阅读说明：本技术 十五种苯乙醇苷类化合物及其分离纯化方法与应用 (Fifteen phenylethanoid glycoside compounds and separation and purification method and application thereof ) 是由 曾小斌 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了十五种苯乙醇苷类化合物及其分离纯化方法与在制备抗炎功能性食品及药物中的应用,该十五种苯乙醇苷类化合物的结构如式(1)-(15)。本发明提供的十五种苯乙醇苷类化合物作为一种天然化合物,对正常细胞毒性较低,副作用较小；在其细胞毒性浓度以下,还表现出显著的抗炎作用且还具有有效剂量适中,疗效显著,毒副作用小等优点,因此,具有广阔的应用前景。(The invention discloses fifteen phenylethanoid glycoside compounds, a separation and purification method thereof and application thereof in preparing anti-inflammatory functional foods and medicaments, wherein the fifteen phenylethanoid glycoside compounds have the structures shown in formulas (1) to (15). The fifteen phenylethanoid glycosides compounds provided by the invention are used as natural compounds, and have low toxicity to normal cells and small side effect; the composition also shows obvious anti-inflammatory effect below the cytotoxic concentration, and has the advantages of moderate effective dose, obvious curative effect, small toxic and side effects and the like, so the composition has wide application prospect.)

十五种苯乙醇苷类化合物及其分离纯化方法与应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及十五种苯乙醇苷类化合物及其分离纯化方法与应用，具体涉及十五种新的苯乙醇苷类化合物，并涉及其分离纯化方法，以及涉及该类苯乙醇苷化合物在制备抗炎功能性食品及药物中的应用。

背景技术

肉苁蓉Cistanche Herba又名金笋、地精、苁蓉、大芸，为列当科植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉苁蓉C.tubulosa(Schrenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。始载于《神农本草经》，列为上品，其后古典《本草经疏》、《本草汇言》、《月华子本草》等多有记载。李时珍曰：“此物补而不峻，故有从容之兮”。肉苁蓉味甘、咸，性温，具有补肾壮阳，填精补髓，养血润燥，悦色延年等功效，主治男子阳痿、女子不孕、带下、血崩、腰膝冷痛、血枯便秘等。在我国已有两千多年的使用历史，在历代增力中药处方中出现率占第1位，而在抗老防衰类方剂中仅次于人参占第2位。由于肉苁蓉属植物野生资源日益枯竭，已被我国列为二级保护物种，并被收入《国际野生植物保护名录》。

肉苁蓉主产于内蒙古、甘肃、新疆、青海等地；性温、味甘咸，为补肾壮阳、润肠通便之要药，有“沙漠人参”的美誉。现代药理研究证明肉苁蓉除具有补肾壮阳、润肠通便作用外，还具有抗疲劳、抗炎、抗衰老、增强机体免疫力及增强记忆力等作用，且没有发现不良反应。

自20世纪70年代起，国内外学者开始系统研究肉苁蓉属植物的化学成分和药理活性。至今，已从肉苁蓉中分离并鉴定了近百种化学成分及微量元素，主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、木脂素苷、单糖、双糖、多糖、氨基酸、多肽、蛋白质、三萜、甾醇、多元醇等。其中苯乙醇苷类成分在原药材中含量最高，是肉苁蓉属植物的主要活性成分之一，也是中国药典“肉苁蓉”项下鉴别和含量测定的指标性成分，具有抗氧化、抗炎、促进物质代谢、改善学习记忆、增强性功能等作用。目前仍需对苯乙醇苷类化合物的类型进行扩大，以增加在抗氧化、抗炎、促进物质代谢、改善学习记忆、增强性功能等方面的可选择性。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了十五种苯乙醇苷类化合物及其分离纯化方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供十五种苯乙醇苷类化合物，结构式如下(1)-(15)：

本发明的第二方面是提供上述十五种苯乙醇苷类化合物的分离纯化方法，包括如下步骤：

S1：在室温下，用乙醇对肉苁蓉进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏；

S2：将上述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到环己烷浸膏，乙酸乙酯浸膏CE，正丁醇浸膏以及水部位浸膏；

S3：将上述乙酸乙酯浸膏CE，用氯仿和甲醇溶解，用柱层析硅胶进行拌样后，装入硅胶柱，上样，进行梯度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得16个组分CE-1～CE16；

S4：取CE-7，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离得到4个馏分CE-7-1～CE-7-4；取组分CE-7-1，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，分别在保留时间为42-43min和84-85min得到化合物1和化合物2；取组分CE-7-4，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，分别在保留时间为12.0-12.5min、15.5-16.0min、17.5-18.0min、42.0-42.5min和56.8-57.2min得到化合物3、4、5、6和7；

S5：取CE-9，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得6个组分CE-9-1～CE-9-6；取组分CE-9-6，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，在保留时间为23.5-24.0min得到化合物8；

S6：取CE-10，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行凝胶柱层析，实施等度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得3个组分CE-10-1～CE-10-3；取组分CE-10-2，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，分别在保留时间为18.0-18.5min、18.8-19.2min和20.0-23.5min得到化合物9、10和11；

S7：取CE-12，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得5个组分CE-12-1～CE-12-5；取组分CE-12-5，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，在保留时间为43.8-44.2min得到化合物12；

S8：取CE-13，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得9个组分CE-13-1～CE-13-9；取组分CE-13-7，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，分别在保留时间为25.1min左右和26.4min左右得到化合物13和化合物14。

S9：取CE-14，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得4个组分CE-14-1～CE-14-4；取组分CE-14-1，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离，在保留时间为34.0-34.5min得到化合物15。

进一步地，S1中乙醇的浓度为85％。

进一步地，S3中硅胶柱梯度洗脱采用的洗脱液依次为二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为20：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为10：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇。

进一步地，上述柱层析硅胶为100～200目的柱层析硅胶。

进一步地，上述凝胶柱层析的凝胶为Sephadex LH-20。

进一步地，上述凝胶柱层析采用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，其中，二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3。

进一步地，上述等度洗脱的流速为200ml/h，每接100ml为一个流分浓缩。

进一步地，上述高效液相色谱粗分离采用的色谱柱的规格为Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm；其采用的流速为8mL/min，流动性为甲醇/水。

本发明的第二方面是提供一种药物制剂，包括上述十五种苯乙醇苷类化合物的任意一种或几种。

本发明的第三方面是提供上述十五种苯乙醇苷类化合物在制备抗炎功能性食品及药物中的应用。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的十五种苯乙醇苷类化合物作为一种天然化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；在其细胞毒性浓度以下，还表现出显著的抗炎作用且还具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，因此，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1-9为本发明中的化合物1的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图10-18为本发明中的化合物2的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图19-27为本发明中的化合物3的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图28-36为本发明中的化合物4的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图37-41为本发明中的化合物5的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图42-50为本发明中的化合物6的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图51-59为本发明中的化合物7的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图60-68为本发明中的化合物8的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图69-77为本发明中的化合物9的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图78-86为本发明中的化合物10的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图87-95为本发明中的化合物11的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图96-104为本发明中的化合物12的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图105-113为本发明中的化合物13的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图114-118为本发明中的化合物14的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图119-123为本发明中的化合物15的¹H NMR、¹³C NMR、2D-NMR、MS、IR、UV图；

图124示出了本发明中种苯乙醇苷类化合物对RAW 264.7细胞的细胞毒性的结果图；

图125示出了本发明中种苯乙醇苷类化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO释放的抑制率的柱状统计图。

具体实施方式

本发明提供了十五种苯乙醇苷类化合物，扩大目前肉苁蓉植物苯乙醇苷类化合物的类型。该类化合物通过一系列实验发现该类化合物具有较好的抗炎增强免疫力作用，今后可成为市场上新的抗炎的功能性食品和药品。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一

本实施例提供一种苯乙醇苷类化合物，具有如下(Ⅰ)-(Ⅲ)的通式：

其中，R表示为不同类型的取代基。

特别地，上述苯乙醇苷类化合物包括结构式如下(1)-(15)的化合物：

根据结构式(1)可知，该苯乙醇苷类化合物1可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[4-O-反式咖啡酰基]-β-D-甘露糖苷(2-(4-hydroxyphenylethyl)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-mannoside)，简称为cistanoloside A；

根据结构式(2)可知，该苯乙醇苷类化合物2可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[4-O-反式咖啡酰基]-β-D-阿洛糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-allopyranoside)，简称为cistanoloside B；

根据结构式(3)可知，该苯乙醇苷类化合物3可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[4-O-反式香豆酰基]-β-D-甘露糖苷(2-(4-hydroxyphenylethyl)-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-mannoside)，简称为cistanoloside C；

根据结构式(4)可知，该苯乙醇苷类化合物4可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[4-O-反式香豆酰基]-β-D-阿洛糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-allopyranoside)，简称为cistanoloside D；

根据结构式(5)可知，该苯乙醇苷类化合物5可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[4-O-顺式香豆酰基]-β-D-甘露糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-cis-coumaroyl]-β-D-allopyranoside)，简称为cistanoloside E；

根据结构式(6)可知，该苯乙醇苷类化合物6可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[4-O-反式肉桂酰基]-β-D-葡萄糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-cinaamoyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside F；

根据结构式(7)可知，该苯乙醇苷类化合物7可被命名2-苯乙醇基-鼠李糖(1→3)-[4-O-反式香豆酰基]-β-D-葡萄糖苷(2-phenylethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-glucop yranoside)，简称为cistanoloside G；

根据结构式(8)可知，该苯乙醇苷类化合物8可被命名2-(3-甲氧基-4-羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[4-O-反式香豆酰基]-β-D-葡萄糖苷(2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-ethyl-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-coumaroyl)]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside H；

根据结构式(9)可知，该苯乙醇苷类化合物9可被命名(7S)-2-乙氧基-(3,4-二羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[2-乙酰基-4-O-反式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖苷((7S)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[2-acetyl-4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside I；

根据结构式(10)可知，该苯乙醇苷类化合物10可被命名(7R)-2-乙氧基-(3,4-二羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[2-乙酰基-4-O-反式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖苷((7R)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[2-acetyl-4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside J；

根据结构式(11)可知，该苯乙醇苷类化合物11可被命名2-(3,4-二羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[2-乙酰基-4-O-顺式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖苷(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-2-acetyl-[4-O-cis-caffeoyl)]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside K；

根据结构式(12)可知，该苯乙醇苷类化合物12可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[6-O-反式香豆酰基]-β-D-葡萄糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[6-O-cis-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside L；

根据结构式(13)可知，该苯乙醇苷类化合物13可被命名(7S)-2-乙氧基-(3,4-二羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[4-O-反式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖苷((7S)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside M；

根据结构式(14)可知，该苯乙醇苷类化合物14可被命名(7R)-2-乙氧基-(3,4-二羟基苯乙醇基)-鼠李糖(1→3)-[4-O-反式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖苷((7R)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside N；

根据结构式(15)可知，该苯乙醇苷类化合物15可被命名2-(4-羟基苯乙醇基)-[6-O-顺式咖啡酰基]-β-D-葡萄糖

(2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl-[6-O-cis-caffeoyl)]-β-D-glucopyranoside)，简称为cistanoloside O。

实施例二

本实施例提供实施例中的十五种苯乙醇苷类化合物的分离纯化方法，包括如下步骤：

步骤一，在室温下，取晾干的肉苁蓉5.5kg，用85％乙醇进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，55℃下减压回收溶剂，浓缩得乙醇浸膏2.2kg；将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到环己烷浸膏77.0g，乙酸乙酯浸膏(CE)20.0g，正丁醇浸膏41.0g以及水部位浸膏2000g。

步骤二，取20.0g所述乙酸乙酯浸膏CE，用氯仿和甲醇溶解，用30g柱层析硅胶(100-200目)进行拌样后，用二氯甲烷溶解该硅胶装柱，并用二氯甲烷平衡柱子至硅胶面不再下降，干法上样，再依次用二氯甲烷、体积比为100：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为20：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为10：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为5：1的二氯甲烷-甲醇、体积比为2：1的二氯甲烷-甲醇、甲醇实施梯度洗脱，控制流速在1000ml/h，每接500ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得16个组分CE-1～CE16。

步骤三，取第7个流分CE-7(1.0g)(由二氯甲烷-甲醇10：1洗脱得到)，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(60：40,v/v)，得到4个馏分CE-7-1～CE-7-4。取组分CE-7-1，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(35：65,v/v)，分别在保留时间为42.9min左右和84.9min左右得到化合物1(2.6mg)和化合物2(21.4mg)。取组分CE-7-4，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：205nm)，流动相为甲醇：水(53：47,v/v)，分别在保留时间为12.2min左右、15.9min左右、17.9min左右、42.3min左右和57.0min左右得到化合物3(1.1mg)、4(4.5mg)、5(2.6mg)、6(19.3mg)和7(11.6mg)。

步骤四，取第9个流分CE-9(3.0g)(由二氯甲烷-甲醇10：1洗脱得到)，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20凝胶(23×595mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为7：3，实施等度洗脱，控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得6个组分CE-9-1～CE-9-6。取组分CE-9-6，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：205nm)，流动相为甲醇：水(50：50,v/v)，在保留时间为23.8min左右得到化合物8(4.1mg)。

步骤五，取第10个流分CE-10(0.6g)(由二氯甲烷-甲醇10：1洗脱得到)，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20凝胶(15×350mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为7：3，实施等度洗脱；控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得3个组分CE-10-1～CE-10-3。取组分CE-10-2，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：205nm)，流动相为甲醇：水(52：48,v/v)，分别在保留时间为18.2min左右、19.0min左右和20.3min左右得到化合物9(2.9mg)、10(3.1mg)和11(4.5mg)。

步骤六，取第12个流分CE-12(1.8g)(由二氯甲烷-甲醇5：1洗脱得到)，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20凝胶(23×595mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为7：3，实施等度洗脱，控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得5个组分CE-12-1～CE-12-5。取组分CE-12-5，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：330nm)，流动相为甲醇：水(47：53,v/v)，在保留时间为44.0min左右得到化合物12(1.5mg)。

步骤七，取第13个流分CE-13(3.6g)(由二氯甲烷-甲醇5：1洗脱得到)，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20凝胶(23×595mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为7：3，实施等度洗脱，控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得9个组分CE-13-1～CE-13-9。取组分CE-13-7，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：205nm)，流动相为甲醇：水(42：58,v/v)，分别在保留时间为25.1min左右和26.4min左右得到化合物13(0.5mg)和化合物14(0.5mg)。

步骤八，取第14个流分CE-14(0.2g)(由二氯甲烷-甲醇5：1洗脱得到)，用少量二氯甲烷-甲醇溶解，并进行Sephadex LH-20凝胶(15×350mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷-甲醇，体积比为7：3，实施等度洗脱；控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层TLC分析，合并相同流分后获得4个组分CE-14-1～CE-14-4。取组分CE-14-1，用甲醇溶解过滤，经过Rp-18高效液相色谱粗分离(Cosmosil 5C₁₈-MS-II，5μm，20×250mm，流速：8mL/min，波长：205nm)，流动相为甲醇：水(45：55,v/v)，在保留时间为34.1min左右得到化合物15(1.0mg)。

此外，本发明所述的天然苯乙醇苷类化合物还可由其它提取工艺或化学合成方法制得。

实施例三

本实施例对实施例1中的十五种苯乙醇苷类化合物的结构进行鉴定，具体的操作和结果如下：

化合物1的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]^-m/z 461.1877(calcd.C₂₃H₂₅O₁₀,461.1853)，提示分子量为462；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₆O₁₀，计算不饱和度为11。UV光谱在213nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而327nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3359cm^-1)、α，β-不饱和酯(1632cm^-1)、苯环骨架(1599,1516cm^-1)、糖苷键(824cm^-1)等。

参见图1～9，结合表1和表2，在¹H NMR上，δ_H7.04(2H,d,J＝8.0Hz),6.66(2H,d,J＝8.0Hz)的4个氢质子形成一组A₂B₂系统。DEPT135°中δ_C 34.74,70.03峰都显示向下，HMBC谱图中显示δ_H 2.74(2H,m,H-7)与δ_C 129.76(C-2,6)、115.00(C-3,5)和34.74(C-7)相关，推断结构中存在一个4-羟基苯乙醇基片段。此外，¹H-NMR谱中δ_H 7.04(1H,s),7.00(1H,d,J＝8.0Hz),6.76(1H,d,J＝8.0Hz)的另3个氢质子形成一组ABX系统，δ_H7.46(1H,d,J＝15.9Hz),6.26(1H,d,J＝15.9Hz)为反式双键的两个质子，这提示该化合物分子中有反式咖啡酰基的存在。一个糖端基信号在δ_H 44.33(1H,d,J＝8.0Hz)，HMQC谱中提示它与δ_C 102.54(C-1')相关，提示此糖为氧苷。糖上氢信号δ_H 4.88(1H,t,J＝9.3Hz),4.33(1H,d,J＝8.0Hz),and 3.67(1H,m)及碳信号δ_C 102.54(C-1'),76.61(C-2'),71.46(C-3'),77.68(C-4'),67.97(C-5')and 60.68(C-6')提示我们这个糖不同于肉苁蓉属植物常见的中心糖葡萄糖。经酸水解后糖残基衍生化经HPLC分析，标准糖同样衍生化处理对比分析确定该化合物的中心糖为D-甘露糖。HMBC谱中显示中心糖的δ_H H-1'(δ_H4.33)与δ_C 70.03(C-8)处的相关证明4-羟基苯乙醇基连接在中心糖甘露糖的C-1'位，而中心糖的H-4'(δ_H 4.88)则与C-9”(166.09)相关，这提示我们咖啡酰基可能连在甘露糖的C-4'位。因此，推断该化合物1为2-(4-hydroxyphenylethyl)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-mannoside，将其简称为cistanoloside A。

化合物2的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 461.1849(calcd.C₂₃H₂₅O₁₀,461.1853)，提示分子量为462；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₅O₁₀，计算不饱和度为11。UV光谱在216nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而327nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3272cm^-1)、α，β-不饱和酯(1630cm^-1)、苯环骨架(1560,1516cm^-1)、糖苷键(824cm^-1)等。

参见图10～18，结合表1和表2，该化合物的¹H NMR谱和¹³C NMR谱与化合物1的谱图十分相似，除了中心糖的构型。经酸水解后糖残基衍生化经HPLC分析，标准糖同样衍生化处理对比分析确定该化合物的中心糖为D-阿洛糖。因此，化合物2的结构被推断为

2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-allopyranoside，将其简称为cistanoloside B。

化合物3的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]^-m/z为445.1947(calcd.for C₂₃H₂₅O₉,445.1941)提示分子量为446；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₆O₉，计算不饱和度为11。UV光谱在208nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而309nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3362cm^-1)、α，β-不饱和酯(1630cm^-1)、苯环骨架(1603,1514cm^-1)、糖苷键(825cm^-1)等。

参见图19-27，结合表1和表2，化合物3的NMR图谱与化合物1的图谱十分相似，¹HNMR上没有了ABX信号，又多了一套A₂B₂系统信号δ_H 7.54(2H,d,J＝8.0Hz),6.79(2H,d,J＝8.0Hz)，且与反式双键信号δ_H 7.54(1H,d,J＝15.9Hz),6.40(1H,d,J＝15.9Hz)相关，这说明该化合物的取代基为反式香豆酰基。其他信号均与化合物1相似，酸水解糖残基经HPLC比对也证实D-甘露糖存在。因此，该化合物的结构为2-(4-hydroxyphenylethyl)-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-mannoside，简称为cistanoloside C。

化合物4的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]^-m/z为445.1934(calcd.for C₂₃H₂₅O₉,445.1941)，提示分子量为446；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₆O₉，计算不饱和度为11。UV光谱在218nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而312nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3274cm^-1)、α，β-不饱和酯(1630cm^-1)、苯环骨架(1603,1515cm^-1)、糖苷键(832cm^-1)等。

参见图28-36，结合表1和表2，化合物4的NMR图谱与化合物2的图谱十分相似，¹HNMR上没有了ABX信号，又多了一套A₂B₂系统信号δ_H 7.55(2H,d,J＝8.0Hz),6.79(2H,d,J＝8.0Hz)，且与反式双键信号δ_H 7.55(1H,d,J＝15.9Hz),6.38(1H,d,J＝15.9Hz)相关，这说明该化合物的取代基为反式香豆酰基。其他信号均与化合物2相似，酸水解糖残基经HPLC比对也证实D-阿洛糖存在。因此，该化合物的结构为2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-allopyranoside，简称为cistanoloside D。

化合物5的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为469.1469，提示分子量为446；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₆O₉，计算不饱和度为11。UV光谱在217nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而312nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3353cm^-1)、α，β-不饱和酯(1700cm^-1)、苯环骨架(1603,1515cm^-1)、糖苷键(831cm^-1)等。

参见图37-41，结合表1和表2，化合物5的NMR图谱与化合物4的图谱相比，仅是双键构型的差异，化合物4的双键耦合常数为15.9HZ，而化合物5的双键耦合常数为12.9Hz，且双键氢信号往高场位移，δ_H 6.84(1H,d,J＝12.9Hz),5.72(1H,d,J＝12.9Hz)，因此，这提示化合物5含有一对顺式双键。其他信号均与化合物4相似，酸水解糖残基经HPLC比对也证实D-阿洛糖存在。因此，该化合物的结构为2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-[4-O-cis-coumaroyl]-β-D-allopyranoside，简称为cistanoloside E。

表1化合物1-5在的DMSO-d₆中的¹H NMR(400MHz)数据

表2化合物1-5在的DMSO-d₆中的¹³C NMR(100MHz)数据

化合物6的结构鉴定

浅黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为599.2097(calcd.for C₂₉H₃₆O₁₂Na,599.2099)，提示分子量为576；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₉H₃₆O₁₂，计算不饱和度为12。UV光谱在212nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在。IR谱中显示含有羟基(3354cm^-1)、α，β-不饱和酯(1709cm^-1)、苯环骨架(1516cm^-1)、糖苷键(834cm^-1)等。

参见图42-50，结合表3，在¹H NMR上，δ_H 7.06(2H,d,J＝8.0Hz),6.68(2H,d,J＝8.0Hz)的4个氢质子形成一组A₂B₂系统，以及两个亚甲基信号δ_H 3.91(1H,d,J＝8.0Hz),3.63(1H,d,J＝8.0Hz),2.77(2H,m)，推断结构中存在一个4-羟基苯乙醇基片段。此外，苯环上5个芳氢信号δ_H 7.70(1H,d,J＝2.0Hz),7.44(4H,m)和一对反式双键信号δ_H 7.65(1H,d,J＝15.9Hz),6.59(1H,d,J＝15.9Hz)示该化合物分子中有反式肉桂酰基的存在。两个糖端基信号分别在δ_H 5.05(1H,s),4.38(1H,s)，HMQC谱中提示它们与δ_C 101.20(C-1”')、102.28(C-1')相关，提示两个糖皆为氧苷。经与文献比对，两个糖分别为葡萄糖与鼠李糖。HMBC谱中显示中心糖的δ_H H-1'(δ_H 4.38)与δ_C 70.38(C-8)处的相关证明4-羟基苯乙醇基连接在中心糖葡萄糖的C-1'位，而中心糖的H-4'(δ_H 4.77)则与C-9”(165.30)相关，这提示咖啡酰基可能连在葡萄糖的C-4'位，而鼠李糖的端基信号H-1”'(δ_H 5.05)则与中心糖的C-3'(δ_C79.01)位耦合，则说明鼠李糖连在葡萄糖的3位。因此，该化合物的结构为

2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-cinaamoyl]-β-D-glucopyranoside，简称为cistanoloside F。

化合物7的结构鉴定

浅黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为599.2091(calcd.for C₂₉H₃₆O₁₂Na,599.2099)，提示分子量为576；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₉H₃₆O₁₂，计算不饱和度为12。UV光谱在207nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而314nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3373cm^-1)、α，β-不饱和酯(1704cm-1)、苯环骨架(1603,1515cm^-1)、糖苷键(834cm^-1)等。

参见图51-59，结合表3，化合物7的NMR信息显示与jionoside C是结构类似物，差异在于化合物7是反式香豆酰基，而化合物jionoside C是反式咖啡酰基。HMBC谱上H-2”,6”(δ_H 7.51)与C-7”(δ_C 145.23)/C-8”(δ_C 113.48)处的耦合也进一步证实了上述推论。因此，化合物7的结构为2-phenylethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-coumaroyl]-β-D-glucopyra noside，简称为cistanoloside G。

表3化合物6、7、吉奥诺苷C在的DMSO-d₆中的¹H NMR和¹³C-NMR数据

化合物8的结构鉴定

浅黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为645.2156，提示分子量为622；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₃₀H₃₈O₁₄，计算不饱和度为12。UV光谱在206nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而315nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3376cm^-1)、α，β-不饱和酯(1702cm^-1)、苯环骨架(1603,1516cm^-1)、糖苷键(824cm^-1)等。

参见图60-68，结合表4，化合物8的NMR信息显示与异丁香醛3'-α-L-鼠李吡喃糖苷是结构类似物，差异在于化合物8多了一个甲氧基，HMBC显示甲氧基信号δ_H 3.75与C-3(δ_C147.33)相关，说明甲氧基是连在苯乙醇基的3位。因此，化合物8的结构为

2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-ethyl-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-co umaroyl)]-β-D-glucopyranoside，简称为cistanoloside H。

表4化合物8和异丁香醛3'-α-L-鼠李吡喃糖苷在的DMSO-d₆中的¹H NMR和¹³C-NMR数据

化合物11的结构鉴定

浅黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为689.2057，提示分子量为666；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₃₁H₃₈O₁₆，计算不饱和度为13。UV光谱在206nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而330nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3363cm^-1)、α，β-不饱和酯(1742cm^-1)、苯环骨架(1600,1518cm^-1)、糖苷键(823cm^-1)等。

参见图87-95，结合表5，化合物11的NMR信息显示与顺式-阿克苷是结构类似物，差异在于化合物11多了一个乙酰基，HMBC显示中心糖2位氢信号H-2'(δ_H 4.67)与乙酰基C-2””(δ_C 169.10)相关，说明乙酰基是连在中心糖的2位。因此，化合物11的结构为

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-2-acetyl-[4-O-cis-caff eoyl)]-β-D-glucopyranoside，简称为cistanoloside K。

表5化合物11和cis-acteoside在的DMSO-d₆中的¹H NMR和¹³C-NMR数据

化合物12的结构鉴定

浅黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(negative)给出准分子离子峰[M-H]^-m/z为591.2548(calcd.for C₂₉H₃₅O₁₃,591.2539)，提示分子量为592；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₉H₃₆O₁₃，计算不饱和度为12。UV光谱在208nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而310nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3378cm^-1)、α，β-不饱和酯(1649cm^-1)、苯环骨架(1603cm^-1)、糖苷键(825cm^-1)等。

参见图96-104，结合表6，化合物12的NMR信息显示与桂叶苷B₆是结构类似物，差异在于化合物12双键的耦合常数，双键质子氢信号δ_H 6.85(1H,d,J＝12.9Hz),5.78(1H,d,J＝12.9Hz)提示我们化合物12含有一对顺式双键。因此，化合物12的结构为

2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[6-O-cis-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside，简称为cistanoloside L。

表6化合物12和Osmanthuside B₆在的DMSO-d₆中的¹H NMR和¹³C-NMR数据

化合物13和化合物14的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z分别为691.2205[M+Na]⁺和691.2204[M+Na]⁺(calculated for C₃₁H₄₀O₁₆N_a,691.2209)，提示分子量为668；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₃₁H₄₀O₁₆，计算不饱和度为12。

参见图105-113和114-118，结合表7和表8，化合物13和14的NMR信息显示与acteoside是结构类似物。首先，ABX系统信号[δ_H7.02(1H,s),6.98(1H,d,J＝8.0Hz),6.76(1H,d,J＝6.8Hz)]及一对反式双键信号[δ_H 7.46(1H,d,J＝15.9Hz)and 6.19(1H,d,J＝15.9Hz)]提示反式咖啡酰基的存在。其次，另一个ABX系统信号[δ_H6.70(1H,s),6.69(1H,d,J＝8.0Hz),6.58(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz)]及一个次甲基信号δ_H 4.35(1H,dd,J＝3.0,8.0Hz,H-7)、一个亚甲基信号3.64(1H,m,H-8a),3.22(1H,m,H-8b)，说明苯乙醇基的2号位被连氧基团取代，H-7(δ_H 4.35)与H-8a(δ_H3.64)处的NOESY相关也证实了上述推论。此外，H-9(δ_H 3.32)与H-7(δ_H 4.35)和H-10(δ_H 1.09)处的NOESY相关，及H-10(δ_H 1.09)与C-9(δ_C63.38)处的HMBC相关提示上述连氧基团为乙氧基，并且连在苯乙基的7号位。化合物14的NMR信号与13十分类似，仅在苯乙基的8号位的氢有0.2ppm的差异，这是由于7号位的氢构型差异造成的。为了确认它们的构型，我们进行了旋光度测试，最终判定化合物13为7S，因为其旋光值为[α]_D-4.8°，相似于S-suspensaside([α]_D＝-4.7°)和S-suspensaside methylether([α]_D＝-4.7°)。化合物14为7R，其旋光值为[α]_D-34.4°，相似于R-suspensaside[α]_D＝-31.3°。因此，化合物13和14的结构被确认为

(7S)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside和

(7R)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside，分别简称为cistanoloside M和cistanoloside N。

化合物9和化合物10的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z分别为733.2316[M+Na]⁺和733.2318[M+Na]⁺，提示分子量为710；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₃₃H₄₂O₁₇，计算不饱和度为13。

参见图69-77和78-86，结合表7和表8，化合物9和10的NMR信息显示与化合物13和14是结构类似物，差异在于化合物9和10多了一个葡萄糖2位上的乙酰基。通过比较化合物的氢谱(9,δ_H 3.50,3.60；10,δ_H 3.50,3.80)及旋光值(9,[α]_D＝-4.6°；10,[α]_D＝-31.1°)，最终确定化合物9和10的结构为

(7S)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[2-ac etyl-4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside和

(7R)-2-ethyoxyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[2-a cetyl-4-O-trans-caffeoyl]-β-D-glucopyranoside，分别简称为cistanoloside I和cistanoloside J。

表7化合物9、10、13、14在的DMSO-d₆中的¹H NMR数据

表8化合物9、10、13、14在的DMSO-d₆中的¹³C-NMR数据

化合物15的结构鉴定

黄色无定型粉末，HR-ESI-MS(positive)给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z为485.1418，提示分子量为462；结合¹H和¹³C NMR确定其分子式为C₂₃H₂₆O₁₀，计算不饱和度为11。UV光谱在207nm处有较强吸收，提示有苯乙基的存在，而320nm处的较大吸收是肉桂酰基的强吸收峰。IR谱中显示含有羟基(3362cm^-1)、α，β-不饱和酯(1632cm^-1)、苯环骨架(1603,1514cm^-1)、糖苷键(825cm^-1)等。

参见图119-123，结合表9，化合物15的NMR信息显示与(E)-isosyringalide A是结构类似物，差异在于化合物15含有一对顺式双键。双键上的质子氢信号H-7”(δ_H 6.86)/H-8”(δ_H 5.80)与C-9”处的HMBC相关也证实了上述推论。因此，化合物15的结构为2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl-[6-O-cis-caffeoyl)]-β-D-glucopyranoside，简称为cistanoloside O。

表9化合物15和(E)-异丁香醛A在的DMSO-d₆中的¹H NMR和¹³C-NMR数据

实施例四

本实施例对十五种天然苯乙醇苷类化合物进行体外细胞毒性试验，其中采用的细胞株为RAW 264.7细胞，具体的试验方法和结果如下：

MTT法：将RAW 264.7细胞细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μL(含有10×10⁴个肿瘤细胞)，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h，加入不同浓度(100、50、0μg/ml)的本发明提供的十五种天然苯乙醇苷类化合物中的任一种，继续培养48h；实验结束前4h加20μL的MTT(5mg/mL)，继续在37℃、5％CO₂条件下孵育4h，吸取培养液后加入二甲基亚砜150μL，振摇至结晶完全溶解，然后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm，计算本发明化合物对RAW 264.7细胞的生存率，实验结果如图124所示。

由图124可知，十五种天然苯乙醇苷类化合物在本实验实施的浓度下均无明显的细胞毒性。实施例五中的抗炎实验药物浓度皆参考该实验结果。

实施例五

本实施例采用十五种天然苯乙醇苷类化合物进行了体外抗炎实验，其中采用的细胞株为RAW 264.7细胞，具体的实验方法和结果如下：

将RAW 264.7细胞接种于24孔细胞培养板，每孔500μL，在37℃、5％CO₂培养箱中，并且在含10％FBS的DMEM培养基中，培养24h，加入100ng/ml的脂多糖(LPS)和本发明提供的十五种天然苯乙醇苷类化合物中的任一种，继续在37℃、5％CO₂条件下培养。24h后收集培养基上清，根据NO测定试剂盒说明进行操作，测定NO的释放抑制率。

实验结果表明，如图125所示，十五种天然苯乙醇苷类化合物大部分都能抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中NO的释放，证明苯乙醇苷类化合物具有较好的体外抗炎活性。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。