一种对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物、制备方法及其用途
阅读说明：本技术 一种对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物、制备方法及其用途 (Traditional Chinese medicine composition with protection effect on chemical liver injury and liver regeneration promotion function, preparation method and application thereof ) 是由 徐希明 孙从永 余江南 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物、制备方法及其用途。中药组合物包括以下质量份数配比的组分：葛根提取物5～20份、黄芪提取物2～10份、五味子提取物2～8份、枳椇子提取物1.5～20份、精制金针菇多糖0.5～2份,辅以丹参、藤茶、茯苓、砂仁、辣木籽、甘草。动物实验研究证实,该组合物对酒精及四氯化碳引起的急性肝损伤均具有保护作用,可缓解肝损伤。该组合物还可在肝切除损伤后,诱导肝细胞增殖、促进肝再生。(The invention discloses a traditional Chinese medicine composition with a protective effect on chemical liver injury and a function of promoting liver regeneration, and a preparation method and application thereof. The traditional Chinese medicine composition comprises the following components in parts by weight: 5-20 parts of kudzu root extract, 2-10 parts of astragalus extract, 2-8 parts of schisandra extract, 1.5-20 parts of hovenia dulcis thunb extract, 0.5-2 parts of refined flammulina velutipes polysaccharide and the auxiliary materials of salvia miltiorrhiza, vine tea, poria cocos, fructus amomi, moringa seeds and liquorice. Animal experiment research proves that the composition has protective effect on acute liver injury caused by alcohol and carbon tetrachloride, and can relieve liver injury. The composition can also induce hepatocyte proliferation and promote liver regeneration after hepatectomy injury.)
技术领域
本发明涉及中药制药技术领域，具体涉及一种对化学性肝损伤有保护作用、肝脏再生的中药组合物、制备方法及其用途。
背景技术
肝脏是人体内最大的、功能最多的消化腺体，它参与体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程，其中以代谢机能最为重要，同时参与造血过程，贮存和释放造血因子，合成多种酶类，保证人体正常的新陈代谢功能。肝脏对外来及代谢产生的有害物质具有强大的解毒功能。但许多有害因子可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到毒性物质的损害。自然和人类工业生产过程中存在一些对肝脏有毒性的物质，这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，病变的过程与感染的剂量直接相关，可引起肝脏不同程度的损伤，如肝细胞坏死、肝纤维化、肝硬化和肝癌等。化学性肝损伤是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。这些化学物质包括酒精、环境中的化学有毒物质及某些药物。
目前，临床上大部分肝损伤是由酒精引起，酒精性肝损伤系由于过量摄入酒精而导致的肝脏损害等一系列病变。酒精性肝损伤可以分为急性酒精性肝损伤以及慢性酒精性肝损伤。急性酒精性肝损伤是由于一次摄入过量酒精而造成肝功能损害，表现为食欲不振、恶心、肝部不适、黄疽等急性肝炎症状。慢性酒精性肝损伤是由于长期摄入酒精而导致肝细胞纤维化变性、坏死，肝脏免疫功能遭到破坏，常表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及酒精性肝硬化。酒精性肝损伤的发病机制主要有(1)酒精及其代谢产物乙醛的直接肝毒性；(2)氧化应激与活性氧自由基损伤；(3)细胞因子与内毒素介导的免疫炎症机制；(4)其他，如局部组织缺氧、内质网应激、铁负荷增加、细胞凋亡等。其中，酒精及其代谢过程中产生的大量活性氧自由基所引起的氧化应激被认为是酒精性肝病最重要的早期病理机制。在肝脏内，乙醇先由乙醇脱氢酶(ADH)等氧化形成乙醛，再经乙醛脱氢酶(ALDH)氧化形成乙酸，最后在外周组织中降解为CO2和水。在酒精代谢过程中，伴随着氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)向还原态的NADH转变，导致NAD+/NADH比值下降，从而使依赖于NAD+的生化反应如三羧酸循环、脂肪酸β氧化和氧化磷酸化、糖异生等受到抑制，造成糖脂代谢紊乱，从而引起肝脏的脂肪变性。与此同时，代谢过程会产生超氧阴离子、H2O2等自由基，使细胞内脂质过氧化反应激活，蛋白质的结构功能受到破坏，细胞膜通透性和流动性改变。长时间过量饮酒者易患脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。此外，过剂量服用一些药物，如对乙酰氨基酚，也会造成肝损伤。
现代医学在肝损伤的治疗方面无特异性的药物，中医药历经几千年的发展，通过方剂的用药规律配伍而辨证组方，其作用既优于西药，且毒性又明显小于西药。目前市场上具有保肝作用的大部分产品采用虫草、松花粉、灵芝等入药，其存在成本高、原料供应不稳定的问题，这使得相关保肝产品的应用受到限制。因此，寻找构思新颖，工艺简单，提取效率高，生产成本低，药效良好的缓解化学性肝损伤的中药组方，具有重大意义。
祖国传统中医药在长期的临床实践中积累了丰富的保肝护肝药用资源。现代人们积极从天然植物中寻找具有保肝作用的活性成分，葛花、葛根、枳椇子、丹参、三七、甘草、五味子、金针菇等中药材被证实具有良好的保肝作用。天然保肝药物的作用机制主要是通过清除自由基、抗脂质过氧化、降低转氨酶等途径发挥保肝作用。例如：葛花能够在乙醇的肠胃吸收及代谢两个环节发挥作用，其水提取物通过激活乙醇脱氢酶活性来降低乙醇的浓度，从而有效地降低血中乙醇浓度，对酒精引起的肝细胞损害有保护作用(参见：芦洁,李文哲,倪亚明.中药水提取物对乙醇脱氢酶活性影响的初步研究[J],同济大学学报医学版,2002,23(1):23～25.)。于刚等研究发现枳椇子多糖能明显降低小鼠血中乙醇浓度，激活乙醇脱氢酶，降低丙氨酸氨基转移酶的活性，表明枳椇子多糖具有较好的解酒保肝功能(参见：于刚,王立军,曹晓钢.枳椇子活性多糖的提取工艺及解酒功能研究[J],广西轻工业,2007,10:3～4.)。丹参可抑制四氯化碳诱导的肝损伤大鼠血清中ALT，AST含量的增高，提高肝组织SOD活性，降低MDA含量。组织学观察发现丹参对受损伤的肝组织有明显的修复作用(参见：吴百灵.丹参对CCl4所致急性肝损伤保护作用的研究[J].中医药学刊,2002,20(3):363.)。黄芪具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用，能促进肝细胞的DNA合成，离体肝细胞的试验证明黄芪总提取物可明显降低CCl4和H2O2引起的肝细胞MDA含量的升高(参见：邱季,桂双英.黄芪提取物对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用[J].安徽医药杂志,2009,13(6).)。
辣木(Moringa oleifera Lam.)为辣木科辣木属的植物，是多年生热带落叶乔木，是一种新型的保健食品，具有极大的开发潜力，除了具有丰富的营养价值，在抗氧化、降血糖、降血脂、抗真菌方面亦表现出良好活性。Nilanjan Das等研究发现辣木叶的提取物能够有效的减轻由高脂食物喂养的小鼠引起的肝损伤。辣木组的小鼠肝损伤情况得到了有效的降低，同时显著增加了内生抗氧活指数，并抑制了脂质脂质过氧化情况(参见：NilanjanDas，Kunal Sikder，Santianth Ghosh，et al.Moringa oleifera lam.Leaf extractprevents early liver injury an restores antioxidant status in mice fed withhigh-fat diet[J].Indian Journal pf Experiment Biology,2012,50:404-412.)。Sharifudin SA等究辣木的花与叶子醇提物对对乙酰氨基酚(APAP)导致的肝损伤的保护作用，在辣木提取物给药组中肝标记酶活性得到了降低，在病理组织观察中发现肝损伤程度有显著降低(参见：Sharifudin S A，Fakurazi S，Hidayat M T，et al.Therapeuticpotential of Moringa oleifera extracts against acetaminophen-inducedhepatotoxicity in rats[J].Pharmaceutical biology,2012,(00):1-10.)。
金针菇(Flammulinavelutipes(Curt.:Fr.)Sing.)是食用菌之一，金针菇不仅营养丰富，而且含有多糖、免疫调节蛋白、火菇素等多种生物活性物质，这些成分具有抗肿瘤，抗病毒，抗虫，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒(HIV)，降低血清胆固醇，降压，提高机体免疫力等广泛药理活性。以金针菇为原料提取的多糖成分对肝损伤具有保护作用，近年也引起人们的关注。例如：李怡芳等发现金针菇多糖能显著降低CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性，提高肝匀浆SOD的活性，降低MDA的含量，对CCl4诱发的小鼠应激性肝损伤有一定的保护作用(参见：李怡芳,曾怀苇,王敏,等.金针菇多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用[J],广东药学院学报,2010,26(2):162～165.)。
发明内容
本发明以传统中医药理论为指导，应用卫生部公布的药食两用或可用于保健的原料拟定组方，研制开发对化学性肝损伤具有辅助治疗作用的中药组合物，并通过小鼠药效学实验，评价其保肝效果。
目前以葛根、黄芪、五味子、枳椇子、丹参、茯苓、砂仁、辣木籽为主要原料，添加具有保肝作用的精制金针菇多糖制备的解酒保肝产品的组方及其制备方法，还未见报道。
本发明的目的之一是提供一种中药组合物，目的之二是提供上述中药组合物的制备方法，目的之三是提供上述中药组合物在制备针对化学肝损伤的保肝药物或促进肝脏再生药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物，所述中药组合物包括以下质量份数配比的组分：葛根提取物5～20份、黄芪提取物2～10份、五味子提取物2～8份、枳椇子提取物1.5～20份、精制金针菇多糖0.5～2份。
进一步的，还包括以下质量份数配比的组分：丹参1～10份、藤茶1～10份、茯苓1～2份、砂仁1～4份、辣木籽5～10份、甘草1～10份。
3、一种对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将葛根、黄芪、五味子、枳椇子分别粉碎至粗粉，加入极性有机溶剂水溶液进行提取，合并提取液，过滤、减压浓缩、干燥制成中药提取物粉末；
步骤2：金针菇经粉碎后，以水作为溶媒进行微波提取得金针菇粗多糖，粗多糖经大孔树脂及纤维素柱纯化得到精制金针菇多糖；
步骤3：将步骤1和2制得的所得组分按权利要求1所述比例混合均匀，制成对化学性肝损伤有保护作用、促进肝脏再生的中药组合物。
进一步的，步骤1中制取中药提取物粉末的具体步骤如下：将葛根、黄芪、五味子、枳椇子分别粉碎至100目，用8～16倍药材重量的质量浓度为40％～80％的极性有机溶剂水溶液，于50～90℃条件下提取1～3次，每次1～3h，合并提取液，过滤，减压浓缩，干燥制成中药提取物粉末；所述干燥方式是喷雾干燥、冷冻干燥、微波干燥或真空干燥；所述极性有机溶液为甲醇、乙醇或丙酮中的一种或两种以上的混合溶剂。
进一步的，方法还包括将丹参、藤茶、茯苓、砂仁、辣木籽、甘草粉碎为粗粉，按比例混合后进行超微粉碎，加入步骤1和2制得的所得组分中按比例混合均匀。
进一步的，步骤2中制取精制金针菇多糖的具体步骤如下：
步骤2.1：将金针菇烘干后，粉碎至100目，以12～20倍药材质量的水作为溶媒，置于微波提取仪中，微波功率400～600W、提取温度50～90℃、提取时间30～60min；收集超声微波提取液，过滤，减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液加入95％乙醇醇沉，使乙醇终浓度为80％，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀物经无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤后，干燥，即得金针菇粗多糖；
步骤2.2：粗多糖以三氯乙酸法除蛋白，冰浴条件下，加入五倍体积的5％三氯乙酸，搅拌10min，静置过夜，调pH值至7，过滤，浓缩冻干，得精制粗多糖；
步骤2.3：精制粗多糖进一步通过D101大孔树脂、DEAE-52纤维素进行纯化得到精制金针菇多糖。
进一步的，步骤2.3精制粗多糖的纯化具体采用以下步骤：
(1)将精制粗多糖以8～15倍药材重量的水溶解后，加入到D101大孔树脂层析柱中，平衡吸附20～40min，依次用一定体积的纯化水及0.1、0.3、0.5mol/L的氯化钠水溶液洗脱，定量收集；采用微量苯酚硫酸法检测洗脱液中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，减压浓缩、透析、冻干；
(2)取D101大孔树脂分离出来的主要组分溶于水，加入到DEAE-52纤维素层析柱中，依次用一定体积的纯化水及0.1、0.2、0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱，定量收集，采用微量苯酚硫酸法检测洗脱液中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，减压浓缩、透析、冻干，得到分子量相对均一的精制金针菇多糖。
进一步的，步骤2中制取的精制金针菇多糖以高效液相-蒸发光散射法测定分子量为31.7kDa，出峰时间为13.3分钟。
一种中药组合物在制备针对化学肝损伤的保肝药物或促进肝脏再生药物中的应用。
进一步的，中药组合物还包括医学上允许的载体，所述中药组合物为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂或贴剂。
本发明所提供的化学性肝损伤有保护作用的中药组合物，具有显著的解酒防醉功效，显著降低小鼠醉酒率并延长耐受时间。中药组合物可显著缓解酒精造成的小鼠急性肝损伤，显著提高肝组织SOD、GSH含量，降低MDA水平，并降低血清中TG水平。中药组合物还可显著缓解四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤，显著降低血清ALT、AST水平，降低肝组织MDA水平，可用于制备保肝药物。
本发明还提供了上述中药组合物在制备肝脏保护与再生作用药物方面的用途，中药组合物具有促进肝部分切除后肝再生，提高肝体重比恢复能力，促进肝细胞增殖，有效激发残余肝细胞的再生潜能，可用于制备保肝药物。
本发明的有益效果：
1、本发明的优点，在传统保肝方剂的基础上添加具有保肝作用的精制金针菇多糖，研制了具有保肝功效的新一代产品，扩大了金针菇的用途，使金针菇从普通食品发展成为一种新型保肝产品的新原料，可显著提高金针菇的附加值，不仅能极大提高产品的品质，而且具有明显的创新性。
2、本发明通过小鼠急性酒精中毒试验，验证了中药组合物具有显著的解酒功效，显著降低醉酒率，延长耐受时间、缩短醒酒时间。
3、本发明通过小鼠急性酒精性肝损伤模型，验证了中药组合物具有显著的肝脏保护作用，可对抗乙醇所致的急性肝脏损伤，有效改善酒精性肝损伤造成的病变。本发明中药组合物能够提高肝组织SOD和GSH活性，降低MDA和TG的含量，增强机体对抗自由基的能力，对急性酒精性肝损伤具有显著的肝脏保护作用。
4、本发明还通过小鼠急性四氯化碳肝损伤模型，验证了中药组合物具有显著的肝脏保护作用，可对抗四氯化碳所致的急性肝脏损伤，有效改善四氯化碳肝损伤造成的病变。该中药组合物能够显著降低四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤的ALT、AST活性和MDA水平，明显改善肝损伤小鼠的肝组织学病变。
5、本发明还通过小鼠70％肝切除模型，验证了中药组合物可促进肝部分切除后的肝再生，提高肝体重比恢复能力，促进肝细胞增殖，有效激发残余肝细胞的再生潜能。
附图说明
图1是实施例中药组合物的制备工艺流程图。
图2是实施例精制金针菇多糖的HPLC-ELSD色谱图。
图3是实施例1酒精性肝损伤模型小鼠肝组织病理切片图(A：正常组；B：模型组；C：给药组)
图4是实施例2四氯化碳肝损伤模型小鼠肝组织病理切片图(A：正常组；B：模型组；C：给药组)
图5是实施例70％肝切除后小鼠的肝/体重比结果图(**，与模型对照相比，P<0.01；结果显示中药组合物在术后第1、3天肝再生速度显著大于模型对照)
图6是实施例70％肝切除后小鼠的血清中ALT、AST值(**，与模型对照相比，P<0.01；结果显示中药组合物在术后第1、3天肝指标ALT、AST值恢复)
图7是实施例70％肝切除后小鼠肝细胞增殖结果图(DAPI染核，EDU标记正在增殖的细胞核；结果显示中药组合物显著提高了肝细胞增殖)
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
以下实施例所用主要仪器和材料：
药材：葛根、黄芪、五味子(西安三江生物工程有限公司)、枳椇子(陕西天地源生物科技有限公司)、金针菇(镇江市丹徒区正东生态农业发展中心)、丹参、茯苓、砂仁、辣木籽、甘草。
实验仪器：XL-20B粉碎机(广州旭朗机械设备有限公司)、微波提取仪(郑州世纪双科实验仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂)、真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、KQM-X4(/B)型行星式球磨机、HPLC-ELSD(Agilent公司)。
精制金针菇多糖的制备
本实例以微波提取法提取金针菇多糖，再经D101大孔树脂及DEAE-52纤维素纯化分离后得到高纯度、分子量均一的精制金针菇多糖，具体如下：
①微波提取金针菇粗多糖：金针菇烘干后，粉碎至100目，以15倍药材量(w/w)的水作为溶媒进行提取，置于微波提取仪中，微波功率500W、提取温度70℃、提取时间40分钟；收集超声微波提取液，过滤，减压浓缩至原体积的十分之一，浓缩液加入95％乙醇醇沉，使乙醇终浓度为80％，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀物经无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤后，真空干燥，得金针菇粗多糖。
②金针菇粗多糖以三氯乙酸法除蛋白：冰浴条件下，加入五倍体积的5％三氯乙酸，搅拌10min，静置过夜，调pH值至7，过滤，浓缩冻干，得精制金针菇粗多糖。
③D101大孔树脂纯化：D101大孔树脂预处理后，超声脱气，缓慢装入层析柱(40×500mm)，恒流泵压实，装柱高度为柱长的2/3，蒸馏水充分洗脱，备用。取精制金针菇粗多糖2g，加20mL的水溶解，离心取上清缓慢加入到层析柱，平衡吸附20min，依次用一定体积的纯化水及0.1、0.3、0.5M的氯化钠水溶液洗脱，流速1mL/min，每10mL收集一管。微量苯酚硫酸法检测洗脱液中的多糖含量，以吸光度值作为纵坐标，管数为横坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线合并相同组分，浓缩透析，冻干。
④DEAE-52纤维素纯化：DEAE-52预处理后，装柱。取D101大孔树脂分离出来的主要组分500mg溶于10mL水，缓慢加入到DEAE-52纤维素层析柱中，平衡吸附20min。依次用一定体积的纯化水及0.1、0.2、0.3M的氯化钠水溶液洗脱，流速1mL/min，每10mL收集一管。微量苯酚硫酸法检测洗脱液中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，减压浓缩，透析，冻干，得到分子量相对均一的精制金针菇多糖。
精制金针菇多糖的分子量测定
以高效液相-蒸发光散射(HPLC-ELSD)法测定精制金针菇多糖的分子量。
①分析参数：仪器：Agilent 1260、ELSD detector(蒸发温度30℃，漂移管温度30℃，氮气流速1.59L/min)；流动相：20mmol/L的乙酸铵水溶液(0.6mL/min)；色谱柱：TSK-gelcolumn G4000PW(7.5mm×300mm)，TSK-guard column PWH(7.5mm×75mm)；柱温：30℃；进样量为20μL。
②标准曲线的建立：分别精密称取不同分子量的右旋糖酐标准品(分子量5kDa、25kDa、80kDa、270kDa和670kDa)10mg配置成1mg/mL的标准品溶液，经0.45μm滤膜过滤后，进样分析。对不同分子量标准品的保留时间(T)及相应分子量的自然对数(Log(Mw))进行线性回归计算，得标准分子量与保留时间的标准方程为T＝-1.21×Log(Mw)+28.35。
③精制金针菇多糖分子量的测定：精密称取精制金针菇多糖，配置成1mg/mL的标准品溶液，经0.45μm滤膜过滤后，进样分析。结果见附图2，精制金针菇多糖为单一对称峰，出峰时间为13.3分钟，带入标准曲线计算，多糖分子量为31.7kDa。
实施例1
制备具有肝脏保护与再生作用的中药组合物，系中药提取物与超微粉的混合物，制备步骤如下：①将葛根、黄芪、五味子、枳椇子分别粉碎至粗粉，各采用10倍药材量(w/w)浓度为70％的乙醇水溶液，于90℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，干燥制成中药提取物粉末，根据组方取葛根提取物5份、黄芪提取物2份、五味子提取物2份、枳椇子提取物4份；②取前述所制备的高纯度、分子量均一的精制金针菇多糖1份；③茯苓1份、砂仁1份、辣木籽2份、甘草1份粉碎为粗粉，将此中药粗粉按比例混合后，放入行星式球磨机中，不添加任何抗结剂、助磨剂对其进行干法粉碎30分钟，制成中药超微粉；将①②③所得组分混合均匀，制成对化学性肝损伤有保护作用的中药组合物。
实施例2
制备具有肝脏保护与再生作用的中药组合物，系中药提取物与超微粉的混合物，制备步骤如下：①将葛根、黄芪、五味子、枳椇子分别粉碎至粗粉，各采用8倍药材量(w/w)浓度为80％的乙醇水溶液，于90℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，干燥制成中药提取物粉末，根据组方取葛根提取物8份、黄芪提取物3份、五味子提取物3份、枳椇子提取物3份；②取前述所制备的高纯度、分子量均一的精制金针菇多糖2份；③甘草1份粉碎为粗粉，将此中药粗粉按比例混合后，放入行星式球磨机中，不添加任何抗结剂、助磨剂对其进行干法粉碎45分钟，制成中药超微粉；将①②③所得组分混合均匀，制成对化学性肝损伤有保护作用的中药组合物。
实施例3
制备具有肝脏保护与再生作用的中药组合物，系中药提取物与超微粉的混合物，制备步骤如下：①将葛根、黄芪、五味子、枳椇子分别粉碎至粗粉，各采用10倍药材量(w/w)浓度为70％的乙醇水溶液，于95℃条件下提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，干燥制成中药提取物粉末，根据组方取葛根提取物5份、黄芪提取物2份、五味子提取物2份、枳椇子提取物4份；②取前述所制备的高纯度、分子量均一的精制金针菇多糖1份；③藤茶3份、茯苓1份、砂仁1份、辣木籽2份、甘草1份粉碎为粗粉，将此中药粗粉按比例混合后，放入行星式球磨机中，不添加任何抗结剂、助磨剂对其进行干法粉碎30分钟，制成中药超微粉；将①②③所得组分混合均匀，制成对化学性肝损伤有保护作用的中药组合物。
中药组合物的解酒防醉评价实验
确定38％乙醇溶液为最佳给酒剂量，通过观察实施例1中的中药组合物对急性酒精中毒小鼠醉酒率、耐受时间和醒酒时间的影响，评价中药组合物的解酒效果。
①动物：普通级昆明种小鼠，全雄，体重20±2g，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。室温22±2℃，湿度50～75％。
②分组及药物：小鼠随机分为3组：模型对照组、中药组合物组、阳性对照组，每组15只。中药组合物：10g/kg(小鼠体重，以下同)，用蒸馏水配制后备用。阳性对照组：海王金樽(深圳市海王健康科技发展有限公司)5g/kg，用蒸馏水配制后备用。
③试剂：无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。用蒸馏水配成含量为38％溶液备用。
④中药组合物对急性酒精中毒小鼠耐受时间、醉酒率的影响：小鼠禁食12h后，中药组合物组及阳性对照组均给药一次，灌胃体积为20mL/kg，模型对照组灌服等体积蒸馏水。30min后3组以38％乙醇溶液按20mL/kg灌胃，观察并记录小鼠耐受时间(从38％乙醇溶液灌胃后到小鼠翻正反射消失的时间)，计算4h内的醉酒率。
⑤中药组合物对急性酒精中毒小鼠醒酒时间的影响：动物分组、用药情况同上，每组12只。各组小鼠禁食12h后，以38％乙醇溶液20mL/kg灌胃，30min后各干预组给药一次，模型对照组灌服等体积蒸馏水。观察并记录小鼠的醒酒时间(从给药后到小鼠翻正反射恢复的时间)。
⑥统计学方法：数据以mean±SD表示，应用SPSS for Windows 13.0统计软件包进行处理。计量资料用非配对样本t检验分析，计数资料用χ2检验，检验水准α＝0.05。
⑦实验结果：
中药组合物显著降低急性酒精中毒小鼠醉酒率、延长耐受时间、缩短醒酒时间：与模型对照组比较，中药组合物组与阳性对照组均可明显降低小鼠醉酒率，显著延长小鼠耐受时间，缩短小鼠醒酒时间(P<0.01或P<0.05)。中药组合物组的小鼠醉酒率、耐受时间与醒酒时间3个指标均优于阳性对照组，结果见表1。
表1 3组间醉酒率、耐受时间与醒酒时间的比较
注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
中药组合物对酒精性肝损伤的保护作用
通过建立急性酒精性肝损伤模型，对中药组合物的保肝效果进行评价。选择实施例1中的中药组合物，预防性给药12d。第13d，小鼠一次性灌胃50％乙醇溶液(12mL/kg)，形成急性酒精性肝损伤小鼠模型。损伤12h后，通过测定小鼠肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)和血清甘油三酯(TG)等指标，进一步评价中药组合物的保肝效果。
①动物：普通级昆明种小鼠，全雄，体重20±2g，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。室温22±2℃，湿度50～75％。
②分组及给药：84只小鼠随机均分为7组：空白对照组、模型对照组、中药组合物高(低)剂量组，枳椇子多糖组，葛花粉末组，阳性对照组，每组12只。具体给药剂量如下，中药组合物高剂量组，0.7g/kg(小鼠体重，以下同)；中药组合物低剂量组，0.35g/kg；枳椇子多糖组，0.5g/kg；葛花粉末组，0.5g/kg；阳性对照组，0.5g/kg；中药组合物按照实施例1制备。阳性对照组用海王金樽(深圳市海王健康科技发展有限公司)，蒸馏水配制后备用。每日9:00～10:00经口灌胃受试样品一次，空白对照组和模型对照组给予同体积蒸馏水(20mL/kg)，持续12d。
③试剂及仪器：无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司，分析纯；SOD试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒：南京建成生物工程研究所；TG试剂盒：温州津玛生物科技有限公司，其余试剂均为分析纯；UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津)；Biofuge台式高速冷冻离心机(德国Heraeus)；Fluko FA25高速剪切机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)；恒温振荡水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。
④模型建立与取材：末次给药结束时将模型对照组、受试组一次灌胃给予体积分数为50％的乙醇(12mL/kg)，空白对照组给予等量蒸馏水，禁食12h后处死动物，取血分离血清，冷藏待测TG，迅速剖腹取出肝脏，部分立即用10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，切片，普通HE染色，光镜下观察肝脏的组织形态。另取一部分肝脏用冰冷生理盐水冲洗、滤纸吸湿后，称取湿重0.3g左右，冰浴下制备10％肝组织匀浆，3000rpm离心15min，取上清，4℃以下保存，留作SOD、GSH、MDA检测。
⑤统计学方法：数据以mean±SD表示，应用SPSS for Windows 13.0统计软件包进行处理。计量资料采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05。
⑥实验结果：
a.中药组合物能够提高肝组织SOD和GSH活性：与空白对照组相比，模型对照组的SOD和GSH含量显著降低(P<0.05)。与模型对照组相比，中药组合物高、低剂量组与阳性对照组都能够显著提高小鼠体内的SOD和GSH含量(P<0.05或P<0.01)。此外，单一组分枳椇子多糖及葛花粉末组也可提高SOD及GSH值，但效果不及中药组合物组，结果见表2。
b.中药组合物能够降低肝组织MDA和血清TG含量：与空白对照组相比，模型对照组的MDA和TG含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比，中药组合物高、低剂量组与阳性对照组都能够显著降低小鼠体内的MDA含量(P<0.05或P<0.01)，中药组合物高、低剂量组能够显著降低小鼠体内的TG含量(P<0.05)，阳性对照组无统计学意义。同样，单一组分枳椇子多糖及葛花粉末组也可改善MDA及TG水平，但效果不及中药组合物组，结果见表2。
c.肝组织病理切片：对正常组、模型组、中药组合物组的小鼠肝组织进行病理切片，如附图3所示，正常组肝小叶结构清晰，肝细胞无明显病变，胞浆丰富，核结构清晰。模型组肝正常组织结构消失，肝窦消失，肝细胞胞浆疏松，可见气球样变性。中药组合物组肝小叶结构清晰，肝索、肝窦无明显异常，胞浆着色均匀。
通过本次实验，进一步证实了本发明中药组合物可有效缓解乙醇所致的急性肝脏损伤，改善酒精性肝损伤的病变程度。可以显著性减轻酒精对于SOD和GSH的抑制作用，提高机体内SOD活性，增加GSH含量，进而有效地消除过量饮酒产生的自由基对生物大分子的攻击，从而实现对肝脏的保护作用。此外还可加速清除乙醇代谢过程中产生的自由基，降低过氧化脂质水平，减少血清中TG的生成。并且，肝组织病理切片光镜观察结果显示中药组合物可明显改善肝损伤模型小鼠肝组织学的病变。
表2 7组间急性酒精性肝损伤SOD、GSH、MDA、TG的比较
注：与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与阳性对照组相比，▲P<0.05。
中药组合物对四氯化碳肝损伤的保护作用
建立急性四氯化碳肝损伤模型，对中药组合物的保肝效果进行评价。选择实施例2中的中药组合物，预防性给药18天。第19天，小鼠一次性灌胃0.5％四氯化碳溶液(10mL/kg)，形成急性四氯化碳肝损伤小鼠模型。通过测定小鼠血清中ALT、AST和肝组织MDA三个指标，进一步评价中药组合物的保肝效果。
①动物：普通级昆明种小鼠，全雄，体重20±2g，由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。室温22±2℃，湿度50～75％。
②分组及给药：84只小鼠随机均分为7组，空白对照组、模型对照组、中药组合物高(低)剂量组、阳性对照高(低)剂量组、金针菇多糖组，每组12只。具体给药剂量如下，中药组合物高剂量组，0.7g/kg(小鼠体重，以下同)；中药组合物低剂量组，0.35g/kg；阳性对照高剂量组，0.7g/kg；阳性对照低剂量组，0.35g/kg；金针菇多糖组，0.5g/kg。中药组合物按照实施例3制备。阳性对照组用海王金樽(深圳市海王健康科技发展有限公司)，蒸馏水配制后备用。每日9:00～10:00经口灌胃受试样品一次，空白对照组和模型对照组给予同体积蒸馏水(20mL/kg)，持续18d。
③试剂及仪器：四氯化碳：江苏徐州试剂二厂，分析纯。用芝麻油配成含量为0.5％溶液备用；ALT、AST试剂盒：美国Biosun公司；SOD试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒：南京建成生物工程研究所；其余试剂均为分析纯；UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津)；Biofuge台式高速冷冻离心机(德国Heraeus)；Fluko FA25高速剪切机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)；恒温振荡水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)。
④模型建立与取材：于实验第18天给药后将各组动物禁食16h，模型组及各受试组一次性经口灌胃给予0.5％四氯化碳芝麻油溶液10mL/kg，空白对照组给予等量芝麻油，受试组继续给予受试样品至实验结束(与四氯化碳灌胃间隔4h以上)。染毒24h后，处死动物，取血分离血清，冷藏待测AST、ALT；迅速剖腹取出肝脏，部分立即用10％福尔马林固定、常规石蜡包埋，切片，普通HE染色，光镜下观察肝脏的组织形态。另取一部分肝脏用冰生理盐水冲洗、滤纸吸湿后，称取湿重0.2g左右，冰浴下制备10％肝组织匀浆，3000rpm离心15min，取上清，4℃保存，留作MDA检测。
⑤统计学方法：数据以mean±SD表示，应用SPSS for Windows 13.0统计软件包进行处理。计量资料采用秩和检验(Mann-Whitney U)，检验水准α＝0.05。
⑥实验结果：
a.中药组合物能够降低血清ALT、AST含量：与空白对照组比较，模型对照组小鼠血清ALT、AST含量明显升高(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组比较，中药组合物高剂量组与阳性对照组高剂量组均能降低小鼠血清ALT、AST(P<0.01或P<0.05)，此外，单一组分金针菇多糖也可降低ALT、AST，但改善效果不及中药组合物，结果见表3。
b.中药组合物能够降低肝组织MDA含量：与空白对照组比较，模型对照组小鼠肝组织中MDA含量明显升高(P<0.05)。与模型对照组比较，中药组合物高剂量可降低小鼠肝组织中MDA含量(P<0.05)，其余组无统计学意义(P>0.05)；中药组合物高剂量组较阳性高剂量组有显著降低MDA作用(P<0.05)，结果见表3。
表3 7组间CCl4诱导小鼠急性肝损伤ALT、AST、MDA的比较
注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与阳性高剂量组比较，▲P<0.05。
c.肝组织病理切片：正常组肝小叶结构清晰，肝细胞无明显病变，胞浆丰富，核结构清晰。模型组肝正常组织结构消失，肝窦消失，肝细胞胞浆疏松，可见气球样变性。中药组合物组肝小叶结构清晰，肝索、肝窦无明显异常，胞浆着色均匀。
从以上的药效学实验可知，本发明中药组合物具有对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤具有保护作用，改善肝损伤模型小鼠肝组织学的病变。中药组合物高剂量组连续灌胃18d后能够显著降低小鼠的ALT、AST和活性和MDA水平，减轻四氯化碳对肝脏的损伤。肝组织病理切片光镜观察结果显示中药组合物可明显改善肝损伤模型小鼠肝组织学的病变。
中药组合物对70％肝切除损伤的保护作用
建立70％肝切除损伤模型，对中药组合物的肝再生效果进行评价。肝切除术后，给予实施例3中的中药组合物，连续5天。通过测定小鼠血清中ALT、AST指标，肝/体重比，以及EDU增殖试验，进一步评价中药组合物的肝再生效果。
①动物：普通级ICR小鼠，雄性，体重20±2g，由江苏大学实验动物中心提供。室温22±2℃，湿度50～75％。
②试剂及仪器：ALT、AST试剂盒，南京建成生物工程研究所；EdU细胞增殖检测试剂盒，广州锐博生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯；酶标仪(美国BioTek)；Biofuge台式高速冷冻离心机(德国Heraeus)；分析电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
③模型建立：小鼠随机均分为3组，假手术对照组、肝切除组、肝切除术/中药组合物高组，每组15只。行经典70％肝切除手术，具体操作如下：10％水合氯醛腹腔注射麻醉，腹部消毒后，取剑突下腹部正中竖切口，长度2.5cm，开腹时不要损伤腹腔器官组织，依次切开表皮、肌层及腹膜，找到肝脏，用镊子拉开并固定两侧腹肌，充分暴露肝脏；眼科剪游离与肝脏相关的韧带，先后结扎肝中叶及左外侧叶并切除，注意保留胆囊；回纳剩余肝组织及腹内容物，依次缝合关腹，缝合后再次消毒切口。术后禁食禁水6h。皮下注射5％葡萄糖注射液替代术中蒸发损失，放置于37℃温箱复温6h；假手术组麻醉、开腹、关腹及术后处理同肝切除组，操作时间尽量保持一致。
④给药及取材：中药组合物组，0.5g/kg，中药组合物按照实施例4制备。术后每日9:00～10:00经口灌胃受试样品一次，假手术对照组和肝切除组给予同体积蒸馏水(20mL/kg)，持续5d。小鼠处死前4h，腹腔注射EDU(50mg/kg)标记新增殖的细胞核。以手术结束为0h，根据分组时间点要求分别于术后1d、3d、5d将动物处死，取血分离血清，冷藏待测AST、ALT。称量并记录各组再生肝脏的重量，计算肝/体重比，计算公式为：肝/体重比＝(再生肝重)/术后体重×100％。另取样部分肝，立即用10％福尔马林固定、蔗糖脱水后，进行冰冻切片，EDU染色后，于荧光倒置显微镜下观察。
⑤统计学方法：数据以mean±SD表示，应用SPSS for Windows 13.0统计软件包进行处理。计量资料采用秩和检验(Mann-Whitney U)，检验水准α＝0.05。
⑥实验结果：
a.中药组合物能够显著提高肝/体重比：结果如图5所示，肝切除后，小鼠的肝体重比随着时间的延长而逐渐增加。中药组合物组则能显著加快肝切除小鼠的肝体重比的恢复(P<0.01)。
b.中药组合物能够降低血清ALT、AST含量：与空白对照组比较，术后1、3天，肝切除组对照组小鼠血清ALT、AST含量明显升高(P<0.01)。与肝切除组比较，中药组合物组能显著降低小鼠血清ALT、AST(P<0.01)，结果见图6。
c.中药组合物能够促进小鼠肝细胞的增殖：结果如图7所示，肝切除后，小鼠肝细胞有部分增殖，但较少。而中药组合物组，显著提高了肝细胞中EDU阳性细胞核的数目，说明中药组合物组提高肝切除术后肝细胞的增殖，对肝切除后肝细胞再生具有显著促进作用。
本发明充分运用了中医药理论，构思新颖，工艺简单，提取效率高，生产成本低，保肝护肝药效明显，可用于制备保肝药物。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
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