干细胞条件培养基在制备用于治疗炎症性皮肤的药物中的用途
阅读说明：本技术 干细胞条件培养基在制备用于治疗炎症性皮肤的药物中的用途 (Application of stem cell conditioned medium in preparation of medicine for treating inflammatory skin ) 是由 徐辉明 杨孟波 高维强 王岚琦 鞠强 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种干细胞条件培养基在制备用于治疗炎症性皮肤药物中的用途,所述的干细胞的制备方法包括如下步骤：以人胎盘组织中羊膜和脐带组织为原料,然后通过剪碎,消化等方法得到羊膜上皮干细胞和脐带间充质干细胞,接着种在含有血小板裂解液的培养基中；将上面得到的原代细胞传代到第三代,当细胞汇合度达到90％时,将含有血小板裂解液的培养基弃去；更换成无血清的基础培养基,继续培养20-36h；收集培养过细胞的条件培养液,通过离心除去细胞和细胞碎片,即得到羊膜上皮干细胞条件培养基(AECM)和脐带间充质干细胞条件培养基(UMSCM)。本发明的AECM和UMSCM可以抑制患者皮肤的炎症细胞浸润皮肤,从而抑制表皮增生和炎症反应。(The invention provides an application of a stem cell conditioned medium in preparing a medicament for treating inflammatory skin, wherein the preparation method of stem cells comprises the following steps: the method comprises the following steps of taking an amniotic membrane and an umbilical cord tissue in a human placenta tissue as raw materials, obtaining amniotic epithelial stem cells and umbilical cord mesenchymal stem cells by methods of shearing, digestion and the like, and then inoculating the cells in a culture medium containing platelet lysate; passaging the primary cells to the third generation, and discarding a culture medium containing platelet lysate when the confluence degree of the cells reaches 90%; replacing with a serum-free basic culture medium, and continuing to culture for 20-36 h; collecting the conditioned medium of cultured cells, and centrifuging to remove cells and cell debris to obtain conditioned medium of amniotic epithelial stem cells (AECM) and conditioned medium of umbilical cord mesenchymal stem cells (UMSCM). The AECM and the UMSCM of the present invention can inhibit inflammatory cells of the skin of a patient from infiltrating the skin, thereby inhibiting epidermal hyperplasia and inflammatory response.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于治疗银屑病的药物，具体来说是干细胞条件培养基在制备用于治疗炎症性皮肤的药物中的用途。
背景技术
炎症性皮肤病都是由免疫系统对环境因素诱导刺激以免疫系统异常活化引起的一系列反复发作的皮肤疾病，已经成为全球主要的健康问题之一，医疗保健支出用于该类疾病治疗的比例逐年升高。典型难治性炎症性皮肤病—银屑病，它是一种普遍的慢性炎症性皮肤病，主要的特征是以T淋巴细胞为主的多种类型的免疫细胞大量浸润和表皮角质形成细胞异常增生引起的表皮棘突延长、分化异常所致的角质细胞分化不全等。对于银屑病的发病机制还没有充分理解，但大量证据表明环境因素、基因敏感性、皮肤屏障的破坏和免疫异常这些因素的共同作用参与疾病的发生和发展。皮肤屏障被破坏，从而使得环境中的物质进入皮肤又进一步诱导皮肤的免疫反应和皮肤炎症。其中炎症因子IL-17A在银屑病的发病机制中起关键的作用，IL-17A诱导了角质细胞的异常增殖和分化异常，并且角质细胞和其它免疫细胞一起参与维持炎症的恶性循环。其中真皮的γδT细胞是IL-7A的主要来源。
银屑病是无法治愈的疾病，常罹患终身。临床治疗以控制症状为目标。局部病变、早期轻症患者可通过局部给予外用药物及紫外线光疗，常用药物有保湿剂、润肤剂、糖皮质激素、维生素D3衍生物、钙调磷酸酶抑制剂、维A酸等。中重度患者系统治疗药物包括甲氨蝶呤、环孢素、维A酸口服以及各种生物制剂。然而，长期使用这些药物导致了一些副反应，药物抵制和药物耐受等问题。最近，一些生物制剂开始被探索，如TNF拮抗剂，和针对IL-12、IL-23、IL-17的抗体。这些生物制剂比传统的药物有效，但是长期使用面临昂贵的医药费用的问题。所以，开发副作用小、安全性高、疗效好的生物制剂对于银屑病等免疫异常引起的皮肤病的治疗具有迫切的必要性。
成体干细胞包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和羊膜上皮干细胞(amniotic epithelial cells，AEC)作为目前应用最广泛的干细胞，在许多免疫和炎症相关的疾病中已经表现出治疗效果。其中干细胞的旁分泌因子，在调节免疫、抑制炎症、组织修复和再生中起着重要的作用。旁分泌因子，包括生长因子(EGF、KGF、FGF等)、免疫调节因子：白介素-1的拮抗剂(IL-ra)、IL-10、IL-13、转化生长因子β(TGFβ)、一些受体、趋化因子等，他们具有营养和免疫调节特性，因此，成体干细胞的分泌物，也就是成体干细胞的条件培养基(CM)在疾病的治疗中可能有作用。而干细胞来源的CM目前没有报道，其中人的脐带来源的MSC的CM(UMSCM)和人的羊膜来源的羊膜上皮干细胞CM(AECM)也没有被报道。其中人的脐带和羊膜，来源充足，它们提取的细胞(UMSC和AEC)具有高效增殖和多向分化潜能，在许多免疫相关的疾病中能够调节免疫失调，抑制炎症，缓解疾病的症状。而且干细胞可以分泌多种生长因子、免疫调节因子。因此，本发明采用应用比较广泛的成体干细胞条件培养基：包括人的脐带间充质干细胞调节培养基(UMSCM)和人的羊膜上皮干细胞调节培养基(AECM)，它们可能成为银屑病等炎症性皮肤病极具潜力的治疗手段之一。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了干细胞调节培养基在制备用于治疗炎症性皮肤的药物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中的药物对于质量炎症性皮肤的效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种干细胞调节培养基在制备用于治疗银屑病的药物中的用途，所述的干细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤一，以产妇分娩后的医疗废物人胎盘组织中分离羊膜为原料，将羊膜靠近胎儿的一层羊膜上皮层用镊子剥离，然后剪碎，采用质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化20～40分钟，再用胶原酶消化0.5～2小时，然后过滤，离心得到羊膜上皮干细胞，将羊膜上皮干细胞种在添加了人血小板裂解液的DMEM/F12培养基中；
或者，
以产妇分娩后的医疗废物脐带为原料，先将脐带用PBS洗干净，去掉血，接着用齿镊去掉脐动脉和脐静脉。然后，用剪刀剪碎成直径为2～4mm的组织块，贴于培养皿中，加上含有人血小板裂解物的alpha-MEM培养基，7天后换液，14天以后就得到脐带间充质干细胞；
步骤二，将上面得到的脐带间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞原代细胞消化传代，继续培养到第三代；
步骤三，当第三代细胞汇合度达到90％时将含有血小板裂解液的培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞；
步骤四，更换成无血清的基础培养基继续培养20～36小时；对于羊膜上皮干细胞的无血清的基础培养基为DMEM/F12培养基，对于脐带间充质干细胞的无血清的基础培养基为是alpha-MEM培养基。
步骤五，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养过细胞的条件培养液，然后用除菌过滤，即得到干细胞条件培养基。
进一步的，所述的干细胞条件培养基的有效成分IL-1ra、IL-10、KGF、bFGF，IL-1ra含量是400-1000pg/ml,IL-10是50-200pg/ml,KGF，EGF的含量是50-200pg/ml，bFGF的含量是50-200pg/ml。
本发明提供两种成体干细胞细胞条件培养基(UMSCM和AECM)在炎症性皮肤用药制备中的应用。所述炎症性皮肤病适用于银屑病，特异性皮炎，湿疹，神经性皮炎，玫瑰痤疮，脂溢性皮炎，过敏性皮炎，激素依赖性皮炎，扁平苔藓。
本发明的干细胞条件培养基皮肤外用药，还具有这样的特征，在条件培养基皮肤外用药中可以添加药学上可接受的等渗剂、抑菌剂、稳定剂、增粘剂、固化剂、蛋白质保护剂、药剂载体等。
寻常型银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病，本发明中的AECM和UMSCM中含有抑炎因子(包括IL-ra、IL10、IL13、TGFβ)可以抑制患者皮肤的炎症细胞浸润皮肤，从而抑制表皮增生和炎症反应。
本发明中的干细胞条件培养基(CM)，包括人的羊膜上皮干细胞CM(AECM)和人的脐带间充质干细胞CM(UMSCM)，其有效成分包含抑炎因子IL1ra(白细胞介素IL-11和IL-11的抑制剂)、IL10(白细胞介素10)、IL13(白细胞介素13)、TGFb(转化生长因子b)等、趋化因子(MCP-1、CCR)，细胞生长因子:角质细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(包括bFGF、FGF9、FGF11、FGF13等)、(血小板衍生生长因子(PDGF)、细胞黏附分子(NrCAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-5)等。抑炎因子(IL-1ra和IL10等)可以抑制患者皮肤的炎症细胞浸润皮肤，从而抑制表皮增生和炎症反应。生长因子(KGF，FGF，EGF等)可以促进患者损伤的皮肤屏障的修复。
我们已经在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中验证了AECM和UMSCM对银屑病小鼠模型的皮肤症状的缓解效果，包括减少银屑、表皮变薄、减少免疫细胞入侵，皮肤屏障基因表达增加等，而且AECM有更好的治疗效果。所以，干细胞条件培养基包括AECM和UMSCM可能对寻常型银屑病有不错的治疗效果；而且，人的干细胞条件培养基无动物源成分、无致瘤风险、且不涉及干细胞移植的安全问题、无伦理问题、使用简单、方便(外用)、价格适中，能在广大患者中推广使用。干细胞条件培养基是治疗寻常型银屑病的一种新的生物制剂。
本发明的应用，还具有这样的特征：脐带间充质干细胞和羊膜上皮干细胞都是从医疗废物即产妇生产的脐带组织和胎盘的羊膜提取来的，没有伦理争议的问题、来源充足。
本发明的成体干细胞条件培养基，还具有这样的特征，含有丰富的生长因子，起着营养支持作用，还含有抑炎因子、趋化因子等，起着免疫抑制的作用。
本发明的成体干细胞条件培养基相对于干细胞产品在药物制备上有更好的特点，它不是细胞产品，安全性更好。另外，我们可以通过体外实验，确定成体干细胞条件培养基中的关键的分泌因子，从而更容易控制干细胞条件培养基的质量。另外，从用药方式而言，干细胞培养基可以采取外用药的方式，这种用药方式对于皮肤病治疗来说，比较普遍而且易于患者接受。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。1.本发明发现了人脐带间充质条件培养基和羊膜上皮间充质干细胞条件培养基作为皮肤外用药的制药用途，首次发现并证明来源于人脐带间充质条件培养基和人羊膜上皮干细胞的条件培养基能够抑制修复银屑病的病损，抑制皮肤炎症，并且人羊膜上皮干细胞的条件培养基治疗效果更好。2、使用本发明的干细胞条件培养基外用来治疗银屑病，免疫原性低，避免直接使用细胞，安全有效，产品稳定性高。而且避免皮下注射给患者带来二次损伤。3、本发明为临床利用干细胞条件培养基治疗免疫性疾病提供新的思路和理论依据，推动干细胞治疗银屑病的转化科学研究。
附图说明
图1：本发明实施例1和2的羊膜上皮干细胞(hAEC)和人的脐带间充质干细胞(UMSC)的相差形态特点。
图2显示了不同正常对照组(CON)，咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ)，脐带间充质干细胞条件培养基治疗组(IMQ+UMSCM，UMSCM组)，羊膜上皮干细胞条件培养基治疗组(IMQ+AECM，AECM组)的皮肤症状。
图3显示了正常对照组(PBS)、咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ)和治疗组(UMSCM)、治疗组(AECM)中皮肤Ki67免疫荧光染色图，表示角质层细胞的增殖情况。
图4显示了正常对照组(PBS)、咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ)和治疗组(UMSCM)、治疗组(AECM)中皮肤中性粒细胞marker-Gr-1的免疫荧光染色图，表示中性粒细胞入侵皮肤的情况。
图5显示了正常对照组(PBS)、咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ)和治疗组(UMSCM)、治疗组(AECM)中皮肤中入侵的分泌IL-7A的T阳性细胞和阴性细胞的流式分析图。
图6显示了为正常对照组(PBS)、咪喹莫特诱导的银屑病模型组(IMQ)和治疗组(UMSCM)、治疗组(AECM)中皮肤中炎症因子和招募免疫细胞的趋化因子的RNA表达图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
在本说明书中，术语“人的脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells)”是来源于脐带的华通氏胶和血管周围组织中的一种间充质干细胞。而“羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial cells，hAEC)”是指来源于胎盘羊膜的上皮层的一种上皮干细胞。它们来源于医疗废物胎盘和脐带，所以，没有伦理学的问题、免疫原性低、无致瘤的。并且，这两种干细胞都具有高效增殖和多向分化潜能，具有免疫调节的功能，可以分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子、抑炎因子、免疫调节因子。
在本发明的实施方式中，“人的脐带间充质干细胞条件培养基(UMSCM)和人的羊膜上皮干细胞件培养基(AEC-CM)”是指体外培养人的脐带间充质干细胞和人羊膜上皮细胞时，微囊泡及多种蛋白质等生物活性成分直接分泌到培养基中由此形成的条件培养基。以此条件培养基制备皮肤用药。
下述实施例的实验材料中，血小板裂解物是UltraGROTM-Advanced(AventaCellBioMedical)、它的体积比为5％。DMEM/F12(Thermofisher,21041025)，a-MEM(Thermofisher,41061029)，胰酶(Thermofisher，15090046)；胶原酶(Thermofisher，17018029)。
实施例1：人的脐带间充质干细胞条件培养基皮肤用药的制备(UMSCM)
1)人的脐带间充质干细胞分离培养：将人的脐带用用无菌生理盐水清洗干净后，用齿镊去掉脐动脉和脐静脉血管，并把表皮撕掉后剩下的组织，剪成3mm大小的组织块，然后，采取组织爬片的方法，让组织贴在培养皿中，加上含有体积百分比浓度为5％的血小板裂解液的培养基alpha-MEM。7天后缓慢换液，大约2周后，细胞从组织块中爬出来。当细胞达到90％的密度时进行传代培养，脐带间充质干细胞的形态见图1。
2)收集干细胞条件培养基：继续加有血小板裂解液的培养基中培养脐带间充质干细胞或羊膜上皮干细胞至第3代，当细胞汇合度达到约90％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞3次，更换成无血清培养基继续培养24小时，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液使用0.22um无菌滤器除菌过滤，即得到脐带间充质干细胞或羊膜上皮细胞条件培养基。
2)将上面干细胞条件培养基加入防腐剂和蛋白稳定剂等制备成皮肤外用药。
实施例2：人的羊膜上皮细胞条件培养基皮肤用药的制备(AECM)
1)羊膜上皮干细胞分离培养：从人胎盘组织中分离羊膜，用无菌生理盐水清洗干净后，分离出上皮层，靠近胎儿的一层，然后先用质量百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶消化30分钟，然后再用0.1g/L的胶原酶消化1小时，最后，过滤离心获得原代羊膜上皮干细胞，在含有体积百分比浓度为5％的血小板裂解物的DMEM/F12培养基中，当发现细胞集落生长，贴壁细胞融合至80％-90％时，用质量百分比浓度为0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养；羊膜上皮干细胞的镜下形态特点如图1所示。
2)收集干细胞条件培养基：继续加有血小板裂解液的培养基中培养脐带间充质干细胞或羊膜上皮干细胞至第3代，当细胞汇合度达到约90％时将培养基弃去，以无菌PBS洗涤细胞3次，更换成无血清培养基继续培养24小时，通过离心除去细胞和细胞碎片，收集培养液使用0.22um无菌滤器除菌过滤，即得到脐带间充质干细胞或羊膜上皮细胞条件培养基。
3)将上面干细胞条件培养基加入防腐剂和蛋白稳定剂等制备成皮肤外用药。
实施例3：人的脐带间充质干细胞和人的羊膜上皮细胞条件培养基的质量鉴定
1)将干细胞条件培养基进行无菌检测、支原体、内毒素等的检测。
2)将干细胞条件培养基进行独立和过敏测试实验。
3)将干细胞条件培养基进行BCA定量，测定总的蛋白量和里面重要的因子的蛋白定量。具体的是有效成分IL-1ra,IL-10,KGF,bFGF的含量检测，对于IL-1ra含量是400-1000pg/ml,IL-10是50-200pg/ml,KGF，EGF、bFGF和含量是50-200pg/ml.
实施例4：采用上述实施例的人的脐带间充质干细胞条件培养基和羊膜上皮干细胞条件培养基对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的治疗效果。
咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型。建立方法为：8周龄Balb/c雌鼠，随机分为4组：正常对照组、模型组(IMQ组)、UMSC治疗组(UMSCM+IMQ组)AECCM组、AECM治疗组(AECM+IMQ组)，每组5只；
小鼠背部用脱毛膏脱毛，脱毛面积约2cm×3cm。两天后，用咪喹莫特软膏IMQ构建模型及分组给药；
正常组：每日定时在小鼠背部湿敷基础培养基两次，上午一次，下午一次，每次约30分钟，下午湿敷完毕约2小时后，予以62.5mg凡士林均匀涂抹在小鼠背部皮肤；
IMQ模型组：每日定时在小鼠背部湿敷基础培养基两次，上午一次，下午一次，每次约30分钟，下午湿敷完毕约2小时后，予以62.5mg咪喹莫特(IMQ)均匀涂抹在小鼠背部皮肤；
AECM组：每日定时在小鼠背部湿敷AECM两次，上午一次，下午一次，每次约30分钟，下午湿敷完毕约2小时后，予以62.5mg IMQ均匀涂抹在小鼠背部皮肤；
UMSCM组：每日定时在小鼠背部湿敷UMSCM两次，上午一次，下午一次，每次约30分钟，下午湿敷完毕约2小时后，予以62.5mg IMQ均匀涂抹在小鼠背部皮肤；
每日拍照记录，6天后，处死小鼠取样。取小部分皮肤组织用于制作石蜡切片、冰冻切片及RNA、蛋白质提取，剩余皮肤组织酶解消化提取皮肤淋巴细胞。
根据皮肤的银屑和红肿来判断银屑病样小鼠的皮损程度，结果如图2所示。通过石蜡切片，苏木素伊红(H&E)染色来判断表皮的厚度。图2A显示IMQ相对于对照组增加了银屑和皮肤厚度，但UMSCM和AECM减少了银屑和皮肤厚度，AECM组效果更好。图2B为不同组的皮肤HE染色，结果显示IMQ组相对于CON组明显增加了表皮的厚度，UMSCM和AECM治疗组减少了表皮的厚度。图2C是2B的定量结果。
如图3所示，通过Ki-67免疫染色来观察皮肤的异常增生。Real-time PCR来检测表皮的基因表达来判断表皮的异常分化。从而来观察皮肤的屏障功能。图3A显示相对于CON组，IMQ组的皮肤角质层细胞明显异常增殖。而治疗组UMSCM和AECM抑制了角质层细胞的异常增殖，而AECM组有更好的抑制效果。图3B是3A的定量结果。图3C是角质层分化的标记基因的表达，在银屑病中，Filaggrin(FLG)和Hornerin(HRNR)减少，Involucrin(IVL)增加，同样的，IMQ组的皮肤中FLG和HRNR较少，IVL增加，然而，AECM或者UMSCM增加了FLG和HRNR的表达，而减少了IVL的表达，这表明，这两种干细胞培养基能抑制角质层的异常分化和异常增生，从而维持皮肤屏障的功能。而且，AECM有更好的治疗效果。
通过中性粒细胞的免疫染色和流式来判断免疫细胞的入侵。如图4A，表示相对于对照组，IMQ组中入侵的中性粒细胞明显增多，而UMSCM和AECM可以减少中性粒细胞的入侵。而AECM对中性粒细胞的抑制效果更好。图4B,是4A的定量结果。图5A表示相对于对照组，IMQ表示入侵皮肤的分泌IL-7A的T阳性细胞和阴性细胞的都增加，而AECM和UAECM可以降低这两种免疫细胞入侵皮肤，而且，AECM有更好的抑制效果。图5B是5A定量的结果。
通过Real-time PCR来检测皮肤的炎症因子和趋化因子的分泌，如图6所示，相对于对照组，IMQ表示炎症因子TNF、IL-1、IL-17A、CCL20、IL-8都增加，而AECM和UAECM可以降低这炎症因子和趋化因子的表达，而且，AECM有更好的抑制效果。
以上仅实施例也仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：动物睾丸提取物及其制备方法和应用