阅读说明：本技术 一种羧酸衍生化试剂及其制备方法和应用 (Carboxylic acid derivatization reagent and preparation method and application thereof ) 是由 王晓 孙成龙 刘伟 耿岩玲 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种羧酸衍生化试剂及其制备方法和应用,属于分析化学技术领域。所述羧酸衍生化试剂具体为N,N,N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵,其结构式如下：<Image he="170" wi="492" file="DDA0002504294820000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明中的羧酸衍生化试剂可作为羧酸类代谢物质谱检测的衍生化试剂,具有良好的质谱增敏效果,因此具有良好的实际推广应用之价值。(The invention provides a carboxylic acid derivatization reagent and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of analytical chemistry. The carboxylic acid derivatization reagent is N, N, N-trimethyl-2- (piperazine-1-yl) ethane-1-ammonium iodide, and the structural formula is as follows: the carboxylic acid derivatization reagent can be used as a derivatization reagent for mass spectrometry detection of carboxylic acid metabolites, and has a good mass spectrum sensitization effect, so that the carboxylic acid derivatization reagent has a good value for practical popularization and application.)

一种羧酸衍生化试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种羧酸衍生化试剂及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

羧酸类化合物如脂肪酸、胆汁酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、吲哚乙酸、脱落酸等是生物体内重要的代谢物，它们在细胞的增殖、能量代谢、信号传导等过程中发挥着至关重要的作用。这些代谢物的含量变化可以反映机体的生物状态。例如，人体内三羧酸循环相关代谢物(苹果酸、柠檬酸、琥珀酸)的异常调节与多种癌症的发生发展密切相关；胆汁酸代谢异常是机体代谢性疾病的一个重要特征；吲哚乙酸和脱落酸作为重要的植物激素，能够以极低的含量调控植物生长发育的重要生命活动。因此，准确分析、测定生物体内羧酸类代谢物的种类和含量，对于帮助我们深入认识酸类代谢物在复杂生命活动中的作用机制具有重要的意义。

目前测定生物样品中羧酸类代谢物主要依赖质谱技术。在负离子检测模式下，直接进行液相色谱-串联质谱检测方法是目前最为常用的方法，但是由于部分羧酸类代谢物在生物体中含量极低，难以准确测定。因此，离子化效率高的胺类衍生化试剂常常用来与羧酸类代谢物进行反应，从而提高羧酸类代谢物的质谱检测灵敏度。发明人发现，目前报道的羧酸类代谢物衍生化试剂包括：N,N-二甲基乙二胺、5-(二甲基氨基)戊胺等。但这些衍生化试剂存在衍生化操作复杂、灵敏度不足、衍生化试剂的强离子化效率影响待测物的检测等问题。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种羧酸衍生化试剂及其制备方法和应用，所述羧酸衍生化试剂具体为N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵，其可作为羧酸类代谢物质谱检测的衍生化试剂，经试验验证，其具有良好的质谱增敏效果，因此具有良好的实际推广应用之价值。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

本发明第一个方面，提供一种化合物，所述化合物为N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵，结构式如式(I)所示：

本发明的第二个方面，提供上述化合物的合成方法，所述合成方法包括：

本发明的第三个方面，提供上述化合物作为衍生化试剂的应用；

具体的，所述衍生化试剂为羧酸衍生化试剂；

更具体的，所述应用包括在羧酸类代谢物质谱检测中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种羧酸类代谢物质谱检测的方法，所述方法包括：将羧酸类代谢物进行衍生化反应后进行质谱检测。

其中，所述衍生化反应中使用的衍生化试剂为上述N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

(1)以N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵为衍生化试剂，衍生化条件温和，反应活性高，反应速度快，而且衍生化试剂自身带有正电荷，衍生化产物的离子化效率高。

(2)以N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵为衍生化试剂，能够实现生物样品中多种羧酸类代谢物衍生化分析，包括：硬脂酸、油酸、亚油酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸、吲哚乙酸、脱落酸。

(3)所用衍生化试剂与羧酸类代谢物结合后性质稳定，在质谱子离子扫描分析中，能够稳定的脱掉三甲胺(59Da)形成[M-59]+碎片离子，有利于增强定性、定量分析的准确性，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书附图

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵的高分辨质谱图和子离子扫描质谱图；

图2是本发明实施例3中大鼠血浆中硬脂酸、油酸、亚油酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂结合后的高分辨质谱图；

图3是本发明实施例3中大鼠血浆中油酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化后产物的子离子扫描质谱图；

图4是本发明实施例4中水稻根中脱落酸和吲哚乙酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂结合后的高分辨质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，目前报道的羧酸类代谢物衍生化试剂存在衍生化操作复杂、灵敏度不足、衍生化试剂的强离子化效率影响待测物的检测等问题。

有鉴于此，本发明提供一种化合物，其化学名称为：N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵，结构式如式(I)所示：

本发明的又一具体实施方式中，提供上述式(I)化合物的合成方法，如下所示：

本发明的又一具体实施方式中，所述合成方法包括以下步骤：室温下，将1-(2-二甲基氨基乙基)哌嗪溶解在乙醚中，然后加入碘甲烷，搅拌处理即得。

本发明的又一具体实施方式中，上述方法中1-(2-二甲基氨基乙基)哌嗪与碘甲烷的摩尔投料比可为3-10:1，优选为5:1。

本发明的又一具体实施方式中，所述合成方法还包括：反应结束后过滤反应液，乙醚清洗，干燥得固体粉末，即得N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物作为衍生化试剂的应用；具体的，所述衍生化试剂为羧酸衍生化试剂；更具体的，所述应用包括在羧酸类代谢物质谱检测中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种羧酸类代谢物质谱检测的方法，所述方法包括：将羧酸类代谢物进行衍生化反应后进行质谱检测。

其中，所述衍生化反应中使用的衍生化试剂为上述N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种羧酸类代谢物质谱检测的方法，包括以下步骤：

(1)从生物样品中获取羧酸类代谢物提取溶液；

(2)羧酸类代谢物的衍生化反应：将衍生化试剂溶于溶剂，然后将过量的衍生化试剂溶液加入到羧酸类代谢物提取溶液中，再加入催化剂，涡旋混匀，恒温条件下进行衍生化反应，反应结束后得到羧酸类代谢物衍生化产物；

(3)质谱检测：利用羧酸类代谢物对照品的衍生化产物进行针泵注射质谱分析，获得相应的准确m/z值和离子对信息，同时设置质谱参数，将上述步骤(2)的生物样品的衍生化试液进行分析，获得生物样品中羧酸类代谢物的信息。

本发明的又一具体实施方式中，所述羧酸类代谢物包括硬脂酸、油酸、亚油酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸、吲哚乙酸、脱落酸中的一种或多种。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(1)所用的生物样品包括但不限于动物组织样品或植物组织样品，如大鼠血浆或水稻的根。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(2)所用的溶剂为乙腈和水混合溶液，优选的乙腈和水的体积比为9:1。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(2)所用的衍生化试剂浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选为1mg/ml。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(2)所用的催化剂包括HBOt(1-羟基苯并三唑水合物)、TEA(三乙胺)、EDC(N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)中一种，优选为HATU。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(2)反应温度为20-60℃，优选为40℃。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(2)反应时间为0.5-2小时，优选为1小时。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵的合成

(1)将2.5mM的1-(2-二甲基氨基乙基)哌嗪加入到20mL的乙醚中，涡旋3分钟；

(2)在上述溶液中加入0.5mM的碘甲烷，涡旋3分钟；

(3)室温条件下，将上述溶液在磁力搅拌器下以100rpm/min转速搅拌1小时，然后将其过滤，用乙醚清洗3次，晾干滤纸上的固体物质，得到N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵。

图1是N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵的高分辨质谱图和子离子扫描质谱图。

实施例2：溶液中羧酸类代谢物的衍生化反应及检测

(1)精密称量胆酸、油酸、延胡索酸10mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得1.0mg/mL的油酸、苹果酸、胆酸溶液备用；

(2)精密称量N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂10mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得1.0mg/mL的N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵溶液备用；

(3)精密称量HATU 5mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；

(4)精密称量N,N-二甲基乙二胺10mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得1.0mg/mL的N,N-二甲基乙二胺溶液备用；

(5)取1.0mg/mL胆酸、油酸、延胡索酸溶液1mL置于离心管中，加入1.0mg/mL的N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵溶液0.5mL，加入HATU溶液0.2mL，涡旋混匀，置于40℃水浴锅中孵育1小时；

(6)取1.0mg/mL胆酸、油酸、延胡索酸溶液1mL置于离心管中，加入1.0mg/mL的N,N-二甲基乙二胺溶液0.5mL，加入HATU溶液0.2mL，涡旋混匀，置于40℃水浴锅中孵育1小时；

(7)将上述反应液以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液；

(8)将上述上清液置于针泵注射器中，以0.05mL/min的速度注射进Bruker ImpactII-Q-TOF型质谱仪中进行分析。

(9)比较当以N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵和N,N-二甲基乙二胺为衍生化试剂时，胆酸、油酸、延胡索酸衍生物的质谱响应强度，结果如下表1所示，可见当以N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵为衍生化试剂时能够显著提高羧酸代谢物的检测灵敏度。

表1

实施例3：大鼠中羧酸类代谢物的衍生化反应及检测

(1)大鼠眼眶取血置于肝素化试管中，以3000rpm/min的转速离心5分钟，取上层血浆；

(2)取0.5mL血浆，加入2000μL乙腈，涡旋3分钟，静置1分钟，以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液，备用；

(3)精密称量N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂10mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；

(4)精密称量HATU 5mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；

(5)取大鼠血浆蛋白沉淀后的上清液1mL置于离心管中，加入衍生化试剂溶液0.5mL，加入HATU溶液0.2mL，涡旋混匀，置于40℃水浴锅中孵育1小时。

(6)将上述反应液以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液；

(7)将上述上清液置于针泵注射器中，以0.05mL/min的速度注射进Bruker ImpactII-Q-TOF型质谱仪中进行分析。

图2是血浆中硬脂酸、油酸、亚油酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂结合后的高分辨质谱图。

图3是大鼠血浆中油酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化后产物的子离子扫描质谱图。

实施例4：水稻中羧酸类代谢物的衍生化反应及检测

(1)取水稻的根组织20mg，置于研钵中，加入3ml乙腈-水(9:1，v/v)溶液，进行充分研磨。

(2)将上述水稻根组织研磨液以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液，备用；

(3)精密称量N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂10mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；

(4)精密称量HATU 5mg置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈-水(9:1，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，备用；

(5)取水稻根组织研磨后的上清液1mL置于离心管中，加入衍生化试剂溶液0.5mL，加入HATU溶液0.2mL，涡旋混匀，置于40℃水浴锅中孵育1小时。

(6)将上述反应液以10000rpm/min的转速离心5分钟，取上清液；

(7)将上述上清液置于针泵注射器中，以0.05mL/min的速度注射进Bruker ImpactII-Q-TOF型质谱仪中进行分析。

图4是水稻根中脱落酸和吲哚乙酸与N，N，N-三甲基-2-(哌嗪-1-基)乙烷-1-碘化铵衍生化试剂结合后的高分辨质谱图。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。