一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法
阅读说明：本技术 一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法 (Efficient preparation method of placenta extract containing multiple growth factors ) 是由 姚玲玲 杨苗 罗保君 孟得龙 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法,采用两步提取法,其中,第一步的机械法对组织进行匀浆,获得一部分组织细胞,第二步将组织匀浆不易破碎的组织进行多种酶混合酶解,获得剩余的组织细胞,从而获得最大量的组织细胞,进而获得更多种类的活性因子,提高活性因子的获得量,所以本发明提供的制备方法既提高了活性因子的种类,又提高了活性因子的获得量。(The invention discloses a high-efficiency preparation method of placenta extract containing multiple growth factors, which adopts a two-step extraction method, wherein a mechanical method is adopted for homogenizing tissues to obtain a part of histiocytes, and a second step is adopted for carrying out mixed enzymolysis on the tissues which are not easy to break after tissue homogenization to obtain the rest histiocytes, thereby obtaining the maximum histiocytes, further obtaining more types of active factors and improving the obtaining amount of the active factors.)
技术领域
本发明涉及一种胎盘提取液的制备方法，具体涉及一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
胎盘是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官，也是胎儿与母体之间物质交换的重要器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。胎盘还是一味中药，称之为紫河车，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎膜。
胎盘提取物一般是指从胎盘中提取到的有效的生物活性成分。胎盘提取物含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们参与细胞结构的维持、运动信息的交流以及组织的修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。
胎盘提取物在美容、抗衰、急救及生物治疗上具有很高的应用价值，胎盘提取物的研究已经是一个全世界的课题。
目前，胎盘提取物的制备方法主要有：溶媒提取法、直接提取法、酶解法。
溶媒提取法：使用比如乙醇等溶媒通过相溶性从胎盘组织中提取出有效成分。
直接提取法：对胎盘低温冻干、研磨，制作成为冻干粉。
酶解法：通过蛋白酶对胎盘组织进行酶解，之后对酶解液进行离心，获取提取物。
直接提取法由于获得的蛋白质分子量较大，不易吸收，所以相比其他两种方法，使用得比较少。
溶媒提取法由于溶媒可溶解的组织有限，所以不仅可提取的活性因子种类较少，而且活性因子的获得量也比较低。
酶解法由于酶解过程中标本的特异性不易做到统一，消化时间过长对细胞产生伤害，消化时间过短对组织消化不够充分，每种酶的专一性较强，不能做到对组织的完全酶解，所以提取过程中不仅所能获得活性因子的种类较少，而且活性因子的获得量也相对较低。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既能提高活性因子的种类又能提高活性因子获得量的人胎盘提取物的高效制备方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，采用两步提取法，具体包括以下步骤：
步骤1：在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；
步骤2：将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清颜色为无色或者淡黄色，弃上清，得胎盘组织；
步骤3：将离心所得胎盘组织匀浆、过滤，得滤液A；
步骤4：将滤液A进行-80℃和室温冻融，反复冻融多次，然后将滤液A离心，留上清并过滤，得滤液B；
步骤5：向匀浆后未能通过滤网的组织中添加胰酶，37℃恒温摇床酶解30-150min，终止酶解，得酶解液A；
步骤6：将酶解液A离心，沉淀加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解40-200min，终止酶解，得酶解液B；
步骤7：将酶解液B过滤，滤液离心，得沉淀B；
步骤8：向沉淀B中加入红细胞裂解液，裂解3-10min，离心，得沉淀C；
步骤9：向沉淀C中添加注射用水，-80℃和常温反复冻融3-4次，离心，得上清A；
步骤10：将滤液B和上清A混合，过滤，将滤液浓缩，即得人胎盘提取物。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤3中，向离心所得胎盘组织按照重量比1:5加入生理盐水，使用组织匀浆机进行组织匀浆，然后过400目滤网。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤5中，所用胰酶溶液的质量浓度为0.1％-0.5％，并且每1L胰酶溶液中含有0.2g EDTA，组织与胰酶溶液的重量比为0.5-10:1。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤6中，在前述混合酶溶液中，胶原酶II的质量浓度为0.05％-0.4％，DNase和透明质酸酶的浓度分别为20-100IU/ml、400-1000IU/ml，沉淀A与混合酶溶液的重量比为0.5-10:1。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤7中，酶解液B过滤前按照体积比1:3-10先加入生理盐水，然后用100um滤网过滤。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤8中，沉淀B与红细胞裂解液的体积比为1:3-10。
前述的含有多种生长因子的胎盘提取液的高效制备方法，其特征在于，在步骤10中，用0.45um滤网过滤。
本发明的有益之处在于：
(1)采用两步提取法，其中，第一步的机械法对组织进行匀浆，获得一部分组织细胞，第二步将组织匀浆不易破碎的组织进行多种酶混合酶解，获得剩余的组织细胞，从而获得最大量的组织细胞，进而获得更多种类的活性因子，提高活性因子的获得量，所以本发明提供的制备方法既提高了活性因子的种类，又提高了活性因子的获得量；
(2)本发明提供的制备方法通过增加去除红细胞的步骤(具体采用细胞裂解液)，有效降低了血红蛋白对胎盘提取物的影响，使得获得的胎盘提取物趋于无色。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、制备人胎盘提取物
本发明提供的人胎盘提取物的制备方法，采用两步提取法，主要包括以下步骤：
步骤1：处理胎盘
在无菌条件下取健康人胎盘，4h内运送至实验室，然后在无菌操作台内使用生理盐水清洗胎盘3次，并去除胎盘膜组织。
步骤2：离心
取适量胎盘，重量记为W0，将胎盘剪碎，加生理盐水，2000rpm离心5min，弃上清，反复离心至上清颜色为无色(或者淡黄色)，弃上清，得胎盘组织。
步骤3：匀浆
向离心所得胎盘组织中按照重量比1:5加入生理盐水，使用组织匀浆机进行组织匀浆，然后过400目滤网，得滤液A，将未能通过滤网的组织收集后称重，重量记为W1。
步骤4：反复冻融
将滤液A进行-80℃和室温冻融，反复冻融4次，然后将滤液A以5000rpm离心5min，弃沉淀，得上清，上清过40um滤网，得滤液B，放于4℃备用。
步骤5：首次酶解
向匀浆后未能通过滤网的组织中按照重量比0.5-10:1添加质量浓度为0.1％-0.5％的胰酶溶液(每1L胰酶溶液中含有0.2g EDTA)，37℃恒温摇床酶解30-150min，终止酶解，得酶解液A。
步骤6：二次酶解
将酶解液A以2000rpm离心5min，弃上清，沉淀加生理盐水，2000rpm离心5min，弃上清，得沉淀A，沉淀A称重，按照重量比0.5-10:1添加混合酶溶液，该混合酶溶液由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成，其中，胶原酶II的质量浓度为0.05％-0.4％，DNase的浓度为20-100IU/ml，透明质酸酶的浓度为400-1000IU/ml，37℃酶解40-200min，终止酶解，得酶解液B。
步骤7：离心
向酶解液B中按照体积比1:3-10加入生理盐水，用100um滤网过滤，滤液2000rpm离心5min，得沉淀B。
步骤8：裂解
向沉淀B中按照体积比1:3-10加入红细胞裂解液，裂解3-10min，2000rpm离心5min，弃上清，得沉淀C。
步骤9：再次冻融
向沉淀C中添加50-500ml注射用水，-80℃和常温反复冻融3-4次，5000rpm离心5min，得上清A。
步骤10：合并、浓缩
将滤液B和上清A混合，用0.45um滤网过滤，将滤液浓缩，即得人胎盘提取物，该人胎盘提取物趋于无色。
二、检测上述人胎盘提取物中活性因子的种类和含量
我们对制备得到的人胎盘提取物中的活性因子的种类和含量进行了检测，检测结果如下：
FGF
VEGF
FDGF-AB
IGF-1
EGF
TGF-β1
实施例1
685.2pg/ml
913.8pg/ml
139.7pg/ml
489pg/ml
64.5pg/ml
132.6pg/ml
实施例2
756.3pg/ml
1117pg/ml
159.8pg/ml
598.6pg/ml
75.9pg/ml
165.2pg/ml
实施例3
557.2pg/ml
725.8pg/ml
128.9pg/ml
312.3pg/ml
52.6pg/ml
99.8pg/ml
溶媒提取法
100.2pg/ml
65.5pg/ml
未检测到
未检测到
未检测到
未检测到
酶解法
231.5pg/ml
131.4pg/ml
86.2pg/ml
40.5pg/ml
未检测到
未检测到
由此可见，本发明提供的制备方法不仅提高了人胎盘提取物中活性因子的种类，而且明显提高了这些活性因子的含量。
FGF、VEGF、FDGF-AB、IGF-1、EGF和TGF-β1这6种活性因子可以有效的与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞营养代谢，预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害，促使真皮层胶原细胞的增生，可以加速修复术后皮肤，并具有抚平细纹、延缓皮肤老化等功能。
由于本发明制备得到的人胎盘提取物含有FGF、VEGF、FDGF-AB、IGF-1、EGF和TGF-β1等多种活性因子，并且这些活性因子的含量都较高，所以将该提取物制成制剂以后，使用效果会比现有制剂的使用效果更好。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。