所示的碱基序列构成的多核苷酸的5’末端附加有限制酶EcoRV位点、在3’末端附加有限制酶BamHI位点的多核苷酸。使用EcoRV和BamHI在表达质粒pEU-E01-MCS中插入上述多核苷酸，由此制作表达质粒pEU-E01-GST。接着，制作从5’末端侧起依次包含限制酶BamHI位点序列、编码NTP的碱基序列(序列号14)、编码TEV的碱基序列(序列号16)、限制酶XhoI位点序列、限制酶SgfI位点序列、限制酶PmeI位点序列、限制酶NotI位点序列和限制酶SalI位点序列的多核苷酸(其中，为了符合所编码的氨基酸序列的框架，在XhoI位点与SgfI位点之间插入了胞嘧啶)。使用BamHI和SalI，将上述多核苷酸插入到表达质粒pEU-E01-GST中。然后，使用由序列号17和18所示的碱基序列构成的引物进行反向PCR，制作表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV。
(2)质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64V的制作
利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒，紧挨在(1)中制作的表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV的、编码TEV的碱基序列之后插入由序列号19所示的碱基序列构成的多核苷酸(包含编码TALE的一部分的碱基序列和编码VP64(序列号21)的碱基序列，称为ΔTALE-VP64)，由此得到质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64V。由于在VP64的C末端附加有缬氨酸，因此在名称的末尾带有V。
(3)以人TERT基因作为靶标的TALE的制作
利用公知的数据库Ensembl genome browser检索作为端粒酶的亚基的人TERT基因(登录号AH007699.2)的周边序列。从预测作为增强子发挥作用的该基因的转录起始点的下游约4万bp的基因区域中选择出登录号AH007699.2的碱基序号49444～49461的碱基序列(序列号20所示的碱基序列)作为TALE的靶标碱基序列。利用公知的方法(Platinum GateTALEN construction protocol(Yamamoto lab)Ver.1.0[2017年1月26日检索]、互联网<URL:https://www.addgene.org/static/cms/files/Platinum_Gate_protocol.pdf>)，制作包含编码按照与序列号20所示的碱基序列特异性结合的方式设计的DNA结合多肽的碱基序列的多核苷酸(包含序列号22的碱基序号429～2064的碱基序列的多核苷酸)。然后，使用T4 DNA连接酶(快速连接试剂盒：New England BioLabs)，将(2)中制作的质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-ΔTALE-VP64V中包含的由序列号19的碱基序号435～889的碱基序列构成的多核苷酸置换为由上述序列号22的碱基序号429～2064的碱基序列构成的多核苷酸。由此，获得包含编码由序列号23所示的氨基酸序列构成的DNA结合多肽(也称为TALE_TERT-1)的碱基序列所构成的多核苷酸(由序列号22所示的碱基序列构成)的质粒。需要说明的是，序列号23的氨基酸序号7～784的氨基酸序列是按照与序列号20所示的碱基序列结合的方式设计的、包含TALE的DNA结合重复部分和胸腺嘧啶结合部分的多肽部分。将该质粒称为pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64V。
(4)编码CPP-TALE-Activator的表达质粒的制作
以(3)中制作的表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64V作为模板，使用PrimeSTAR(注册商标)Max DNA聚合酶(Takara Bio)，使用由序列号24和25所示的碱基序列构成的引物进行PCR反应。由此，制作出在包含编码TALE和VP64的碱基序列的多核苷酸的5’末端侧附加有SgfI位点序列、在3’末端侧附加有NotI位点序列的多核苷酸。将该多核苷酸称为TALE-VP64。用SgfI和NotI将该TALE-VP64切断，插入到(1)中制作的表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV的限制酶位点SgfI和NotI之间，制作出表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64。
以SP-dCas9-VPR(Addgene)作为模板，使用PrimeSTAR(注册商标)Max DNA聚合酶，使用由序列号26和27所示的碱基序列构成的引物进行PCR反应。由此，在编码VPR(序列号28)的多核苷酸的5’末端侧附加CGCGCGTCAGCCAGC(序列号29)、在3’末端侧附加GTTTAAACTGCGGCC(序列号30)。将该多核苷酸称为VPR-PCR。
接着，以表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VP64作为模板，使用由序列号31和32所示的碱基序列构成的引物进行PCR反应。由此，制作出除去了编码VP64的碱基序列、并且在3’侧附加有CGCGCGTCAGCCAGC(序列号29)、在5’侧附加有GTTTAAACTGCGGCC(序列号30)的多核苷酸。将该多核苷酸称为pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-PCR。
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒，将pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-PCR和VPR-PCR以1：10的摩尔比连接。由此，制作出编码转录激活因子VPR的表达质粒。将该表达质粒称为pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR。通过对该表达质粒进行现有的琼脂糖电泳法和测序，确认到克隆出了所期望的构建体。
接着，利用AsiSI(New England Biolabs)和SwaI(Takara Bio)对pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR进行限制酶处理。
合成分别由序列号33、34和35所示的碱基序列构成的多核苷酸，利用AsiSI和SwaI分别进行限制酶处理。进行琼脂糖电泳，切出约340个碱基的多核苷酸片段，使用FastGene凝胶/PCR提取试剂盒(日本Genetics、FG91202)进行纯化。利用T4 DNA连接酶(Takara Bio)将该多核苷酸片段分别连接到用AsiSI和SwaI切断后的表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR上。通过热处理将连接得到的质粒导入到Stbl感受态细胞(New EnglandBiolabs)中，在含100μg/mL氨苄青霉素(Sigma)的LB培养基琼脂板(由含有10g/L Bacto胰蛋白胨(BD)、5g/L Bacto酵母提取物(BD)、10g/L氯化钠(和光)的水溶液和1.5％琼脂糖(和光)构成)(以下称为LA板)上在30℃下培养过夜。从所得到的菌落中纯化质粒，得到表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR的编码NTP的多核苷酸区域分别被置换为编码序列号1、2和3的多核苷酸的pEU-E01-GST-NTP(ICQ2)-TALE-VPR、pEU-E01-GST-NTP8Q-TALE-VPR和pEU-E01-GST-NTP10Q-TALE-VPR。通过进行序列分析，确认到正确地制作了上述构建体。
(5)CPP-TALE-Activator的制作
以(4)中制作的编码各种CPP-TALE-Activator的表达质粒(pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR、pEU-E01-GST-NTP8Q-TALE-VPR、pEU-E01-GST-NTP10Q-TALE-VPR和pEU-E01-GST-NTP(ICQ2)-TALE-VPR)作为模板，利用WEPRO7240G表达试剂盒通过以下的方法制作CPP-TALE-Activator，并进行纯化。
使用WEPRO7240G表达试剂盒，使用(4)中制作的CPP-TALE-Activator的表达质粒1μg(实施例4(2)中使用的NTP-TALE-VPR的表达质粒为3μg)，以0.29mL的反应液量制作各蛋白质。制作后，相对于反应液量添加0.1％的Empigen。进一步，添加用磷酸缓冲生理盐水饱和的谷胱甘肽琼脂糖4B 60μL(对于制作实施例4(2)中使用的NTP-TALE-VPR的反应液为100μL)，在4℃下振荡2小时。通过离心分离回收谷胱甘肽琼脂糖，悬浮到冰冷却的磷酸缓冲生理盐水1mL中。再次重复2次进行离心分离的操作。将回收的谷胱甘肽琼脂糖悬浮到含有150mM氯化钠的磷酸缓冲生理盐水1mL中。再次通过离心分离分离出谷胱甘肽琼脂糖。
接着，为了提取与谷胱甘肽琼脂糖结合的CPP-TALE-Activator，进行以下的操作。即，在上述谷胱甘肽琼脂糖中添加包含30mM还原型谷胱甘肽(和光)的50mM Tris盐酸缓冲液(pH 8.0-9.0)80μL。在室温下振荡1分钟后，通过离心分离回收上清。反复进行2次相同的操作。回收上清，由此获得CPP-TALE-Activator。使用SDS聚丙烯酰胺电泳法和考马斯亮蓝染色法，根据与并行泳动的BSA的比较推算出所回收的上清中包含的CPP-TALE-Activator蛋白浓度。
将由pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR、pEU-E01-GST-NTP8Q-TALE-VPR、pEU-E01-GST-NTP10Q-TALE-VPR和pEU-E01-GST-NTP(ICQ2)-TALE-VPR获得的多肽分别称为NTP-TALE-VPR、NTP8Q-TALE-VPR、NTP10Q-TALE-VPR和NTPICQ2-TALE-VPR。
(6)TALE-Activator的制作
作为实施例4的阴性对照，制作出编码包含TALE和VPR且不含CPP的融合多肽(称为TALE-VPR)的表达质粒。
以(4)中制作的表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR作为模板，使用PrimeSTAR(注册商标)Max DNA聚合酶，使用由序列号36和37所示的碱基序列构成的引物进行反向PCR。由此，合成出从表达质粒pEU-E01-GST-NTP-TEV-TALE-VPR中仅将编码NTP和TEV的碱基序列部分除去的多核苷酸。使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Plus试剂盒，使该多核苷酸自连接，制作出表达质粒pEU-E01-GST-TALE-VPR。并且，通过琼脂糖电泳法和测序确认到，得到了所期望的构建体。
利用与“(5)CPP-TALE-Activator的制作”中记载的方法同样的方法，以表达质粒pEU-E01-GST-TALE-VPR作为模板，利用WEPRO7240G表达试剂盒制作出TALE-VPR，并进行纯化。
实施例3
细胞膜穿透性实验(EGFP实验)
将人肺癌来源细胞A549(ATCC(注册商标)CCL-185)悬浮到含有10％胎牛血清(GEHealthcare)、1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)的RPMI培养基(ThermoFisher Scientific)中，以0.2×104个细胞/100μL/孔接种到96孔培养板(岩城硝子)中。培养36小时后，在各孔中添加实施例1中制作的NTP-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP、NTP(C10Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP各蛋白质3-3.7μL，使最终浓度为30nM。作为阴性对照，将EGFP(Funakoshi)用磷酸缓冲生理盐水调节浓度至最终浓度同样为30nM，添加3μL。对照仅添加磷酸缓冲生理盐水3μL。24小时后用各孔100μL的磷酸缓冲生理盐水对细胞进行清洗。添加上述培养基100μL，使用全功能(ALL-IN-ONE)荧光显微镜BZ-8100(KEYENCE)，在10倍放大镜检下测量观察到由GFP产生的绿色发光的细胞数。关于测量方法，由镜检的图像计数出相同的一定视野中的绿色发光细胞数，将其除以同样测量的视野中存在的总细胞数，求出3次测量的平均值，由此，对上述融合蛋白组穿透到细胞内而起作用的细胞数进行比较。
将结果示于图1。确认到：NTP-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP、NTP(C10Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP与对照和EGFP相比，GFP阳性细胞数高。由以上表明，由序列号1、2和3所示的氨基酸序列构成的肽具有细胞膜穿透性。
实施例4
(1)添加CPP-TALE-Activator时的细胞内人TERT mRNA表达量的测定
使用微量透析柱(TOMY)，在4℃下将实施例2中制作的CPP-TALE-Activator(NTP-TALE-VPR、NTPICQ2-TALE-VPR、NTP8Q-TALE-VPR和NTP10Q-TALE-VPR)在OPTIMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中透析3小时。纯化后的浓度为50nM。
将人脐带基质来源间充质干细胞(PromoCell C-12971，以下称为UC-MSC)用MSCGM-CD间充质干细胞增殖培养基BulletKit(LONZA Japan、00190632)悬浮，以0.4×104个细胞/100μL/孔接种到I型胶原蛋白包被的96孔透明培养板(Corning)中。在设定为CO2浓度5％、37℃的CO2温箱内静置12小时后，以最终浓度分别为0.25、1、3、10和30nM的方式添加240nM的各CPP-TALE-Activator。在37℃、CO2浓度5％的温箱内静置24小时。作为对照，制作不添加CPP-TALE-Activator的孔。
利用以下的方法测定24小时后的细胞内的人TERT mRNA表达量。从上述培养细胞的各孔中除去培养上清，用冰冷却的磷酸缓冲生理盐水清洗一次。然后，在各孔中添加Ambion(注册商标)Power SYBR Cells-to-CTTM试剂盒(Thermo Fisher Scientific)附带的溶解液(裂解液24.5μL和DNaseI 0.5μL的混合溶液)25μL，与细胞混合。在室温下静置5分钟后，在各孔中添加2.5μL上述试剂盒附带的终止溶液，在室温下静置2分钟。由此得到包含从细胞中提取的RNA的细胞溶解液。
以上述细胞溶解液作为模板，使用上述试剂盒附带的逆转录酶，按照其规程由RNA制作cDNA。接着，使用下述引物和上述试剂盒附带的Power SYBR Green PCR Master Mix，利用CFX96 Touch实时PCR分析系统(Biorad)进行实时PCR，测定人TERT mRNA量。作为内源性对照基因，测定人肌动蛋白β(ACTB)mRNA量。将人TERT mRNA量除以人ACTB mRNA量得到的值作为人TERT mRNA相对表达量。算出将对照的人TERT mRNA相对表达量设为1时的各组的人TERTmRNA相对表达量。需要说明的是，对于同一试样，各实施3孔。
作为TERT正向引物和TERT反向引物，分别使用由序列号38和39所示的碱基序列构成的引物。另外，作为ACTB正向引物和ACTB反向引物，分别使用由序列号40和41所示的碱基序列构成的引物。
如图2所示，与未添加的UC-MSC相比，CPP-TALE-Activator添加组中，使细胞内的人TERT mRNA量最大增加至19倍。
(2)添加NTP-TALE-VPR和TALE-VPR时的细胞内人TERT mRNA表达量的测定
将UC-MSC悬浮到含有20％胎牛血清(GE Healthcare)、1％青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific)和2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)(以下称为20％FCS-DMEM培养基)中，以0.4×104个细胞/100μL/孔接种到96孔透明培养板(岩城硝子)中。在设定为CO2浓度5％、37℃的CO2温箱内静置12小时。添加用20％FCS-DMEM培养基调节浓度至300nM的NTP-TALE-VPR，使孔内终浓度为0.25nM。另外，以孔内终浓度为0.25、1、3、10和30nM的方式分别添加用20％FCS-DMEM培养基调节浓度至300nM的未添加CPP的阴性对照TALE-VPR。将它们在37℃、CO2浓度5％的温箱内静置24小时。需要说明的是，作为对照，制作不添加任何物质的孔。用冰冷却的磷酸缓冲生理盐水100μL清洗2次后，用液氮处理该培养板，将细胞冷冻。
将上述培养板在冰上静置使其融解，同时在各孔中添加TaqMan(注册商标)GeneExpression Cells-to-CTTM试剂盒(Thermo Fisher Scientific)附带的溶解液(裂解溶液29.7μL和DNaseI 0.3μL的混合溶液)30μL，与细胞混合。在室温下静置5分钟后，在各孔中添加3μL上述试剂盒附带的终止溶液，在室温下静置5分钟。由此得到包含从细胞中提取的RNA的细胞溶解液。
以上述细胞溶解液作为模板，使用TaqMan(注册商标)Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)，利用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR，测定人TERT mRNA量。作为内源性对照，测定人ACTB mRNA量。将人TERT mRNA量除以人ACTB mRNA量得到的值作为人TERT mRNA相对表达量。算出将对照的人TERT mRNA相对表达量设为1时的各组的人TERT mRNA相对表达量。需要说明的是，对于同一试样，各实施3孔。
作为人TERT的引物组，使用TERT FAM(Applied Biosystems、Hs00972648_g1)，人ACTB的引物组使用ACTB VIC(Applied Biosystems、Hs99999903_m1)。
如图3所示，TALE-VPR添加组与添加NTP-TALE-VPR的情况不同，未观察到细胞内的人TERT mRNA量的显著增加。
由(1)和(2)的结果可知，由CPP-TALE-Activator引起的细胞内的人TERT mRNA量的增加依赖于CPP所带来的细胞膜穿透性。由以上表明，由序列号1、2和3所示的氨基酸序列构成的肽具有细胞膜穿透性。
由上述实施例3和4的结果表明，本发明的肽能够将与肽结合的功能性分子送达细胞内。另外，由该结果表明，本发明的复合物能够迁移(穿透)到细胞内。此外还表明，利用本发明的肽迁移到细胞内的功能性分子和本发明的复合物在细胞内发挥其功能。
实施例5
CPP-EGFP蛋白的GFP-FSEC分析
为了研究实施例1中制作的各CPP-EGFP蛋白的聚集性，利用GFP-FSEC法进行各蛋白质的可溶级分的分析。
GFP-FSEC法是使用具备荧光检测器的高效液相色谱仪(HPLC)对GFP融合蛋白进行检测的方法。
HPLC中使用的器材为HPLC柱、自动进样器(SIL-HTC、岛津制作所)、用于给液的泵(LC-10ADVP、岛津制作所)、脱气机(DGU-14A、岛津制作所)、柱温箱(CTO-10ACVP、岛津制作所)和荧光检测器(RF-10AXL、岛津制作所)。作为HPLC柱，使用ENrichTMSEC650 10×300柱(Biorad)。检测器以Ex488nm、Em508nm进行设定。色谱图显示软件和S型函数计算软件分别使用LCSolutions ver.1.25(岛津制作所)和FSECplotter2(开源软件、TaizoAyase、https://libraries.io/github/TaizoAyase/FSECplotter2(2018年10月18日))。
向实施例1中制作的CPP-EGFP蛋白、即NTP-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP、NTP(C10Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP的粗制试样各25μL(含有CPP-EGFP蛋白5μg)中添加磷酸缓冲液75μL。在1.5mL微型管内混合，在4℃下以每分钟15000的转速离心分离15分钟，进行可溶级分的分离。将可溶级分分别转移至96孔板中，将各试样50μL依次添加到用磷酸缓冲液平衡后的柱中。以1.0mL/分钟的流速实施凝胶过滤色谱。利用S型函数计算软件FSECplotter2将检测出的GFP融合蛋白量按分子量进行绘图。
将结果示于图4A和图4B。在可溶级分中几乎未检测到NTP-GST-EGFP(图4B)。另一方面，NTP(I8Q)-GST-EGFP、NTP(C10Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP检测到显著低分子量的峰。因此确认到，与NTP-GST-EGFP相比，NTP(C10Q)-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP的溶解性得到改善。
另外，在本实施例的检测结果中，在高分子量和低分子量处观察到两个峰(图4A(1)-(4))。低分子量的峰为各CPP-EGFP蛋白，高分子量的峰表示聚集体。对这些峰的蛋白质的比率进行比较时确认到，NTP-GST-EGFP的高分子量与低分子量的峰为相同程度，与此相对，NTP(ICQ2)-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP和NTP(C10Q)-GST-EGFP按照该顺序低分子量的峰更大、高分子量的峰更小。
由以上的结果表明，NTP(C10Q)-GST-EGFP、NTP(I8Q)-GST-EGFP和NTP(ICQ2)-GST-EGFP各蛋白质与NTP-GST-EGFP相比，高分子量的聚集体的形成减少。
由于上述4种融合蛋白的GST-EGFP部分为相同的结构，因此确认到，与NTP相比，本发明的细胞膜穿透性多肽NTP(I8Q)、NTP(C10Q)和NTP(ICQ2)使融合的蛋白质的聚集性降低而改善了溶解性，赋予了对融合蛋白的生产、纯化有用的性质。
产业上的可利用性
本发明的细胞膜穿透肽被期待对于功能性分子向细胞内的送达有用。本发明的复合物被期待作为各种试剂和药物组合物的构成成分有用。另外，生产本发明的多核苷酸、表达载体、进行了转化的宿主细胞和蛋白质的方法被期待对于上述细胞膜穿透肽和上述复合物的生产有用。
序列表自由文本
以下的序列表的数字标题<223>中记载“人工序列”的说明。具体而言，序列号1、2、3和4所示的氨基酸序列分别是NTP(ICQ2)、NTP(I8Q)、NTP(C10Q)和NTP的氨基酸序列。序列号5所示的氨基酸序列是NTP-GST-EGFP的氨基酸序列。序列号6所示的碱基序列是在由序列号7所示的碱基序列构成的多核苷酸的5’末端附加有限制酶KpnI位点和起始密码子序列、在3’末端附加有终止密码子序列和限制酶NotI位点的多核苷酸的碱基序列。序列号7所示的碱基序列是编码NTP-GST-EGFP的碱基序列。序列号8-13、17、18、24-27、31、32、36-41所示的碱基序列是各引物的碱基序列。序列号14所示的碱基序列是编码NTP的碱基序列。序列号16所示的碱基序列是编码TEV的碱基序列。序列号19所示的碱基序列是ΔTALE-VP64的碱基序列。序列号21所示的氨基酸序列是VP64的氨基酸序列。序列号22所示的碱基序列是TALE_TERT-1的碱基序列，序列号23所示的氨基酸序列是由序列号22所示的碱基序列编码的TALE_TERT-1的氨基酸序列。序列号28所示的氨基酸序列是VPR的氨基酸序列。序列号29和30所示的碱基序列分别是VPR-PCR的5’末端侧和3’末端侧的碱基序列。序列号33所示的碱基序列是包含编码NTP(ICQ2)的碱基序列的多核苷酸的碱基序列。序列号34所示的碱基序列是包含编码NTP(I8Q)的碱基序列的多核苷酸的碱基序列。序列号35所示的碱基序列是包含编码NTP(C10Q)的碱基序列的多核苷酸的碱基序列。
序列表
<110> 安斯泰来制药株式会社(Astellas Pharma Inc.)
国立大学法人广岛大学(Hiroshima University)
国立研究开发法人国立国际医疗研究中心(National Center for Global Healthand Medicine)
<120> 新型细胞膜穿透肽(Novel cell penetrating peptide)
<130> A18016A00
<150> JP2017236660
<151> 2017-12-11
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(ICQ2)
<400> 1
Arg Ile Phe Ile His Phe Arg Gln Gly Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(I8Q)
<400> 2
Arg Ile Phe Ile His Phe Arg Gln Gly Cys
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(C10Q)
<400> 3
Arg Ile Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP
<400> 4
Arg Ile Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP-GST-EGFP
<400> 5
Met Arg Ile Phe Ile His Phe Arg Ile Gly Cys Ser Pro Ile Leu Gly
1 5 10 15
Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu
20 25 30
Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly
35 40 45
Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn
50 55 60
Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala
65 70 75 80
Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro
85 90 95
Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile
100 105 110
Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu
115 120 125
Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu
130 135 140
Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His
145 150 155 160
Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp
165 170 175
Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg
180 185 190
Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr
195 200 205
Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp
210 215 220
His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Val Ser
225 230 235 240
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
245 250 255
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu
260 265 270
Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
275 280 285
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
290 295 300
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp
305 310 315 320
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
325 330 335
Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
340 345 350
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
355 360 365
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn
370 375 380
Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
385 390 395 400
Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu
405 410 415
Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu
420 425 430
Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp
435 440 445
Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala
450 455 460
Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
465 470 475
<210> 6
<211> 1445
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KpnI-NTP-GST-EGFP-NotI
<400> 6
ggtaccatgc ggatcttcat ccacttccgg atcggctgct cccctatact aggttattgg 60
aaaattaagg gccttgtgca acccactcga cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat 120
gaagagcatt tgtatgagcg cgatgaaggt gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg 180
ggtttggagt ttcccaatct tccttattat attgatggtg atgttaaatt aacacagtct 240
atggccatca tacgttatat agctgacaag cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag 300
cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga 360
attgcatata gtaaagactt tgaaactctc aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa 420
atgctgaaaa tgttcgaaga tcgtttatgt cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta 480
acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg 540
tgcctggatg cgttcccaaa attagtttgt tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa 600
attgataagt acttgaaatc cagcaagtat atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc 660
acgtttggtg gtggcgacca tcctccaaaa tcggatctgg aagttctgtt ccaggggccc 720
gtgtccaagg gcgaggaact gttcacaggc gtggtgccca tcctggtgga actggacggg 780
gatgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg aaggcgacgc cacatatggc 840
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccttg gcctaccctc 900
gtgaccacac tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagcagat accccgacca tatgaagcag 960
cacgacttct tcaagagcgc catgcccgag ggctacgtgc aggaacggac catcttcttt 1020
aaggacgacg gcaactacaa gaccagggcc gaagtgaagt tcgagggcga caccctcgtg 1080
aaccggatcg agctgaaggg catcgacttc aaagaggacg gcaacatcct gggccacaag 1140
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtg tacatcatgg ccgacaagca gaaaaacggc 1200
atcaaagtga acttcaagat ccggcacaac atcgaggacg gctccgtgca gctggccgac 1260
cactaccagc agaacacccc catcggagat ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1320
ctgagcacac agagcgccct gagcaaggac cccaacgaga agcgggacca catggtgctg 1380
ctggaattcg tgaccgccgc tggcatcacc ctgggcatgg acgagctgta caagtgagcg 1440
gccgc 1445
<210> 7
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP-GST-EGFP
<400> 7
atgcggatct tcatccactt ccggatcggc tgctccccta tactaggtta ttggaaaatt 60
aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag 120
catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg 180
gagtttccca atcttcctta ttatattgat ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc 240
atcatacgtt atatagctga caagcacaac atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca 300
gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg gatattagat acggtgtttc gagaattgca 360
tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg 420
aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa acatatttaa atggtgatca tgtaacccat 480
cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg 540
gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa aaacgtattg aagctatccc acaaattgat 600
aagtacttga aatccagcaa gtatatagca tggcctttgc agggctggca agccacgttt 660
ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat ctggaagttc tgttccaggg gcccgtgtcc 720
aagggcgagg aactgttcac aggcgtggtg cccatcctgg tggaactgga cggggatgtg 780
aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgaaggcg acgccacata tggcaagctg 840
accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cttggcctac cctcgtgacc 900
acactgacct acggcgtgca gtgcttcagc agataccccg accatatgaa gcagcacgac 960
ttcttcaaga gcgccatgcc cgagggctac gtgcaggaac ggaccatctt ctttaaggac 1020
gacggcaact acaagaccag ggccgaagtg aagttcgagg gcgacaccct cgtgaaccgg 1080
atcgagctga agggcatcga cttcaaagag gacggcaaca tcctgggcca caagctggag 1140
tacaactaca acagccacaa cgtgtacatc atggccgaca agcagaaaaa cggcatcaaa 1200
gtgaacttca agatccggca caacatcgag gacggctccg tgcagctggc cgaccactac 1260
cagcagaaca cccccatcgg agatggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 1320
acacagagcg ccctgagcaa ggaccccaac gagaagcggg accacatggt gctgctggaa 1380
ttcgtgaccg ccgctggcat caccctgggc atggacgagc tgtacaag 1428
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tccggcaggg ctgctcccct atactagg 28
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
agcagccctg ccggaagtgg atgaagatcc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
atcggccagt cccctatact aggttattgg 30
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
aggggactgg ccgatccgga agtggatgaa g 31
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
tccggcaggg ccagtcccct atactagg 28
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
actggccctg ccggaagtgg atgaagtgga tg 32
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP
<400> 14
aggatcttca tccacttccg gatcggctgc 30
<210> 15
<211> 687
<212> DNA
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400> 15
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggaagttc tgttccaggg gcccctg 687
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV
<400> 16
gaaaacctgt atttccaatc t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gtcacagctt gtctgtaagc g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
aaagggcctc gtgatacgcc t 21
<210> 19
<211> 1687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> deltaTALE-VP64
<400> 19
accatgatcc acggagtccc agcagccgta gatttgagaa ctttgggata ttcacagcag 60
cagcaggaaa agatcaagcc caaagtgagg tcgacagtcg cgcagcatca cgaagcgctg 120
gtgggtcatg ggtttacaca tgcccacatc gtagccttgt cgcagcaccc tgcagccctt 180
ggcacggtcg ccgtcaagta ccaggacatg attgcggcgt tgccggaagc cacacatgag 240
gcgatcgtcg gtgtggggaa acagtggagc ggagcccgag cgcttgaggc cctgttgacg 300
gtcgcgggag agctgagagg gcctcccctt cagctggaca cgggccagtt gctgaagatc 360
gcgaagcggg gaggagtcac ggcggtcgag gcggtacacg cgtggcgcaa tgcgctcacg 420
ggagcacccc tcaaggagac gggcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600
ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattgggtac 660
cgggcccccc ctcgaggtcc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct 720
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 780
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 840
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccaccg gtcgtctcca cccctgagca 900
ggtagtggct attgcatccc acgacggggg cagacccgca ctggagtcaa tcgtggccca 960
gctctcgagg ccggaccccg cgctggccgc actcactaat gatcatcttg tagcgctggc 1020
ctgcctcggc ggacgacccg ccttggatgc ggtgaagaag gggctcccgc acgcgcctgc 1080
attgattaag cggaccaaca gaaggatccc cgagaggaca tcacatcgag tggcagatca 1140
cgcgcaagtg gtccgcgtgc tcggattctt ccagtgtcac tcccaccccg cacaagcgtt 1200
cgatgacgcc atgactcaat ttggtatgtc gagacacgga ctgctgcagc tctttcgtag 1260
agtcggtgtc acagaactgg aggcccgctc gggcacactg cctcccgcct cccagcggtg 1320
ggacaggatt ctccaagcga gcggtatgaa acgcgcgaag ccttcaccta cgtcaactca 1380
gacacctgac caggcgagcc ttcatgcgtt cgcagactcg ctggagaggg atttggacgc 1440
gccctcgccc atgcatgaag gggaccaaac tcgcgcgtca gccagcccca agaagaagag 1500
aaaggtggag gccagcggtt ccggacgggc tgacgcattg gacgattttg atctggatat 1560
gctgggaagt gacgccctcg atgattttga ccttgacatg cttggttcgg atgcccttga 1620
tgactttgac ctcgacatgc tcggcagtga cgcccttgat gatttcgacc tggacatgct 1680
ggtttaa 1687
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
tcagagggac gcagtctt 18
<210> 21
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VP64
<400> 21
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
35 40 45
Met Leu
50
<210> 22
<211> 2661
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TALE_TERT-1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2661)
<400> 22
atc cac gga gtc cca gca gcc gta gat ttg aga act ttg gga tat tca 48
Ile His Gly Val Pro Ala Ala Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser
1 5 10 15
cag cag cag cag gaa aag atc aag ccc aaa gtg agg tcg aca gtc gcg 96
Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala
20 25 30
cag cat cac gaa gcg ctg gtg ggt cat ggg ttt aca cat gcc cac atc 144
Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile
35 40 45
gta gcc ttg tcg cag cac cct gca gcc ctt ggc acg gtc gcc gtc aag 192
Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Lys
50 55 60
tac cag gac atg att gcg gcg ttg ccg gaa gcc aca cat gag gcg atc 240
Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala Ile
65 70 75 80
gtc ggt gtg ggg aaa cag tgg agc gga gcc cga gcg ctt gag gcc ctg 288
Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu
85 90 95
ttg acg gtc gcg gga gag ctg aga ggg cct ccc ctt cag ctg gac acg 336
Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr
100 105 110
ggc cag ttg ctg aag atc gcg aag cgg gga gga gtc acg gcg gtc gag 384
Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val Glu
115 120 125
gcg gta cac gcg tgg cgc aat gcg ctc acg gga gca ccc ctc aac ctg 432
Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu
130 135 140
acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 480
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
145 150 155 160
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac 528
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
165 170 175
ggc ctg acc cca gaa cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc 576
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
180 185 190
aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag 624
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
195 200 205
gcc cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac 672
Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
210 215 220
gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg cct gtg ctg 720
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
225 230 235 240
tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca gcc cag gtt gtg gcc atc gcc agc 768
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
245 250 255
aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg 816
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
260 265 270
gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att 864
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile
275 280 285
gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg 912
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
290 295 300
ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc cca gaa caa gtt gtc 960
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val
305 310 315 320
gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag 1008
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
325 330 335
aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca gac caa 1056
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
340 345 350
gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca 1104
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
355 360 365
gtc cag aga ttg ttg cct gtg ctg tgc caa gcc cac ggc ctg acc cca 1152
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
370 375 380
gcc cag gtt gtg gcc atc gcc agc aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc 1200
Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
385 390 395 400
gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg 1248
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
405 410 415
acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag 1296
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
420 425 430
gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gac cac 1344
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
435 440 445
ggc ctg acc cca gaa caa gtt gtc gcg att gca agc aac aac gga ggc 1392
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
450 455 460
aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg ttg ccg gtg ctg tgc caa 1440
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
465 470 475 480
gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag gtg gtt gca atc gcg tca cac gat 1488
Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
485 490 495
ggg gga aag cag gcc cta gaa acc gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg 1536
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
500 505 510
tgc cag gcc cac ggc ctg acc cca gcc cag gtt gtg gcc atc gcc agc 1584
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
515 520 525
aac ata ggt ggc aag cag gcc ctc gaa acc gtc cag aga ctg tta ccg 1632
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
530 535 540
gtt ctc tgc cag gac cac ggc ctg acc cca gac caa gtt gtc gcg att 1680
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile
545 550 555 560
gca agc aac aac gga ggc aaa caa gcc tta gaa aca gtc cag aga ttg 1728
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
565 570 575
ttg ccg gtg ctg tgc caa gac cac ggc ctg acc ccc gaa cag gtt gtc 1776
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val
580 585 590
gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg gaa aca gtt cag 1824
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
595 600 605
cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gcc cac ggc ctg acc ccg gac cag 1872
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
610 615 620
gtg gtt gca atc gcg tca cac gat ggg gga aag cag gcc cta gaa acc 1920
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
625 630 635 640
gtt cag cga ctc ctg ccc gtc ctg tgc cag gcc cac ggc ctg acc ccc 1968
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
645 650 655
gcc cag gtt gtc gct att gct agt aac ggc gga ggc aaa cag gcg ctg 2016
Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
660 665 670
gaa aca gtt cag cgc ctc ttg ccg gtc ttg tgt cag gac cac ggc ctg 2064
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
675 680 685
acc cct gag cag gta gtg gct att gca tcc cac gac ggg ggc aga ccc 2112
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Arg Pro
690 695 700
gca ctg gag tca atc gtg gcc cag ctc tcg agg ccg gac ccc gcg ctg 2160
Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu
705 710 715 720
gcc gca ctc act aat gat cat ctt gta gcg ctg gcc tgc ctc ggc gga 2208
Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly
725 730 735
cga ccc gcc ttg gat gcg gtg aag aag ggg ctc ccg cac gcg cct gca 2256
Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Ala
740 745 750
ttg att aag cgg acc aac aga agg atc ccc gag agg aca tca cat cga 2304
Leu Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg
755 760 765
gtg gca gat cac gcg caa gtg gtc cgc gtg ctc gga ttc ttc cag tgt 2352
Val Ala Asp His Ala Gln Val Val Arg Val Leu Gly Phe Phe Gln Cys
770 775 780
cac tcc cac ccc gca caa gcg ttc gat gac gcc atg act caa ttt ggt 2400
His Ser His Pro Ala Gln Ala Phe Asp Asp Ala Met Thr Gln Phe Gly
785 790 795 800
atg tcg aga cac gga ctg ctg cag ctc ttt cgt aga gtc ggt gtc aca 2448
Met Ser Arg His Gly Leu Leu Gln Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr
805 810 815
gaa ctg gag gcc cgc tcg ggc aca ctg cct ccc gcc tcc cag cgg tgg 2496
Glu Leu Glu Ala Arg Ser Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gln Arg Trp
820 825 830
gac agg att ctc caa gcg agc ggt atg aaa cgc gcg aag cct tca cct 2544
Asp Arg Ile Leu Gln Ala Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro
835 840 845
acg tca act cag aca cct gac cag gcg agc ctt cat gcg ttc gca gac 2592
Thr Ser Thr Gln Thr Pro Asp Gln Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp
850 855 860
tcg ctg gag agg gat ttg gac gcg ccc tcg ccc atg cat gaa ggg gac 2640
Ser Leu Glu Arg Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp
865 870 875 880
caa act cgc gcg tca gcc agc 2661
Gln Thr Arg Ala Ser Ala Ser
885
<210> 23
<211> 887
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体(Synthetic Construct)
<400> 23
Ile His Gly Val Pro Ala Ala Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser
1 5 10 15
Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala
20 25 30
Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile
35 40 45
Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Lys
50 55 60
Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Ala Ile
65 70 75 80
Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu
85 90 95
Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr
100 105 110
Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Val Glu
115 120 125
Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu
130 135 140
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
145 150 155 160
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
165 170 175
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly
180 185 190
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
195 200 205
Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn
210 215 220
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
225 230 235 240
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
245 250 255
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
260 265 270
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile
275 280 285
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
290 295 300
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val
305 310 315 320
Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
325 330 335
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
340 345 350
Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
355 360 365
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
370 375 380
Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
405 410 415
Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln
420 425 430
Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His
435 440 445
Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly
450 455 460
Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln
465 470 475 480
Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp
485 490 495
Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu
500 505 510
Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser
515 520 525
Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro
530 535 540
Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile
545 550 555 560
Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu
565 570 575
Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val
580 585 590
Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln
595 600 605
Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Asp Gln
610 615 620
Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr
625 630 635 640
Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro
645 650 655
Ala Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu
660 665 670
Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu
675 680 685
Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Arg Pro
690 695 700
Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp Pro Ala Leu
705 710 715 720
Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly
725 730 735
Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Pro His Ala Pro Ala
740 745 750
Leu Ile Lys Arg Thr Asn Arg Arg Ile Pro Glu Arg Thr Ser His Arg
755 760 765
Val Ala Asp His Ala Gln Val Val Arg Val Leu Gly Phe Phe Gln Cys
770 775 780
His Ser His Pro Ala Gln Ala Phe Asp Asp Ala Met Thr Gln Phe Gly
785 790 795 800
Met Ser Arg His Gly Leu Leu Gln Leu Phe Arg Arg Val Gly Val Thr
805 810 815
Glu Leu Glu Ala Arg Ser Gly Thr Leu Pro Pro Ala Ser Gln Arg Trp
820 825 830
Asp Arg Ile Leu Gln Ala Ser Gly Met Lys Arg Ala Lys Pro Ser Pro
835 840 845
Thr Ser Thr Gln Thr Pro Asp Gln Ala Ser Leu His Ala Phe Ala Asp
850 855 860
Ser Leu Glu Arg Asp Leu Asp Ala Pro Ser Pro Met His Glu Gly Asp
865 870 875 880
Gln Thr Arg Ala Ser Ala Ser
885
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
cccgcgatcg caccatgatc cacggagtcc cagcagcc 38
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gatttcgacc tggacatgct gtaagcggcc gcggg 35
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cgcgcgtcag ccagcgacgc attggacgat tttgat 36
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ggccgcagtt taaacaaaca gagatgtgtc gaagat 36
<210> 28
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VPR
<400> 28
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
35 40 45
Met Leu Ser Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Gln
50 55 60
Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser
85 90 95
Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser
100 105 110
Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe
115 120 125
Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val
130 135 140
Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro
145 150 155 160
Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met
165 170 175
Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro
180 185 190
Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala
195 200 205
Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp
210 215 220
Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe
225 230 235 240
Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn
245 250 255
Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu
260 265 270
Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro
275 280 285
Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu
290 295 300
Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser
305 310 315 320
Ala Leu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Asp Ser Arg Glu Gly Met
325 330 335
Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp Val Phe Glu
340 345 350
Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile Arg Pro Phe His Pro Pro
355 360 365
Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu Ala Pro Thr
370 375 380
Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr Pro Ala Pro
385 390 395 400
Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Glu Ala Ser
405 410 415
His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala Val Lys Ala
420 425 430
Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys Glu Glu Ala Ala
435 440 445
Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu
450 455 460
Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp Leu Asn Leu
465 470 475 480
Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp Thr Phe Leu
485 490 495
Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser
500 505 510
Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe Val
515 520
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPR-PCR 5'-末端
<400> 29
cgcgcgtcag ccagc 15
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPR-PCR 3'-末端
<400> 30
gtttaaactg cggcc 15
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gtttaaactg cggccgcgtc g 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gctggctgac gcgcgagttt g 21
<210> 33
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(ICQ2)
<400> 33
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 60
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 120
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 180
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 240
ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccaggatct tcatccactt ccggcagggc 300
caggaaaacc tgtatttcca atctctcgag cgcgatcgca c 341
<210> 34
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(I8Q)
<400> 34
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 60
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 120
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 180
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 240
ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccaggatct tcatccactt ccggcagggc 300
tgcgaaaacc tgtatttcca atctctcgag cgcgatcgca c 341
<210> 35
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NTP(C10Q)
<400> 35
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 60
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 120
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 180
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 240
ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccaggatct tcatccactt ccggatcggc 300
caggaaaacc tgtatttcca atctctcgag cgcgatcgca c 341
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
gaaaacctgt atttccaatc tctcg 25
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
gaaatacagg ttttcatccg attttggagg atggtc 36
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ggagcaagtt gcaaagcatt g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
tgggagcagc tactggatct t 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
gatcggcggc tccatcctg 19
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
gactcgtcat actcctgctt gc 22
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