阅读说明：本技术 植物发酵物及其制备方法与用于肝脏保健的用途 (Plant fermentation product, preparation method thereof and application of plant fermentation product in liver health care ) 是由 林咏翔 庄伟秀 于 2019-04-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及发酵领域,尤其是关于一种植物发酵物及其制备方法与用于肝脏保健的用途。本发明提供一种植物发酵物,该植物发酵物是将由一葛根萃取物及一枳椇子萃取物所组成的混合物以酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌依序进行三段式发酵而获得。本发明提供所述植物发酵物用于制备一肝脏保健的组合物的用途。所述植物发酵物能有效提升肝脏细胞抗氧化活性,以预防受氧化压力的伤害,同时能有效提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、及MRPS5基因的表现量,以提升肝脏细胞的抗老化活性。(The invention relates to the field of fermentation, in particular to a plant fermentation product, a preparation method thereof and application thereof in liver health care. The invention provides a plant fermentation product, which is obtained by sequentially carrying out three-stage fermentation on a mixture consisting of a kudzu root extract and a raisin tree seed extract by using yeast, lactobacillus and acetobacter. The invention provides application of the plant fermentation product in preparing a liver health-care composition. The plant fermentation product can effectively improve the antioxidant activity of liver cells to prevent the liver cells from being damaged by oxidation pressure, and can effectively improve the expression quantities of CCT7 gene, CCT8 gene, Pink1 gene and MRPS5 gene in the liver cells to improve the anti-aging activity of the liver cells.)

植物发酵物及其制备方法与用于肝脏保健的用途

技术领域

本发明涉及发酵领域，尤其是关于一种植物发酵物及其制备方法与用于肝脏保健的用途。

背景技术

在生物学及医学上，老化(aging)是指一个生物体的生理状态随时间而恶化的现象，老化会造成身体各部分组织或器官机能衰退或功能减弱，使得生物体的健康功能变差，最后导致生物体死亡，现代人生活压力大，长期压力的累积会加速身体机能老化，也衍生出许多慢性疾病。

另外，随着保健意识的抬头及医疗技术的进步，人均寿命增长，但老化所造成的机能退化依然伴随年龄的增长而加剧，因此除了在疾病的治疗及预防外，老化的预防也是高龄社会的重要课题之一。

虽然目前已研究出许多与老化相关的基因以及相关的机制，但是目前仍然没有能有效应用于推迟老化的药物或方法，临床上只能建议从饮食上多摄取具抗氧化活性物质的食物、及减少饮酒等不良饮食习惯，并维持适当运动与保持正常作息及心情愉悦。

肝脏是人体内最大的器官，兼具消化、解毒等多种生理功能，因此肝脏若老化会使全身的生理机能出现问题。然而，因为肝脏细胞的再生能力很强，且肝脏又为沉默的器官，很难自行察觉肝脏的不适或老化。

综上所述，为了能方便又有效达到推迟老化的功效，特别是针对维持人体正常机能非常重要的肝脏于年轻有活力的状态，开发一种能有效提升肝脏细胞中抗老化基因表现量、以及提升肝脏细胞抗氧化能力的综合性肝脏保健的组合物，着实有其必要性。

发明内容

因此，本发明的一目的在提供一种植物发酵物，其中该植物发酵物是由一葛根及一枳椇子的混合物经由一溶剂萃取所得的萃取物，再经由一酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、一乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸杆菌(Acetobacteraceti)依序进行发酵而获得。

本发明的又一目的在提供一种如前所述的植物发酵物用于制备一肝脏保健的组合物的用途；其中该植物发酵物的有效浓度为至少0.5％(v/v)。

本发明的另一目的在提供一种植物发酵物的制造方法，包含：将一葛根萃取物、及一枳椇子萃取物所组成的混合物经由一酵母菌、一乳酸杆菌、及一醋酸杆菌依序进行三阶段发酵而获得。

在本发明的一实施例中，该葛根及该枳椇子的混合物是以水为溶剂在50-100℃下萃取0.5-3小时所获得；且该葛根、该枳椇子、及水是以1-3∶1∶25-35(w/w)的比例混合。

在本发明的又一实施例中，该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；该乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸杆菌的添加量为1-20％(w/w)；且该酵母菌是BCRC20271的菌株；该乳酸杆菌是BCRC910805的菌株；该醋酸杆菌是BCRC11688的菌株。

在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是提升一肝脏细胞的抗氧化活性。

在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是提升一肝脏细胞的抗老化活性；且该植物发酵物是提升该肝脏细胞的线粒体活性、清除错误折迭蛋白质的能力、及/或提升细胞中NAD⁺的浓度。

在本发明的又一实施例中，该植物发酵物是提升一肝脏细胞中含TCP1的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1，CCT)基因、PTEN促进激酶(PTEN-induced putativekinase 1，Pink1)基因、及线粒体核糖体蛋白5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)基因的表现量；且该CCT基因是为TCP1的折迭蛋白7(Chaperonin containing TCP17，CCT7)基因、TCP1的折迭蛋白8(Chaperonin containing TCP1 8，CCT8)基因、或其组合物。

在本发明的另一实施例中，该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；该乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸杆菌的添加量为1-20％(w/w)；且该酵母菌、该乳酸杆菌、及该醋酸杆菌的发酵时间比为1-5∶1-5∶3-10。

本发明将葛根及枳椇子混合物的萃取物以酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌进行三段式发酵所得的植物发酵物，能直接且有效提升肝脏细胞的抗氧化活性，能提升肝脏细胞清除活性氧化物的能力以预防受氧化压力的伤害；本发明的植物发酵物亦能有效提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、及MRPS5基因的表现量，以提升肝脏细胞的线粒体活性、清除错误折迭蛋白质的能力、及提升细胞中NAD⁺的浓度，而能够提升肝脏细胞的抗老化活性，使肝脏细胞的生理状况更为年轻且延长寿命。中医五行经络是气血运行的通道，如经络通则百病消，而本发明的植物发酵物能够清除自由基、排毒，达到提升精气神的功效，又能提升回春相关基因的表现量，而能提升肝脏抵御力及回春的保健功效，以调理肝脏经络。因此，本发明的植物发酵物可用于制备肝脏保健的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可通过口服、涂抹等方式给予一个体。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例的植物发酵物降低含活性氧化物的肝脏细胞比例的柱形图；***p值＜0.001；

图2是本发明的一实施例的植物发酵物提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因的表现量的柱形图；**p值＜0.01；

图3是本发明的一实施例的植物发酵物提升肝脏细胞中MRPS5基因的表现量的柱形图。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student′s t-test)分析。

葛根为葛藤(Pueraria lobata)的干燥根，葛藤为豆科(Fabaceae)葛藤属(Pueraria)多年生落叶性缠绕性大型藤本植物，又称干葛、葛麻藤、山肉豆、野葛、鸡齐、黄斤等名。葛藤的根为块根且外型粗厚，长时可达1公尺，厚则可达15公分，可供食用或药用。

枳椇子(Hovenia dulcis Thunb.)为鼠李科(Rhamnaceae)枳椇属(Hovenia)落叶性乔木植物，又称拐枣、鸡距、树密、龙爪、金钩梨、鸡爪子、蛮子梨、甜半夜、杞久仔等名。原产于中国中南部、西南部及日本，中国台湾则于1960年代引进栽植于溪头及瑞里等地。枳椇子的果梗具甜味，可供食用，俗称拐枣或蛮字梨；其叶及种子则可供药用，具有止渴、解酒、止吐的功效；其根皮或茎皮则具有活血舒筋的功效；其果实则能健胃、补血。

如本文中所使用的，用语「植物发酵物」意为葛根及枳椇子与溶剂以1-5∶1∶25-50(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得的萃取物，再以酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌依序进行一三段式发酵而获得，其中该酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；该乳酸杆菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸杆菌的添加量为1-20％(w/w)。

本文所述的「有效浓度」是表示能有效提升肝脏细胞抗氧化活性、及/或有效提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、MRPS5基因表现量所需本发明的植物发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可通过例如剂量递增试验(doseescalation)以实验决定其有效浓度。

依据本发明，有关微生物发酵反应的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种但不限于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，通过习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

本发明提供一种植物发酵物及其制备方法与其用于护肝保健的用途，本发明的植物发酵物是将葛根及枳椇子与溶剂以1-5∶1∶25-50(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得的萃取物，再以酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌依序进行一三段式发酵而获得，其中该酵母菌为BCRC20271的菌株、该乳酸杆菌为BCRC910805的菌株、该醋酸杆菌为BCRC11688的菌株。本发明的植物发酵物可有效提升肝脏细胞的抗氧化活性、提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、MRPS5基因的表现量。

同时，本发明用于护肝保健的组合物，亦可包含一有效量的植物发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、或一食品。

以下将详细说明本发明植物发酵物的详细制备方法、该植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的功效的测试、以及该植物发酵物提升肝脏细胞中抗老化基因表现量的功效的测试，以证实本发明的植物发酵物可有效提升肝脏细胞的抗氧化活性、提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、MRPS5基因的表现量。

实施例1 本发明的植物发酵物的制备方法

在本发明一实施例中，将葛根的根及枳椇子的果实混合后，与水以1-5∶1∶25-50的比例均匀混合，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-3小时后，将该萃取溶液冷却至室温供后续三段式发酵使用，以下列三种菌依序进行发酵：酵母菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌，此三种菌的发酵顺序无法前后对调，且其发酵时间比为1-5∶1-5∶3-10。在本发明一较佳实施例中，首先于该萃取溶液中植入0.01-0.5％(w/w)的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC20271)，于25-35℃下进行前发酵1-5天，实际时间视发酵状态而异。接着直接植入0.01-0.25％(w/w)的乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum TCI028，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC910805)，于25-35℃下进行后发酵1-3天，实际时间视发酵状态而异。接着再直接植入1-20％(w/w)的醋酸杆菌(Acetobacter aceti，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC11688)，于25-35℃下进行深层发酵5-15天，实际时间视发酵状态而异，最后在不移除此三种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-4°、pH＜4、酒精＞5％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400mesh网筛过滤，再添加40-70％异麦芽寡糖调整规格后，于95-105℃下加热90分钟进行灭菌，即得到本发明的植物发酵物。

实施例2 本发明的植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的功效

本发明的一实施例使用人类肝癌细胞(Human hpatocellular carcinoma，HepG2)以Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate(DCFH-DA，购自Sigma，美国，编号SI-D6883-50MG，5mg/mL保存于DMSO中)进行本发明的植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的功效测试。该HepG2细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国)，编号HB-8065^TM，且该细胞是培养于含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国)以及90％的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，购自Gibco，美国)的细胞培养液中，其中加入1％的青霉素-链霉素。

DCFH-DA是一种稳定的非极性化合物，可自由通透细胞膜，当DCFH-DA进入细胞后，会被细胞内的脂质酶水解，形成具有极性的DCFH，停留在细胞内无法出來，并会细胞内的活性氧化物(Reactive oxygen species，ROS)与DCFH产生氧化还原反应形成Dichloro-fluorescin(DCF)，以450-490nm波长激发后，会产生的綠色荧光可以被于510-550nm波长被侦测出，因此侦测经DCFH-DA处理的细胞的荧光强度，能反映细胞内活性氧物质的含量。

为进行本发明的发酵三阶段步骤提高植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的功效测试，首先将1×10⁵个HepG2细胞培养于含有2mL上述细胞培养液的6孔培养盘中，于37℃培养24小时后，在不干扰贴附的细胞的情况下更换新的细胞培养液，接着将细胞分成以下五组：(1)空白控制组、(2)正控制组、(3)加入1％(v/v)本发明的植物发酵物的实验组、(4)加入1％(v/v)枳椇子水萃取物的比较组、及(5)加入1％(v/v)葛根水萃取物的比较组，各组分别于37℃下反应1小时，接着于各组中分别加入5μg/mL的DCFH-DA于37℃作用15分钟，以标记细胞中ROS，再将第(2)-(5)组以0.5mM的H₂O₂(购自Sigma，美国，原液浓度为35％)于37℃下处理细胞1小时，且未加入H₂O₂作用的组别为空白控制组，接着在不干扰贴附的细胞的情况下移除培养液，并以1mL的1倍磷酸盐缓冲生理盐水(1x phosphate buffered saline，1xPBS)清洗细胞两次，再加入200μL胰蛋白酶在黑暗中反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入适当的培养液终止反应，并将细胞连同培养液于黑暗中收集至15mL离心管，以300g离心5分钟后移除上清液，再以1mL的1xPBS冲洗细胞一次后，于300g离心5分钟后除上清液，接着在黑暗中以1mL的1xPBS重新悬浮细胞，并使用流式细胞仪检(BD Accuri^TM C6 Plus，购自美国)测细胞于激发波长450-490nm、放射波长510-550nm的荧光数值，计算含有荧光讯号的细胞数。再利用Excel软件进行student t-test以决定相较于该第(2)组，该第(1)、(3)-(5)是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。

本发明的植物发酵物提升肝脏细胞抗氧化活性的实验结果如图1所示。未经H₂O₂处理过的空白控制组中，仅有约0.67％的HepG2细胞含有活性氧化物；而仅经H₂O₂处理过的正控制组中，约有61.97％的HepG2细胞含有活性氧化物，此结果显示经H₂O₂处理确实能使HepG2细胞产生活性氧化物。而经本发明的植物发酵物预处里的实验组中，仅有约11.87％的HepG2细胞含有活性氧化物，与正控制组相比可显著的降低50.1％的HepG2细胞产生活性氧化物；而经葛根水萃取物或枳椇子水萃取物预处理的比较组，分别仍有约41.57％及28.43％的HepG2细胞含有活性氧化物，与正控制组相比仅分别可显著的降低约20.4％及33.54％的HepG2细胞产生活性氧化物。此结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物三阶段发酵步骤后，可更有效减少肝脏细胞受H₂O₂刺激所诱发产生的活性氧化物，能有效提升肝脏细胞的抗氧化活性，预防肝脏细胞受氧化压力的伤害。

实施例3 本发明的植物发酵物调控肝脏细胞中抗老化基因表现量的功效

本发明的一实施例为进行本发明的发酵三阶段步骤提高植物发酵物调控肝脏细胞中抗老化基因表现量的功效测试。首先，将1×10⁵个HepG2细胞培养于含有2mL上述细胞培养液的6孔培养盘中，于37℃培养24-48小时，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入0.5％(v/v)本发明的植物发酵物的实验组、(3)加入0.5％(v/v)枳椇子水萃取物的比较组、及(4)加入0.5％(v/v)葛根水萃取物的比较组，并将该些组别的细胞分别于37℃下作用24小时后，测试各组HepG2细胞中目标基因的表现量。首先，将HepG2细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该四组细胞内的RNA，接着利用III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板，并以表1的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的mRNA所相应的cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlus^TM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该四组反转录后产物分别以表1的组合引物进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin1基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、PARP1基因、PARP2基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、TERC基因、及RTEL1基因的mRNA的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2^-ΔΔCt，其中ΔC_T＝C_{T比较组或实验组目标基因/控制组目标基因}-C_{T GAPDH}(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；ΔΔC_T＝C_{T比较组或实验组目标基因}-C_{T控制组目标基因}；各组中各基因的fold change则为2^-ΔΔCt。接着，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。

表1、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

CCT基因为折迭蛋白(Chaperonin)的一种，主要功能为矫正错误折迭的蛋白质，并将无法成功修复的蛋白质送进蛋白质水解酶复合体(Proteasome)中进行水解，先前研究已指若此蛋白质调控的重复使用系统发生故障，会导致错误折迭的蛋白质会聚集在细胞中，并造成细胞功能衰退及加速细胞的老化与死亡，因此被认为与个体的老化调节相关。Pink1基因为一种位在线粒体的丝胺酸/苏胺酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，其功能为保护线粒体在细胞压力期间发生故障，已知该基因的突变与帕金森氏症有关，而先前研究更指出该基因的过量表现能够增加小鼠的寿命，因此也被认为与个体的老化调节有关。Parkin基因为一种存在于泛素-蛋白酶体是(Ubiquitin-proteasome system)中的酵素，并作为蛋白质分解的调节剂，已知该基因的突变与帕金森氏症有关，且先前研究亦指出增加该基因的表现量能够推迟细胞的老化作用，因此被认为与细胞的老化作用相关。Atg基因则为自噬作用相关基因，会参与细胞中废物降解、及循环的自噬作用，先前研究指出该基因的过量表现，能够延长小鼠的寿命，因此被认为与细胞的老化作用相关。端粒是生物染色体末端的DNA重复序列，主要作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期，其中DNA每复制一次，端粒就会缩短一些，一旦端粒消耗殆尽，细胞则会走向凋亡，因此端粒的长度与细胞的年龄具相关，其中又已知TERT基因、TERC基因及RTELl基因与调节端粒的长短相关。先前研究已指出和年老的小鼠相比，年轻的小鼠体内含有较多的NAD⁺；且增加年老小鼠体内的NAD⁺浓度，能使其生理状况更为年轻，因此NAD⁺被认为与推迟个体老化相关，研究结果已知SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、UBL-5基因、SOD3基因、及MRPS5基因与调节NAD⁺相关。

本发明的植物发酵物提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因的表现量的实验结果如图2所示。经本发明的植物发酵物作用后，相较于控制组，能分别显著提升HepG2细胞中CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因的表现量达1.31倍、1.2倍、及1.32倍，其余基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；经葛根水萃取物或枳椇子水萃取物作用后，CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因的表现量皆分别相似或低于控制组。此结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物三阶段发酵步骤后，能有效提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、及Pink1基因的表现量，能有效提升肝脏细胞的线粒体活性及清除错误折迭蛋白质的能力，以提升肝脏细胞的抗老化活性，使肝脏细胞的生理状况更为年轻。

本发明的植物发酵物提升MRPS5基因的表现量的实验结果如图3所示。经本发明的植物发酵物作用后，相较于控制组，能提升HepG2细胞中MRPS5基因的表现量，其余与调节NAD⁺相关的基因的表现量则与控制组相似或差异不大(数据未显示)；而经葛根水萃取物或枳椇子水萃取物作用后，则反而会降低MRPS5基因的表现量。此结果显示本发明的植物发酵物在经过本发明的微生物三阶段发酵步骤后，能有效提升MRPS5基因的表现量，能有效提升肝脏细胞中NAD⁺的浓度，以提升肝脏细胞的抗老化活性，使肝脏细胞的寿命延长。

综上所述，本发明将葛根及枳椇子混合物的萃取物以酵母菌、乳酸杆菌、及醋酸杆菌进行三段式发酵所得的植物发酵物，能直接且有效提升肝脏细胞的抗氧化活性，能提升肝脏细胞清除活性氧化物的能力以预防受氧化压力的伤害；本发明的植物发酵物亦能有效提升肝脏细胞中CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、及MRPS5基因的表现量，以提升肝脏细胞的线粒体活性、清除错误折迭蛋白质的能力、及提升细胞中NAD⁺的浓度，而能够提升肝脏细胞的抗老化活性，使肝脏细胞的生理状况更为年轻且延长寿命。中医五行经络是气血运行的通道，如经络通则百病消，而本发明的植物发酵物能够清除自由基、排毒，达到提升精气神的功效，又能提升回春相关基因的表现量，而能提升肝脏抵御力及回春的保健功效，以调理肝脏经络。因此，本发明的植物发酵物可用于制备肝脏保健的组合物的用途，且该组合物是一医药品、或一食品，可通过口服、涂抹等方式给予一个体。