梅毒螺旋体重组嵌合抗原及其制备方法、用途

文档序号：1265088 发布日期：2020-08-25 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 梅毒螺旋体重组嵌合抗原及其制备方法、用途 (Treponema pallidum recombinant chimeric antigen and preparation method and application thereof ) 是由干盈盈韩新鹏吕志强罗琴文丹华于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种梅毒螺旋体的重组嵌合抗原,其由如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列、第一柔性连接子、如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列、第二柔性连接子和如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列串联组成。本发明的重组嵌合抗原可用于梅毒螺旋体抗体的血清学检测,并具有改善的溶解表达能力、活性和热稳定性。本发明还涉及制备该重组嵌合抗原的方法。(The invention relates to a recombinant chimeric antigen of treponema pallidum, which is formed by connecting an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.12, a first flexible linker, an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.9, a second flexible linker and an amino acid sequence shown as SEQ ID NO.13 in series. The recombinant chimeric antigen can be used for serological detection of treponema pallidum antibodies and has improved dissolving expression capacity, activity and thermal stability. The invention also relates to a method for preparing the recombinant chimeric antigen.)

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体涉及一种梅毒螺旋体重组嵌合抗原。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP；也称为苍白螺旋体)引起的慢性、系统性性传播疾病，在《中华人民共和国传染病防治法》中，梅毒被列为乙类防治管理的病种。其传播途径主要为性传播，临床上梅毒分为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒(胎传梅毒)等。

梅毒是一种在全世界流行传染病，据WHO估计，全球每年约有1200万新发病例，主要集中在南亚、东南亚和次撒哈拉非洲。近年来梅毒在我国增长迅速，已成为报告病例数最多的性病。在所报告的梅毒中，潜伏梅毒占多数，一、二期梅毒也较为常见，同时先天梅毒报告病例数也在增加。梅毒是人类独有的疾病，显性和隐性梅毒患者均是传染源。

由于人体被梅毒螺旋体感染后的临床症状和体征无明显的特异性，难以藉由症状和体征进行分辨，所以临床上主要依赖血清学实验结果来进行诊断。

目前，梅毒螺旋体的常用免疫学检测方法主要有两类。一类是非梅毒螺旋体抗原血清试验，如性病研究实验室试验(VDRL)、快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)等。由于该类方法采用正常牛心肌心磷脂作为抗原，故存在特异性不高的问题，如抗心磷脂抗体阳性的血清和高脂血症均会产生假阳性反应。

另一类梅毒螺旋体免疫学检测方法是梅毒螺旋体抗原血清试验，如梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)等，该类方法采用的是Nichols株螺旋体作为抗原，但由于至今梅毒螺旋体不能在体外进行人工培养，抗原来源难度较高，试验操作繁琐，不易于推广。

为提供稳定的梅毒螺旋体抗原来源，目前已进行了一些研究尝试将抗原性蛋白(如TP15、TP17和TP47)融合表达，以提供天然梅毒螺旋体的替代物。然而，这些重组抗原在制备过程或用于免疫检测过程中或多或少存在一定的缺陷，限制了重组嵌合抗原在梅毒螺旋体检测中的应用。

因此，在梅毒螺旋体免疫学检测领域，存在着对重组嵌合抗原进行改善的强烈需求。

发明内容

有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种制备梅毒螺旋体的重组嵌合抗原的方法，包括：

1)将编码所述重组嵌合抗原的多核苷酸导入宿主细胞中，或者将含所述多核苷酸的多核苷酸构建体转入宿主细胞中；

2)在适合产生重组嵌合抗原的条件下培养步骤1)中的所述宿主细胞；以及

3)任选地从步骤2)获得培养物中分离所述重组嵌合抗原，

其中，所述重组嵌合抗原自N端到C端依次包括TP17片段、第一柔性连接子、TP15片段、第二柔性连接子和TP47片段的氨基酸序列，

其中，所述TP17片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述TP15片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，并且所述TP47片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

需要说明的是，本发明的TP17片段、TP15片段和TP47片段在野生型抗原的基础上，首先经过信号肽去除；随后，对TP17和TP15进行了N端截短处理，且对TP47进行了N端和C端截短处理；最后，对于TP17，在第42位和第58位进一步引入了特定突变，而对于TP47片段，在第315位残基进一步引入了特定突变。

在具体的实施方式中，所述多核苷酸序列自5’至3’依次包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列、编码第一柔性连接子的核苷酸序列、如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列、编码第二柔性连接子的核苷酸序列，和如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述多核苷酸构建体上带有SUMO标签。

在具体的实施方式中，所述宿主细胞携带有SUMO标签。

在一些实施方式中，本发明的制备方法额外包括去除SUMO标签的步骤。例如，可通过SUMO蛋白酶去除SUMO标签。

在第二方面，本发明提供了一种梅毒螺旋体的重组嵌合抗原，所述重组嵌合抗原自N端至C端依次包括如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列、第一柔性连接子、如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列、第二柔性连接子和如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。

在本发明的重组嵌合抗原的一个变型中，所述重组嵌合抗原额外地带有SUMO标签。

在第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸：

a)编码自N端至C端依次包括如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列、第一柔性连接子、如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列、第二柔性连接子和如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；或者

b)由如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列、编码第一柔性连接子的核苷酸序列、如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列、编码第二柔性连接子的核苷酸序列，和如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列顺序组成；或者

c)与a)或b)互补。

在一些实施方式中，本发明的多核苷酸编码本发明的重组嵌合抗原或本发明的蛋白。

在第四方面，本发明提供了一种多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体含有本发明的多核甘酸。

在具体的实施方式中，所述多核苷酸构建体上带有SUMO标签。

在第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的多核苷酸构建体或本发明的多核苷酸。

在第六方面，本发明提供了一种用于检测抗梅毒螺旋体抗体的组合物，所述组合物包括本发明的重组嵌合抗原。

在第七方面，提供了本发明的重组嵌合抗原在制备用于检测抗梅毒螺旋体抗体的试剂盒中的用途。

在第八方面，本发明提供了一种重组嵌合抗原，其通过本发明的制备梅毒螺旋体的重组嵌合抗原的方法而生产。

本发明通过信号肽去除、进一步截短、引入具体突变成功构建了一种经改进的梅毒螺旋体重组嵌合抗原，其具有以下有益效果：

一方面，与常规三联重组抗原相比，显著提高了抗原生产时的可溶性表达程度。

另一方面，具有较高的稳定性和活性，从而扩宽了重组嵌合抗原适用性范围和延长了保存周期。

又一方面，通过国家参考品检测和临床样本检测，充分证实了本发明重组嵌合抗原具有较高的活性并能够符合免疫诊断试剂开发的需求。

附图说明

图1示出了实施例2中梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-WTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图2示出了实施例3中梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-WTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图3示出了实施例5中梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-DTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图4示出了实施例6中梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-DTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图5示出了实施例8中梅毒螺旋体重组嵌合抗原28-DSTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图6示出了实施例9中梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-DSTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图7示出了实施例10中梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-DSTP17+15+47的表达纯化结果；从左到右，依次为：包涵体溶解上清、破碎液上清。

图8示出了实施例9中梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-DSTP17+15+47的酶切结果；从左到右，依次为：32-DSTP17+15+47的酶切前、32-DSTP17+15+47的酶切后。

图9示出了实施例10中梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-DSTP17+15+47的酶切结果；从左到右，依次为：CN-DSTP17+15+47的酶切前、CN-DSTP17+15+47的酶切后。

图10示出了梅毒螺旋体重组嵌合抗原的活性检测结果。

图11示出了梅毒螺旋体重组嵌合抗原的热稳定性检测结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

如前文所述，天然梅毒螺旋体生产困难、难以获得，这限制了基于梅毒螺旋体抗原的血清学检测的发展。虽然目前已制备了一些重组抗原，但这些抗原在生产和用于检测的环节仍有一定的不足，限制了梅毒螺旋体抗体检测试剂的开发，存在改善空间。基于此，本发明提供了一种新的经截短且经突变的重组TP17、TP15和TP47嵌合抗原。

本发明的重组嵌合蛋白包括TP17片段、TP15片段和TP47片段。

对于TP17片段，其以野生型TP17(GenBank登录号：AAA27472.1)为出发序列，首先去除了信号肽序列，保留25-156aa，得到如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；然后进一步进行N端截短，保留35-156aa，得到如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；随后进一步进行C42S和C58S突变，最终得到如SEQ ID NO.12所示的TP17片段。

对于TP15片段，其以野生型TP15(GenBank登录号：AAD00207.1)为出发序列，首先去除了信号肽序列，保留17-158aa，得到如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；然后进一步进行N端截短，保留36-158aa，得到如SEQ ID NO.9所示的TP15片段。

对于TP47片段，其以野生型TP47(GenBank登录号：AAA75016.1)为出发序列，首先去除了信号肽序列，保留20-434aa，得到如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；然后进一步进行N端和C端截短，保留26-396aa，得到如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；随后进一步进行C315S突变，最终得到如SEQ ID NO.13所示的TP47片段。

在本发明的重组嵌合蛋白顺序包括TP17片段、TP15片段和TP47片段，并且TP抗原片段之间通过连接子两两相连。

本发明所涉及的连接子为柔性连接子，其能够在连接TP抗原片段的同时保证它们各自的结构以及活性不受影响。对于柔性连接子的种类，本发明没有特别的限制，示例性的柔性连接子可以是带有甘氨酸的柔性连接子，如GSG、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG、GGGGSGGG、GGGGS和SGG等。

在具体的实施方式中，TP17片段与TP15片段之间通过第一柔性连接子相连，而TP15片段与TP47片段之间通过第二柔性连接子相连。第一柔性连接子和第二柔性连接子可以相同或不同。

除非特殊说明，本申请中的用语“第一”、“第二”等仅用于区分多个要素，而不意在表示要素之间重要性等方面的任何差异。

在一个具体的实施方式中，本发明的重组嵌合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在一个具体的实施方式中，本发明的重组嵌合抗原的编码序列如SEQ ID NO.28所示。

本领域技术人员能够理解，多核苷酸构建体用于通过重组表达制备重组嵌合抗原，该多核苷酸构建体包含可操作地连接到表达控制序列上的编码上述融合蛋白的核酸分子，另外包含用于在各自宿主细胞中维持和繁殖的遗传元件，如复制起点和/或选择标记基因。

本发明的多核苷酸构建体例如可以是原核宿主细胞例如细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或李斯特菌)中表达的噬菌体、质粒或粘粒载体；用于在酵母(例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母)中表达的载体；用于在昆虫细胞系统(例如，Sf9细胞)中表达的杆状病毒载体；用于在植物细胞系统中表达的病毒和质粒载体(例如，Ti质粒、花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)；以及用于在高等真核细胞或生物体中表达的病毒和质粒载体。通常，这样的载体可商购，或者可从保藏机构获得，或者可根据出版物的记载而获得(这些出版物描述这些载体的序列、结构和生成方法)，从而使得本领域技术人员能够应用它们。

示例性的多核苷酸构建体可以为pET系列载体、pCold^TMI载体等。

在优选的实施方式中，多核苷酸构建体带有SUMO标签。

如以下实施例中所证实的在使用带有SUMO的标签的多核苷酸构建体的情况下，所生产的重组嵌合抗体具有更好的活性和热稳定性，同时可溶性表达程度更佳。

根据所使用的多核苷酸构建体，本领域技术人员可以确定所对应的宿主细胞。例如，当选择pET系列载体或pCold^TMI载体的情况下，本领域技术人员知晓其适合在大肠杆菌宿主中进行表达。

本发明的重组嵌合抗原可用于检测梅毒螺旋体抗体的检测中。

例如，本发明的重组嵌合抗原可与可检测标记物标记，可以使用本领域技术人员熟知的任何标记物和标记方法。常用的标记物可包括酶(如HRP、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如³²P或¹²⁵I)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。

又例如，本发明的可以包被在固相支持物上。其中固相支持物是指可以附着重组嵌合抗原的固体表面。对用于本发明的固相支持物没有特别的限制，商品化的固相支持物及任何可用于免疫检测的固相支持物均可用于本发明。示例性的固相支持物可以是磁株、酶标板、塑料板、塑料管、乳胶珠、琼脂糖珠、玻璃、硝酸纤维素膜、尼龙膜、二氧化硅板或微芯片等。

实施例1野生型梅毒螺旋体重组嵌合抗原WTP17+15+47的序列设计

选取野生型TP17抗原去除信号肽之后的全长序列，即25-156aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；选取野生型TP15抗原去除信号肽之后的全长序列，即17-158aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；选取野生型TP47抗原去除信号肽之后的全长序列，即20-434aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

将上述三个抗原表位通过连接子1(如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列、SEQ IDNO.18所示的核苷酸序列)和连接子2(如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列)，按照TP17+连接子1+TP15+连接子2+TP47的顺序串联，所得到的氨基酸序列命名为WTP17+15+47(如SEQ ID NO.6所示)，该WTP17+15+47对应密码子优化后的核苷酸序列命名为wtp17+15+47(如SEQ ID NO.20所示)。

采用化学合成的方法得到上述wtp17+15+47核苷酸序列。

实施例2重组野生型嵌合抗原32-WTP17+15+47的构建及表达形式的确认

以实施例1中的wtp17+15+47为模板，以TP17-F(SEQ ID NO.29)和TP47-R(SEQ IDNO.30)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得wtp17+15+47核苷酸序列，将wtp17+15+47基因片段构建至pET32a载体中，所得到的重组载体命名为pET32a-wtp17+15+47。

将pET32a-wtp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于25℃诱导16小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为R pET32a-WTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对R pET32a-WTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬R pET32a-TP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图1所示。

结果表明，pET32a-WTP17+15+47以包涵体形式表达。

实施例3重组野生型嵌合抗原CN-WTP17+15+47的构建及表达形式的确认

采用化学合成的方法得到SUMO融合标签的核苷酸序列(SEQ ID NO.21，其中，SUMO融合标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)，以此作为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和SUMO-R(SEQ ID NO.32)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得SUMO融合标签的核苷酸序列。以实施例1中的wtp17+15+47为模板，以SUMO-TP17-F(SEQ ID NO.33)和TP47-R(SEQ ID NO.30)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得wtp17+15+47核苷酸序列。随后，以wtp17+15+47和SUMO融合标签的核苷酸序列为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和TP47-R(SEQ ID NO.30)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得将SUMO+wtp17+15+47基因片段构建至pCold^TM I载体中，所得到的重组载体命名为CN-wtp17+15+47。

将CN-wtp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于16℃诱导24小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为CN-WTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对CN-WTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mMPBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬CN-WTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图2所示。

结果表明，CN-WTP17+15+47以包涵体形式表达。

实施例4截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原DTP17+15+47的序列设计

选取的TP17的抗原表位为35-156aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；选取的TP15的抗原表位为36-158aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；选取的TP47的抗原表位为26-396aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

将上述三个抗原表位通过连接子1(如SEQ ID NO.4所示)和连接子2(如SEQ IDNO.5所示)，按照TP17+连接子1+TP15+连接子2+TP47的顺序串联，所得到的氨基酸序列命名为DTP17+15+47(如SEQ ID NO.11所示)，该DTP17+15+47对应密码子优化后的核苷酸序列为dtp17+15+47(如SEQ ID NO.25所示)。

采用化学合成的方法得到核苷酸序列得到上述dtp17+15+47。

实施例5截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-DTP17+15+47的构建及表达形式的确认

以实施例4中的dtp17+15+47为模板，以TP17-F2(SEQ ID NO.34)和TP47-R2(SEQID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得dtp17+15+47核苷酸序列，将dtp17+15+47基因片段构建至pET32a载体中，所得到的重组载体命名为pET32a-dtp17+15+47。

将pET32a-dtp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于25℃诱导16小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为RpET32a-DTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对R pET32a-DTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬R pET32a-DTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图3所示。

结果表明，pET32a-DTP17+15+47以包涵体形式的表达。

实施例6截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-DTP17+15+47的构建及表达形式的确认

采用化学合成的方法得到SUMO融合标签的核苷酸序列(SEQ ID NO.21)，以此作为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和SUMO-R(SEQ ID NO.32)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得SUMO融合标签的核苷酸序列。以实施例4中的dtp17+15+47为模板，以SUMO-TP17-F2(SEQ ID NO.36)和TP47-R2(SEQ ID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得dtp17+15+47核苷酸序列。随后，以dtp17+15+47和SUMO融合标签的核苷酸序列为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和TP47-R2(SEQ ID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得将SUMO+dtp17+15+47基因片段构建至pCold^TM I载体中，所得到的重组载体命名为CN-dtp17+15+47。

将CN-dtp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于16℃诱导24小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为CN-DTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对CN-DTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mMPBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬CN-DTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图4所示。

结果表明，CN-DTP17+15+47以部分上清、部分包涵体形式表达。

实施例7经突变的截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原DSTP17+15+47的序列设计

选取的TP17的抗原表位为35-156aa区域，并将第42位、第58位半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示；选取的TP15的抗原表位为36-158aa区域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；选取的TP47的抗原表位为26-396aa区域，并将第315位半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，对应的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

将上述三个抗原表位通过连接子1(如SEQ ID NO.4所示)和连接子2(如SEQ IDNO.5所示)，按照TP17+连接子1+TP15+连接子2+TP47的顺序串联，所得到的氨基酸序列命名为DSTP17+15+47(如SEQ ID NO.14所示)，该TP17+15+47对应密码子优化后的核苷酸序列为dstp17+15+47(如SEQ ID NO.28所示)。

采用化学合成的方法得到上述dstp17+15+47。

实施例8经突变的截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原28-DSTP17+15+47的构建及表达纯化

以实施例7中的dstp17+15+47为模板，以TP17-F2(SEQ ID NO.34)和TP47-R2(SEQID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得dstp17+15+47核苷酸序列，将dstp17+15+47基因片段构建至pET28a载体中，所得到的重组载体命名为pET28a-dstp17+15+47。

将pET28a-dstp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于25℃诱导16小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为R pET28a-DSTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对R pET28a-DSTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬R pET28a-DSTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图5所示。

结果表明，pET28a-DSTP17+15+47以包涵体形式表达。

取包涵体溶解上清进行NI柱纯化。上样缓冲液为：8M尿素20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；平衡缓冲液为：8M尿素，20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；洗杂缓冲液：8M尿素，20mMPBS，0.5M NaCl，30mM咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液为：8M尿素20mM PBS，300mM咪唑，pH7.4。

收集洗脱液，装入3000-3500道尔顿分子量的透析袋，在2-8℃条件下用4M尿素10mM PBS，1mM EDTA pH7.4透析目的蛋白洗脱液，期间换液降低尿素浓度至0，无尿素情况下(10mM PBS，1mMEDTA，pH7.4)透析两次。透析后的目的蛋白以12000rpm于2-8℃离心20min，收集上清于50mL离心管中，并测定抗原蛋白浓度。重组嵌合抗原命名为28-DSTP17+15+47。

实施例9经突变的截短型梅毒螺旋体重组嵌合抗原32-DSTP17+15+47的构建及表达纯化

以实施例7中的dstp17+15+47为模板，以TP17-F2(SEQ ID NO.34)和TP47-R2(SEQID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得dstp17+15+47核苷酸序列，将dstp17+15+47基因片段构建至pET32a载体中，所得到的重组载体命名为pET32a-dstp17+15+47。

将pET32a-dstp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于25℃诱导16小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为R pET32a-DSTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对R pET32a-DSTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬R pET32a-DSTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图6所示。

结果表明，R pET32a-DSTP17+15+47以部分可溶、部分包涵体形式表达。

取破碎液上清进行NI柱纯化。上样缓冲液为：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；平衡缓冲液为：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；洗杂缓冲液：20mM PBS，0.5M NaCl，30mM咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液为：20mM PBS，300mM咪唑，pH7.4。

收集洗脱液，装入3000-3500道尔顿分子量的透析袋，在2-8℃条件下用10mM PBS，1mMEDTA pH7.4透析目的蛋白洗脱液透析两次。透析后的目的蛋白以12000rpm于2-8℃离心20min，收集上清于50mL离心管中，并测定抗原蛋白浓度。重组嵌合抗原命名为32-DSTP17+15+47。

按1U/mg的比例加入凝血酶，于25℃酶切，酶切完成后，取样进行SDS-PAGE以确定蛋白的酶切效果，结果如图8所示，其中蛋白发生非特异性切割，目的蛋白被切碎。

实施例10梅毒螺旋体重组嵌合抗原CN-DSTP17+15+47的构建及表达纯化

采用化学合成的方法得到SUMO融合标签的核苷酸序列(SEQ ID NO.21)，以此作为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和SUMO-R(SEQ ID NO.32)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得SUMO融合标签的核苷酸序列。以实施例7中的dstp17+15+47为模板，以SUMO-TP17-F2(SEQ ID NO.36)和TP47-R2(SEQ ID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得dstp17+15+47核苷酸序列。随后，以dstp17+15+47和SUMO融合标签的核苷酸序列为模板，以SUMO-F(SEQ ID NO.31)和TP47-R2(SEQ ID NO.35)作为引物对，按照分子克隆实验指南所述方法进行PCR扩增、凝胶回收获得将SUMO+dstp17+15+47基因片段构建至pCold^TM I载体中，所得到的重组载体命名为CN-dstp17+15+47。

将CN-dstp17+15+47转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200rpm培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于16℃诱导24小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为CN-DSTP17+15+47。按上述确定的诱导条件对CN-DSTP17+15+47进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬CN-DSTP17+15+47发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。向沉淀中加入8M尿素20mM PBS，充分溶解包涵体，溶解完成后12000rpm 4℃离心20min，收集包涵体溶解上清。分别取破碎液上清和包涵体溶解上清进行SDS-PAGE以确定蛋白的表达形式，结果如图7所示。

结果表明，CN-DSTP17+15+47以可溶性表达为主。

收集洗脱液，装入3000-3500道尔顿分子量的透析袋，在2-8℃条件下用10mM PBS，1mM EDTA pH7.4透析目的蛋白洗脱液透析两次。透析后的目的蛋白以12000rpm于2-8℃离心20min，收集上清于50mL离心管中，并测定抗原蛋白浓度。重组嵌合抗原命名为CN-DSTP17+15+47。

按1U/mg的比例加入SUMO蛋白酶，于2-8℃酶切，酶切完成后，取样进行SDS-PAGE以确定蛋白的酶切效果，酶切效率很高，目的蛋白完整。

取酶切液进行NI柱纯化。上样缓冲液为：20mM PBS，pH7.4；平衡缓冲液为：20mMPBS，0.5M NaCl，pH7.4；洗杂缓冲液：20mM PBS，0.5M NaCl，30mM咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液为：20mM PBS，300mM咪唑，pH7.4。收集穿透液，装入3000-3500道尔顿分子量的透析袋，在2-8℃条件下用10mM PBS，1mM EDTA pH7.4透析目的蛋白洗脱液透析两次。透析后的目的蛋白以12000rpm于2-8℃离心20min，收集上清于50mL离心管中，并测定抗原蛋白浓度。重组嵌合抗原命名为CN-DSTP17+15+47酶切。

实施例11梅毒螺旋体重组嵌合抗原的活性检测

在其它生产工艺完全一致的情况下，分别用本发明的实施例8中新鲜制备的28-DSTP17+15+47、实施例9中新鲜制备的32-DSTP17+15+47、实施例10中新鲜制备的CN-DSTP17+15+47、CN-DSTP17+15+47酶切与HRP进行标记，采用双抗原夹心法原理进行化学发光免疫检测。

具体来说，首先将包被了TP15抗原、TP17抗原和TP47抗原的磁微粒、与上述标记了HRP的梅毒螺旋体重组嵌合抗原及TP质控品(迈克生物股份有限公司)进行混合反应，由于TP质控品中含有抗TP抗体，则会形成“包被抗原-抗体-HRP标记抗原”复合物；然后加入化学发光底物液，在迈克生物的IS 1200全自动化学发光测定仪上进行化学发光免疫检测，测定化学发光强度(RLU)，RLU值越高，说明“包被抗原-抗体-HRP标记抗原”复合物越多，即标记了HRP的梅毒螺旋体重组嵌合抗原与TP抗体的结合能力越强，从而反应嵌合抗原的活性越高。结果如图10所示。

结果表明，CN-DSTP17+15+47酶切的活性最高。

实施例12梅毒螺旋体重组嵌合抗原的热稳定性检测

在其它生产工艺完全一致的情况下，用本发明的实施例8中新鲜制备的28-DSTP17+15+47、实施例9中新鲜制备的32-DSTP17+15+47、实施例10中新鲜制备的CN-DSTP17+15+47、CN-DSTP17+15+47酶切四种重组抗原分别经37度热加速处理3天、7天和14天。随后，将经热加速处理的抗原分别与HPR进行标记，与包被有TP15、TP17、TP47的磁珠一起，采用双抗原夹心原理，对TP质控品(含有TP15抗体、TP17抗体、TP47抗体的混合质控品)，在迈克生物的IS 1200全自动化学发光测定仪上进行化学发光免疫检测，根据化学发光强度(RLU)，进行蛋白活性评价，结果如图11所示。

结果表明，CN-DSTP17+15+47酶切的重组抗原在经37度热加速处理3天、7天和14天后标记HRP信号值与新鲜制备的抗原间无明显差异，而其它抗原的信号值均有不同程度的下降，说明CN-DSTP17+15+47酶切的重组抗原热稳定性相对更佳。

实施例13梅毒螺旋体重组嵌合抗原的特异性、灵敏度评估

用本发明的实施例10中CN-DSTP17+15+47酶切重组抗原标记HRP，并与包被有TP15、TP17、TP47的磁珠一起，采用双抗原夹心原理，对TP梅毒螺旋体抗体化学发光试剂国家参考品(中国食品药品检定研究院，【批号】370036-201801)，在迈克生物的IS 1200全自动化学发光测定仪上进行化学发光免疫检测，根据化学发光强度(RLU)及计算得到的S/CO值，进行灵敏度评价，结果如下表1所示。

表1灵敏度检测结果

注：梅毒螺旋体(TP)抗体诊断试剂国家参考品，其中N1～N20为阴性参考品；P1～P10为阳性参考品，L1～L4为最低检出限参考品。阴性参考品要求测定结果为阳性的样本≤3例；阳性参考品要求10/10，最低检出限参考品要求≥2/4(L4需为阴性)。判断标准：当S/CO＜1时为阴性(-)，当S/CO≧1时为阳性(+)。

结果表明，CN-DSTP17+15+47酶切重组抗原检测梅毒螺旋体(TP)抗体阴性国家参考品、阳性国家参考品、灵敏度国家参考品全部符合要求。

实施例14梅毒螺旋体重组嵌合抗原的临床样本检测

用本发明实施例10中重组嵌合抗原CN-DSTP17+15+47酶切标记HRP，并与包被有TP15、TP17、TP47的磁珠一起，采用双抗原夹心原理，对1200例临床样本(确诊的梅毒阳性样本200例、梅毒阴性样本1000例)在迈克生物的IS 1200全自动化学发光测定仪上进行化学发光免疫检测，结果如下表2所示。

表2临床样本符合率的检测结果

检测结果与临床样本的确诊结果完全一致，说明CN-DSTP17+15+47酶切重组抗原的临床符合率可以满足免疫诊断试剂开发的需求。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 四川迈克生物新材料技术有限公司

<120> 梅毒螺旋体重组嵌合抗原及其制备方法、用途

<130> 2020

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 1

Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala Glu Lys Val

1 5 10 15

Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro Ala Ala

20 25 30

Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr

35 40 45

Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro

50 55 60

Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu

65 70 75 80

Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu

85 90 95

Leu Tyr Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro

100 105 110

Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys

115 120 125

Lys Thr Lys Lys

130

<210> 2

<211> 142

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 2

Met Val Lys Arg Gly Gly Ala Phe Ala Leu Cys Leu Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Gly Ala Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr

20 25 30

Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr

35 40 45

Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr

65 70 75 80

Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp

85 90 95

Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly

100 105 110

Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu

115 120 125

Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg

130 135 140

<210> 3

<211> 415

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 3

Cys Gly Ser Ser His His Glu Thr His Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Asp Tyr Trp Ala Gly Glu Leu Gly Gln Ser Arg Asp Val Leu

20 25 30

Leu Ala Gly Asn Ala Glu Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly

35 40 45

Met Phe Asp Ala Val Ser Arg Ala Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg

50 55 60

Gln Gln Phe Gln Tyr Ala Val Glu Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser

65 70 75 80

Lys Gln Glu Thr Glu Asp Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp Glu Tyr Glu

85 90 95

Thr Asp Pro Ser Val Thr Lys Met Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gln

100 105 110

Asp Leu Gly Glu Asp Gly Glu Ile Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala

115 120 125

Val Ala Leu Ala Asp Arg Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu

130 135 140

Tyr Lys Ile Thr Asn Val Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val

145 150 155 160

Ala Val Pro His Glu Leu Lys Gly Ile Ala Lys Glu Lys Phe His Phe

165 170 175

Val Glu Asp Ser Arg Val Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met

180 185 190

Leu Thr Glu Asp Ser Phe Ser Ala Arg Lys Val Ser Ser Met Glu Ser

195 200 205

Pro His Asp Leu Val Val Asp Thr Val Gly Thr Val Tyr His Ser Arg

210 215 220

Phe Gly Ser Asp Ala Glu Ala Ser Val Met Leu Lys Arg Ala Asp Gly

225 230 235 240

Ser Glu Leu Ser His Arg Glu Phe Ile Asp Tyr Val Met Asn Phe Asn

245 250 255

Thr Val Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Thr Asn Leu

260 265 270

Met Ala Ser Tyr Gly Thr Lys His Ser Ala Asp Ser Trp Trp Lys Thr

275 280 285

Gly Arg Val Pro Arg Ile Ser Cys Gly Ile Asn Tyr Gly Phe Asp Arg

290 295 300

Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Tyr Arg Leu Thr Leu Ile Ala Asn

305 310 315 320

Gly Tyr Arg Asp Val Val Ala Asp Val Arg Phe Leu Pro Lys Tyr Glu

325 330 335

Gly Asn Ile Asp Ile Gly Leu Lys Gly Lys Val Leu Thr Ile Gly Gly

340 345 350

Ala Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Ala Ala Val Asp Val Phe Ala Asp

355 360 365

Gly Gln Pro Lys Leu Val Ser Asp Gln Ala Val Ser Leu Gly Gln Asn

370 375 380

Val Leu Ser Ala Asp Phe Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Glu Val

385 390 395 400

Arg Phe Lys Glu Phe Gly Ser Val Arg Ala Lys Val Val Ala Gln

405 410 415

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> 连接子

<400> 4

Gly Ser Gly

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> 连接子

<400> 5

Ser Gly Gly

<210> 6

<211> 695

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 6

Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala Glu Lys Val

1 5 10 15

Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro Ala Ala

20 25 30

Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr

35 40 45

Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro

50 55 60

Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu

65 70 75 80

Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu

85 90 95

Leu Tyr Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro

100 105 110

Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys

115 120 125

Lys Thr Lys Lys Gly Ser Gly Met Val Lys Arg Gly Gly Ala Phe Ala

130 135 140

Leu Cys Leu Ala Val Leu Leu Gly Ala Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro

145 150 155 160

Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp

165 170 175

Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val

180 185 190

Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala

195 200 205

Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys

210 215 220

Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu

225 230 235 240

Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg

245 250 255

Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu

260 265 270

Ala Ile Ile Ser Arg Ser Gly Gly Cys Gly Ser Ser His His Glu Thr

275 280 285

His Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Ser Tyr Ala Asp Tyr Trp Ala Gly Glu

290 295 300

Leu Gly Gln Ser Arg Asp Val Leu Leu Ala Gly Asn Ala Glu Ala Asp

305 310 315 320

Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly Met Phe Asp Ala Val Ser Arg Ala

325 330 335

Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg Gln Gln Phe Gln Tyr Ala Val Glu

340 345 350

Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Lys Gln Glu Thr Glu Asp Ser Arg

355 360 365

Gly Arg Lys Lys Trp Glu Tyr Glu Thr Asp Pro Ser Val Thr Lys Met

370 375 380

Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gln Asp Leu Gly Glu Asp Gly Glu Ile

385 390 395 400

Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala Val Ala Leu Ala Asp Arg Ala Ser

405 410 415

Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu Tyr Lys Ile Thr Asn Val Lys Val

420 425 430

His Gly Met Lys Phe Val Pro Val Ala Val Pro His Glu Leu Lys Gly

435 440 445

Ile Ala Lys Glu Lys Phe His Phe Val Glu Asp Ser Arg Val Thr Glu

450 455 460

Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met Leu Thr Glu Asp Ser Phe Ser Ala

465 470 475 480

Arg Lys Val Ser Ser Met Glu Ser Pro His Asp Leu Val Val Asp Thr

485 490 495

Val Gly Thr Val Tyr His Ser Arg Phe Gly Ser Asp Ala Glu Ala Ser

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Val Met Leu Lys Arg Ala Asp Gly Ser Glu Leu Ser His Arg Glu Phe

515 520 525

Ile Asp Tyr Val Met Asn Phe Asn Thr Val Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly

530 535 540

Asp Asp Ala Ser Tyr Thr Asn Leu Met Ala Ser Tyr Gly Thr Lys His

545 550 555 560

Ser Ala Asp Ser Trp Trp Lys Thr Gly Arg Val Pro Arg Ile Ser Cys

565 570 575

Gly Ile Asn Tyr Gly Phe Asp Arg Phe Lys Gly Ser Gly Pro Gly Tyr

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Tyr Arg Leu Thr Leu Ile Ala Asn Gly Tyr Arg Asp Val Val Ala Asp

595 600 605

Val Arg Phe Leu Pro Lys Tyr Glu Gly Asn Ile Asp Ile Gly Leu Lys

610 615 620

Gly Lys Val Leu Thr Ile Gly Gly Ala Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp

625 630 635 640

Ala Ala Val Asp Val Phe Ala Asp Gly Gln Pro Lys Leu Val Ser Asp

645 650 655

Gln Ala Val Ser Leu Gly Gln Asn Val Leu Ser Ala Asp Phe Thr Pro

660 665 670

Gly Thr Glu Tyr Thr Val Glu Val Arg Phe Lys Glu Phe Gly Ser Val

675 680 685

Arg Ala Lys Val Val Ala Gln

690 695

<210> 7

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> SUMO

<400> 7

Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val

1 5 10 15

Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp

20 25 30

Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg

35 40 45

Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser

50 55 60

Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro

65 70 75 80

Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu

85 90 95

Gln Ile Gly Gly

100

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 8

Ala Lys Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg

1 5 10 15

Gly Thr Leu Pro Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr

20 25 30

Phe Asn Ala Asp Gly Thr Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys

35 40 45

Lys Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg

50 55 60

Glu Asp Gly Ile Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Lys

65 70 75 80

Ala Pro His Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val

85 90 95

Arg Tyr Met Gly Ala Pro Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala

100 105 110

Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys

115 120

<210> 9

<211> 123

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 9

Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln Asp

1 5 10 15

Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly

20 25 30

Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg

35 40 45

Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser Ser

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu

65 70 75 80

Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val

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Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Ala Ala Leu Leu Gln Ser Ala

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Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg

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<210> 10

<211> 371

<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 10

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Gly Glu Leu Gly Gln Ser Arg Asp Val Leu Leu Ala Gly Asn Ala Glu

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Ala Asp Arg Ala Gly Asp Leu Asp Ala Gly Met Phe Asp Ala Val Ser

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Arg Ala Thr His Gly His Gly Ala Phe Arg Gln Gln Phe Gln Tyr Ala

50 55 60

Val Glu Val Leu Gly Glu Lys Val Leu Ser Lys Gln Glu Thr Glu Asp

65 70 75 80

Ser Arg Gly Arg Lys Lys Trp Glu Tyr Glu Thr Asp Pro Ser Val Thr

85 90 95

Lys Met Val Arg Ala Ser Ala Ser Phe Gln Asp Leu Gly Glu Asp Gly

100 105 110

Glu Ile Lys Phe Glu Ala Val Glu Gly Ala Val Ala Leu Ala Asp Arg

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Ala Ser Ser Phe Met Val Asp Ser Glu Glu Tyr Lys Ile Thr Asn Val

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Lys Val His Gly Met Lys Phe Val Pro Val Ala Val Pro His Glu Leu

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Lys Gly Ile Ala Lys Glu Lys Phe His Phe Val Glu Asp Ser Arg Val

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Thr Glu Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Met Leu Thr Glu Asp Ser Phe

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Ser Ala Arg Lys Val Ser Ser Met Glu Ser Pro His Asp Leu Val Val

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Ala Ser Val Met Leu Lys Arg Ala Asp Gly Ser Glu Leu Ser His Arg

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<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

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65 70 75 80

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Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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245 250 255

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325 330 335

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<213> 梅毒螺旋体

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<213> 梅毒螺旋体

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<212> PRT

<213> 梅毒螺旋体

<400> 14

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tgcacaaccg tgtgtccgca cgccgggaag gccaaagcgg aaaaggtaga gtgcgcgttg 60

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<210> 16

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<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

<400> 16

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<210> 17

<211> 1248

<212> DNA

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<400> 17

tgtggctcgt ctcatcatga gacgcactat ggctatgcga cgctgagcta tgcggactac 60

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gttactaaga tggtgcgtgc ctctgcgtca tttcaggatt tgggagagga cggggagatt 360

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gacagcgagg aatacaagat tacgaacgta aaggttcacg gtatgaagtt tgtcccagtt 480

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cgcgttacgg agaataccaa cggccttaag acaatgctca ctgaggatag tttttctgca 600

cgtaaggtaa gcagcatgga gagcccgcac gaccttgtgg tagacacggt gggtaccgtc 660

taccacagcc gttttggttc ggacgcagag gcttctgtga tgctgaaaag ggctgatggc 720

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gactactacg gtgatgacgc gagctacacc aatctgatgg cgagttatgg caccaagcac 840

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<210> 18

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 连接子

<400> 18

ggtagtggt 9

<210> 19

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 连接子

<400> 19

tccggcggc 9

<210> 20

<211> 2088

<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

<400> 20

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aagggaggta tctttcgggg tacgctgcct gcggccgatt gcccgggaat cgatacgact 120

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tgggccgggg agttggggca gagtcgcgac gtgcttttgg cgggtaatgc cgaggcggac 960

cgcgcggggg atctcgacgc aggcatgttc gatgcagttt ctcgcgcaac ccacgggcat 1020

ggcgcgttcc gtcagcaatt tcagtacgcg gttgaggtat tgggcgaaaa ggttctctcg 1080

aagcaggaga ccgaagacag ccgcggacgc aaaaagtggg agtacgagac tgacccaagc 1140

gttactaaga tggtgcgtgc ctctgcgtca tttcaggatt tgggagagga cggggagatt 1200

aagtttgaag cagtcgaggg tgcagtagcg ttggcggatc gcgcgagttc cttcatggtt 1260

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attgggttga aggggaaggt gctgaccata gggggcgcgg acgcggagac tctgatggat 1920

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<210> 21

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> SUMO

<400> 21

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<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

<400> 22

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aaggtagagc ttgcccttga gaagaagtcg gcaccttctc ctcttaccta tcgcggtacg 180

tggatggtac gtgaagacgg aattgtcgaa ctctcgcttg tgtcctcgga gcaatcgaag 240

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<210> 23

<211> 369

<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

<400> 23

tcatttagtt ctatcccgaa tggcacgtac cgggcgacgt atcaggattt tgatgagaat 60

ggttggaagg actttctcga ggttactttt gatggtggca agatggtgca ggtggtttac 120

gattatcagc ataaagaagg gcggtttaag tcccaggacg ctgactacca tcgggtcatg 180

tatgcatcct cgggcattgg tcctgaaaag gccttccgtg agctcgccga tgctttgctt 240

gaaaagggta atccggagat ggtggatgtg gtcaccggtg caactgtttc ttcccagagt 300

ttccgtcgtt tgggtgcggc gcttctgcag agtgcgcggc gcggcgagaa ggaagccatt 360

attagccga 369

<210> 24

<211> 1113

<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

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gagacgcact atggctatgc gacgctgagc tatgcggact actgggccgg ggagttgggg 60

cagagtcgcg acgtgctttt ggcgggtaat gccgaggcgg accgcgcggg ggatctcgac 120

gcaggcatgt tcgatgcagt ttctcgcgca acccacgggc atggcgcgtt ccgtcagcaa 180

tttcagtacg cggttgaggt attgggcgaa aaggttctct cgaagcagga gaccgaagac 240

agccgcggac gcaaaaagtg ggagtacgag actgacccaa gcgttactaa gatggtgcgt 300

gcctctgcgt catttcagga tttgggagag gacggggaga ttaagtttga agcagtcgag 360

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attacgaacg taaaggttca cggtatgaag tttgtcccag ttgcggttcc tcatgaatta 480

aaagggattg caaaggagaa gtttcacttc gtggaagact cccgcgttac ggagaatacc 540

aacggcctta agacaatgct cactgaggat agtttttctg cacgtaaggt aagcagcatg 600

gagagcccgc acgaccttgt ggtagacacg gtgggtaccg tctaccacag ccgttttggt 660

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gcgagctaca ccaatctgat ggcgagttat ggcaccaagc actctgctga ctcctggtgg 840

aagacaggaa gagtgccccg catttcgtgt ggtatcaact atgggttcga tcggtttaaa 900

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gctgatgtgc gcttccttcc caagtacgag gggaacatcg atattgggtt gaaggggaag 1020

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<212> DNA

<213> 梅毒螺旋体

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tgtggtatca actatgggtt cgatcggttt aaaggttcag ggccgggata ctacaggctg 1680

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aaggtagagc ttgcccttga gaagaagtcg gcaccttctc ctcttaccta tcgcggtacg 180

tggatggtac gtgaagacgg aattgtcgaa ctctcgcttg tgtcctcgga gcaatcgaag 240

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