阅读说明：本技术 花椒提取物中活性成分wgx50的新用途 (New use of active ingredient WGX50 in fructus Zanthoxyli extract ) 是由 魏冬青 王恒 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及花椒提取物中活性成分WGX50的新用途,发明人通过不同浓度WGX50对角质形成细胞的细胞毒性进行测试和对黑素细胞的细胞毒性进行测试后,进行了基于角质形成细胞的保湿基因测试、基于黑素细胞的美白基因测试和基于UVB刺激角质形成细胞的抗炎测试,首次发现了WGX50具有保湿、美白和抗炎的功能,WGX50新功能的发现为多功能化妆品的制备提供了潜在方案,为化妆品的制备开拓了新思路,有助于实现更高的商业价值。(The invention relates to a new application of an active ingredient WGX50 in a pepper extract, and the inventor tests the cytotoxicity of keratinocytes and the cytotoxicity of melanocytes through WGX50 with different concentrations, and then tests moisturizing genes based on the keratinocytes, whitening genes based on the melanocytes and anti-inflammatory tests based on UVB stimulation of the keratinocytes, and discovers that the WGX50 has the functions of moisturizing, whitening and anti-inflammatory for the first time, and the discovery of the new function of WGX50 provides a potential scheme for the preparation of multifunctional cosmetics, develops a new thought for the preparation of the cosmetics, and is beneficial to realizing higher commercial value.)

花椒提取物中活性成分WGX50的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及花椒提取物中活性成分WGX50的新用途。

背景技术

花椒的化学成分丰富，主要包括生物碱、酰胺、木质素、香豆素、黄酮类、挥发油和脂肪酸等，具有镇痛、麻醉、杀虫、抗癌、抗氧化等功效。同时花椒在民间常被用作芳香调味品，是常见的药食两用中药，这些性质使其成为寻求植物提取物或有效活性成分的理想来源。

已发现的的花椒提取物中的活性成分WGX50((E)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-3-苯基丙烯酰胺)，具体结构如下：

在申请号为201210034380.1，专利名为GX50在化妆品组合物中的应用以及含有GX50的化妆品组合物的发明专利中，提到GX50作为主要活性成分在制备化妆品化合物中具有促进胶原蛋白合成，恢复皮肤弹性，抑制皱纹产生的功能，GX50作为化妆品添加剂的形式在制备化妆品组合物中具有促进胶原蛋白合成，恢复皮肤弹性，抑制皱纹产生的功能，这表明了花椒提取物中的活性成分WGX50在抗衰老方面有着出色的表现。

花椒提取物中的活性成分WGX50是否还存在其他未公开的新用途，以将其用于化妆品制备中，为化妆品的制备开拓新思路，实现更高的商业价值，是本发明要解决的问题。

发明内容

为解决现有技术问题，本发明的目的在于提供花椒提取物中活性成分WGX50的新用途。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

花椒提取物中活性成分WGX50的新用途。

发明人进行了以下实验：

1、基于角质形成细胞的保湿基因测试。首先对角质形成细胞的细胞毒性进行测试，之后进行实验设计，设置空白对照组与样品组，检测指标为AQP3(水通道蛋白)、CD44(细胞表明糖蛋白)、Filaggrin(丝聚蛋白质)、claudin-1(紧密连接蛋白)、HAS2(透明质酸合成酶)，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2^-△△CT方法进行结果计算，结果表明，与空白对照组相比，WGX50对角质形成细胞AQP3基因的表达有极显著促进作用。

2、基于黑素细胞的美白基因测试。首先对黑素细胞的细胞毒性进行测试，之后进行实验设计，设置空白对照组与样品组，检测指标为MC1R(黑皮质素受体)、MITF(黑素生成转录因子)、TYR(黑素合成与转运相关基因)和TYP-1(酪氨酸酶相关蛋白)，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2^-△△CT方法进行结果计算。结果表明，与空白对照组相比，WGX50对MC1R、MITF、TYR和TYP-1基因的表达有极显著抑制作用。

3、基于UVB刺激角质形成细胞的抗炎测试。实验分为空白对照(油溶)、溶剂对照(油溶)、阳性对照、样品组，检测指标为TNFα(前促炎因子，NF--κB信号通路介导启动TNFα的转录，TNFα合成后与其受体结合反过来又激活NF-κB信号通路)和IL1-α(前促炎因子，是无疏水性的多肽，细胞膜损伤后会分泌到细胞外，然后与其对应的受体IL1R结合后激活NF-κB诱导炎症级联反应)，根据TNFα和IL1-α试剂盒的操作说明书进行检测分析。

TNFα检测结果表明，与溶剂对照组相比，WGX50 TNFα分泌量极显著下降。

IL-1α检测结果表明，与溶剂对照组相比，WGX50 IL-1α分泌量极显著下降

上述实验说明，花椒提取物中活性成分WGX50的新用途包括WGX50具有保湿、美白和抗炎的功能。

进一步的，WGX50对角质形成细胞AQP3基因的表达有极显著促进作用，WGX50具有保湿的功能。

进一步的，WGX 50对MC1R、MITF、TYR和TYP-1基因的表达有极显著抑制作用，WGX50具有美白功能。

进一步的，WGX50 TNFα分泌量极显著下降，WGX50 IL-1α分泌量极显著下降，WGX50具有抗炎的功能。

本发明的有益效果是：本发明首次发现了花椒提取物中活性成分WGX50除抗衰老以外的保湿、美白和抗炎的新功能，WGX50新功能的发现为多功能化妆品的制备提供了潜在方案，为化妆品的制备开拓了新思路，有助于实现更高的商业价值。

附图说明

图1为本发明的角质形成细胞的细胞活力变化趋势图。

图2为本发明的角质形成细胞的细胞形态检测结果图。

图3为本发明的黑素细胞的细胞活力变化趋势图。

图4为本发明的角质形成细胞保湿基因变化趋势图。

图5为本发明的黑素细胞美白基因变化趋势图。

图6为本发明的TNFα含量变化趋势图。

图7为本发明的IL-1α含量变化趋势图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

本次测试所用细胞为角质形成细胞、黑素细胞，均由广东博溪生物科技有限公司生产。WGX50粉末根据申请号为201110439656.X，专利名为预防和治疗阿尔兹海默症的潜在药物gx50,gx51,gx52,gx180的化学合成方法的发明专利中公开的方法制得。

所用试剂为：PBS(博士德)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、DMEM(广东博溪)、NBS(四季青)、Medium-254(Gibco)、HMGS(Gibco)、KC2500(广东博溪)、地塞米松(Sigma)、RNAisoPlus(TaKaRa)、反转录试剂盒(TaKaRa)、荧光染料(TaKaRa)、TNFα试剂盒(Abcam)、IL1-α试剂盒(Abcam)。

用到的主要设备有：CO2培养箱(Thermo)、超净工作台(苏净安泰)、倒置显微镜(Olympus)、微量振荡器(其林贝尔)、酶标仪(BioTek)、流式细胞仪(Beckman)。

实施例1，基于角质形成细胞的细胞毒性测试。测设置8个浓度梯度，每个浓度下设置3个重复孔。同时，实验设置溶剂对照孔、调零孔(KC2500)和阳性对照孔(PC，4％DMSO)。细胞给药孵育培养24h后，采用MTT法检测细胞活力，筛选细胞给药的最大安全浓度。MTT检测结果如表1所示，其中，应用GraphPadPrismProgram软件作图，各组间采用T-test统计分析，P-value＜0.05表示差异显著，P-value＜0.01表示差异极显著。细胞活力变化趋势如图1所示。根据MTT检测结果，选取细胞活力拐点附近浓度，给药孵育培养24h后，于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照(20×)，形态学检测结果如图2所示。

表1角质形成细胞的毒性测试结果

根据MTT和形态学结果，WGX50在5μM的浓度范围内未表现出对角质形成细胞的细胞毒性。

实施例2，基于黑素细胞的细胞毒性测试。测设置8个浓度梯度，每个浓度下设置3个重复孔。同时，实验设置溶剂对照孔、调零孔(Medium-254)和阳性对照孔(PC，8％DMSO)。细胞给药孵育培养24h后，采用MTT法检测细胞活力，筛选细胞给药的最大安全浓度。MTT检测结果如表2所示，细胞活力变化趋势如图3所示。

表2黑素细胞的毒性测试结果

根据MTT结果，WGX50在100μM的浓度范围内未表现出对黑素细胞的细胞毒性。

实施例3，基于角质形成细胞的保湿基因测试。基于角质形成细胞的保湿基因测试实验设计如表3所示。

表3保湿基因测试实验设计

检测指标中的AQP3水通道蛋白，位于细胞膜上，具有运水的功能，在皮肤保湿过程中起重要作用。

基因检测流程：孵育24h后对细胞进行收样，依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2^-△△CT方法进行结果计算。用T-Test方法进行统计分析时，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

检测结果如表4所示，基因变化趋势如图4所示。

表4保湿基因检测结果

与空白对照组相比，WGX50对角质形成细胞AQP3基因的表达有极显著促进作用(P-value＜0.01)。

实施例4，基于黑素细胞的美白基因测试。基于黑素细胞的美白基因测试实验设计如表5所示。

表5美白基因测试实验设计

基因检测流程：孵育24h后对细胞进行收样，依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2^-△△CT方法进行结果计算。用T-Test方法进行统计分析时，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

检测结果如表6所示，基因变化趋势如图5所示。

表6美白基因检测结果

与空白对照组相比，WGX50对黑素细胞MC1R、MITF、TYR和TYP-1基因的表达有极显著抑制作用(P-value＜0.01)。

实施例5，基于UVB刺激角质形成细胞的抗炎测试。基于UVB刺激角质形成细胞的抗炎测试实验设计如表7所示。

表7抗炎测试实验设计

TNFα和IL1-α表达检测流程：孵育24h后收集细胞培养上清液，根据TNFα和IL1-α试剂盒的操作说明书进行检测分析。用T-Test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；样品组、阳性对照组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

TNFα测结果如表8所示，变化趋势如图6所示。

表8 TNFα检测结果

与空白对照组相比，阳性对照组TNFα分泌量极显著升高(P-value＜0.01)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与溶剂对照组相比，地塞米松在100μg/mL的给药浓度下，TNFα分泌量极显著下降(P-value＜0.01)，说明本次实验有效。

与阳性对照组相比，WGX50 TNFα分泌量极显著下降(P-value＜0.01)。

IL-1α检测结果如表9所示，变化趋势如图7所示。

表9 IL-1α检测结果

与空白对照组相比，阳性对照组IL-1α分泌量显著升高(P-value＜0.05)，说明本次实验UVB刺激条件有效。与溶剂对照组相比，地塞米松在100μg/mL的给药浓度下，IL-1α分泌量显著下降(P-value＜0.05)，说明本次实验有效。

与阳性对照组相比，WGX50 IL-1α分泌量极显著下降(P-value＜0.01)。