阅读说明：本技术 马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的用途 (application of paliurus ramosissimus or extract thereof in preparation of anti-tumor metastasis medicaments ) 是由 李东晓 周静 徐超群 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的用途。特别地,所述马甲子提取物为马甲子鲜叶的乙醇提取物或乙酸乙酯提取物。实验证明,马甲子提取物对肿瘤细胞迁移有明显抑制作用,在制备抗肿瘤转移的药物上具有很好的应用前景。(The invention provides an application of malachite seed or an extract thereof in preparing a medicine for resisting tumor metastasis. In particular, the paliurus ramosissimus extract is an ethanol extract or an ethyl acetate extract of fresh paliurus ramosissimus leaves. Experiments prove that the paliurus ramosissimus extract has obvious inhibition effect on tumor cell migration and has good application prospect in preparing anti-tumor metastasis medicaments.)

马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的用途。

背景技术

肿瘤转移是肿瘤扩散的主要方式，可使肿瘤细胞扩散到人体多个系统或器官，是肿瘤加重或引起死亡的重要原因。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，而恶性肿瘤细胞一个最主要的特征就是转移，即从原发灶转移到其他部位形成转移灶，并维持复发瘤的生长，是肿瘤转移引起癌症患者死亡的首要因素。

原发灶肿瘤中只有很少一部分细胞具有转移能力。肿瘤的转移与肿瘤发生的机制不同，是多因素、多基因相互协调作用的多阶段过程，是一个非常复杂的过程，包括肿瘤细胞脱离原发灶侵入细胞外基质，侵袭附近血管和***而进入循环系统，并与血小板和靶点处内皮细胞黏附，并相互作用而穿出脉管系统，在靶点处形成新的克隆，有效地逃避机体免疫清除等事件在内的一系列"级联反应"。

研究发现，大多数抗肿瘤的药物都不能抑制肿瘤的转移，目前对肿瘤转移并无很好的治疗办法。

因此，寻找能抑制肿瘤转移的药物是目前肿瘤治疗的关键研究内容，有着广泛的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的新用途。

本发明提供了马甲子或其提取物在制备抗肿瘤转移药物上的用途。

进一步地，所述肿瘤为恶性肿瘤。

进一步地，所述肿瘤为胃癌、盲肠癌或结直肠癌。

进一步地，所述马甲子提取物为马甲子有机溶剂提取物。

进一步地，所述马甲子有机溶剂提取物为马甲子的乙醇提取物或乙酸乙酯提取物。

进一步地，所述马甲子为马甲子鲜叶或马甲子干叶。

进一步地，所述马甲子干叶为马甲子鲜叶经溶剂提取后，干燥后所得产物；或，马甲子鲜叶冷冻干燥所得产物；或，马甲子鲜叶自然干燥所得产物。

进一步地，所述马甲子提取物的制备方法为：取马甲子，粉碎后，加入有机溶剂提取，得提取液a，干燥，即得。

进一步地，所述提取的方式为回流、冷浸或渗漉提取；

所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯中的一种或两种；优选地，所述乙醇浓度为80％以上，更优选为95％；

所以有机溶剂的重量为马甲子的5～10倍。

进一步地，所述马甲子提取物的制备方法具体为：

方法1：取马甲子，粉碎后，加入乙醇提取，得提取液1，干燥，即得马甲子的乙醇提取物1；

或，方法2：取方法1所得马甲子的乙醇提取物1，加入乙酸乙酯提取，得提取液2，干燥，即得马甲子的乙酸乙酯提取物2；

或，方法3：取方法1所得提取液1，加入水，再加入石油醚萃取，取水相再加入乙酸乙酯，萃取，得提取液3，干燥，即得马甲子的乙酸乙酯提取物3。

马甲子是一种常见药用植物，据报道枝叶根花果均可药用，收载于《中药大辞典民间》及一些地方药物志，民间有不少肿瘤患者长期服用，取得满意的治疗效果。但是，未见任何关于马甲子能够用于抗肿瘤转移的报道。

渗漉提取是将适度粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。

本发明通过试验证明，马甲子或其提取物，特别是马甲子鲜叶的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞迁移有明显抑制作用，在制备抗肿瘤转移的药物上具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明所用原料与仪器均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、马甲子鲜品乙醇提取物(EA)的制备

方法(1)取马甲子全株植物鲜品(或其中任一部位，如根、茎、叶等)1kg，加入10倍95％乙醇浸渍1-2天后，取出马甲子药材，挥干乙醇、粉碎，再用原溶媒浸渍3天，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩液干燥即得马甲子乙醇提取物，命名为EA-1。

方法(2)取马甲子全株植物鲜品(或其中任一部位，如根、茎、叶等)1kg，粉碎，加入10倍95％乙醇回流提取3次，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩液干燥即得马甲子乙醇提取物，命名为EA-2。

方法(3)取马甲子全株植物鲜品(或其中任一部位，如根、茎、叶等)1kg，冷冻干燥后粉碎(也可粉碎后冷冻干燥)，加入10倍95％乙醇回流提取3次，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩液干燥即得马甲子乙醇提取物，命名为EA-3。

实施例2、马甲子鲜叶乙酸乙酯提取物(EAEPR)的制备

方法(1)马甲子鲜叶乙醇提取物的浓缩溶液，用5倍石油醚萃取3次后，保留水相，水相用5倍乙酸乙酯萃取3次，减压回收乙酸乙酯后干燥，即得乙酸乙酯提取物，命名为EAEPR-1。

方法(2)马甲子乙醇提物干燥样品，加4～20倍水混悬，用5倍石油醚萃取3次后，保留水相，水相用5倍乙酸乙酯萃取3次，减压回收乙酸乙酯后干燥，即得乙酸乙酯提取物，命名为EAEPR-2。

方法(3)马甲子乙醇提取物干燥样品，用5倍乙酸乙酯回流提取，减压回收乙酸乙酯后干燥，即得乙酸乙酯提取物，命名为EAEPR-3。

实施例3、马甲子干叶乙醇提取物的制备

采用实施例1中方法1相同的方法，将马甲子全株植物鲜品替换为马甲子干叶，制得马甲子干叶乙醇提取物。

实施例4、马甲子干叶乙酸乙酯提取物的制备

采用实施例2中方法1相同的方法，将马甲子全株植物鲜品替换为马甲子干叶，制得马甲子干叶乙酸乙酯提取物。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、马甲子提取物对HGC-27细胞迁移率的影响

1.材料和方法

1.1试验药物

马甲子鲜叶乙醇提取物(EA-1，实施例1中方法1制得)、鲜叶乙酸乙酯提取物(EAEPR-1，实施例2中方法1制得)、干叶乙醇提取物(实施例3中制得)和干叶乙酸乙酯提取物(实施例4中制得)。EA-1和EAEPR-1用异丙醇分别配制成5.648、11.368、22.736μg/ml，干叶乙醇提取物和干叶乙酸乙酯提取物分别用异丙醇配制成11.368μg/ml，配制样品4℃保存备用。

1.2细胞

HGC-27细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3试剂

RPMI-1640培养基、FBS、TrypLE Select液、双抗、DPBS和HEPES缓冲液等购于美国GIBCO公司。CCK-8和DAPI购于美国Sigma公司。细胞周期和细胞凋亡测定试剂盒，购于美国BD公司。

1.4主要仪器

小型台式离心机(Thermo Scientific，美国)，全自动细胞计数器(MILLIPORE，美国)，全自动酶标仪(Molecular Devices，美国)，荧光倒置显微镜(Zeiss，德国)，流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)。

1.5方法

HGC-27细胞按照常规方法复苏，将收获的细胞用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基，37℃5％CO₂恒温培养箱中静置培养。待细胞长至80％-90％融合时，以TrypLE Select液消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

采用细胞划痕法检测受试物对细胞迁移的影响。取对数生长期的HGC-27细胞，TrypLE Select液消化后，以2.5×10⁴个/ml浓度分别接种于24孔板，待细胞铺满，用200μL移液器吸头进行划痕，PBS洗去划下的细胞，加入终浓度为5.684μg/ml、11.368μg/ml、22.736μg/ml马甲子提取液，继续培养36h、48h后，镜下拍照，通过测量划痕宽度，计算迁移率。迁移率＝(0h划痕宽度-其他时间点划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。

2.结果

结果如表1所示，可以看出除马甲子干叶乙醇提取物外，其他各组马甲子提取物均对肿瘤细胞迁移均有抑制作用，其中，相同浓度下(11.3μg/ml)，鲜叶乙醇提取物和鲜叶乙酸乙酯提取物处理后的肿瘤细胞迁移率明显比干叶乙醇提取物和干叶乙酸乙酯提取物处理后的肿瘤细胞迁移率低，说明鲜叶乙醇提取物和鲜叶乙酸乙酯提取物对抑制肿瘤迁移具有更好的效果；特别是11.3μg/ml、22.7μg/ml的马甲子鲜叶乙酸乙酯提取物和22.7μg/ml的马甲子鲜叶乙醇提取物均对细胞迁移抑制作用更为明显，说明这两种提取物均可以用于制备抗肿瘤转移的药物。

表1马甲子提取物对HGC-27细胞迁移的影响

**与空白对照组比较，P<0.01；*与空白对照组比较，P<0.05。

实验例2、马甲子提取物对LS513细胞迁移率的影响

1.材料和方法

1.1试验药物

马甲子鲜叶乙醇提取物(EA-1，实施例1中方法1制得)、鲜叶乙酸乙酯提取物(EAEPR-1，实施例2中方法1制得)、干叶乙醇提取物(实施例3中制得)和干叶乙酸乙酯提取物(实施例4中制得)。EA-1和EAEPR-1用异丙醇分别配制成3.807、7.614、15.228μg/ml，干叶乙醇提取物和干叶乙酸乙酯提取物分别用异丙醇配制成7.614μg/ml，配制样品4℃保存备用。

1.2细胞

LS513细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3试剂

RPMI-1640培养基、FBS、TrypLE Select液、双抗、DPBS和HEPES缓冲液等购于美国GIBCO公司；丙酮酸钠购自Solarbio，CCK-8购于日本同仁公司。

1.4主要仪器

小型台式离心机(Thermo Scientific，美国)，全自动细胞计数器(MILLIPORE，美国)，全自动酶标仪(Molecular Devices，美国)，荧光倒置显微镜(Zeiss，德国)。

1.5方法

LS513细胞按常规方法复苏，将收获的细胞用含10％FBS的RPMI-1640的培养基混匀，接种于100mm细胞培养皿，37℃5％CO₂恒温细胞培养箱中静置培养24h，更换新鲜培养液继续培养。待细胞长至80％-90％融合时，以TrypLE Select液消化传代，细胞传2-3代后用于实验。

采用细胞划痕法检测受试物对细胞迁移的影响。细胞用TrypLE Select液消化，以5×10⁴个/孔接种于24孔板，待24h细胞贴壁后，用200μL移液器吸头进行划痕，PBS洗去划下的细胞，加入终浓度为3.807μg/ml、7.614μg/ml、15.228μg/ml马甲子提取液，继续培养36h、48h后，镜下拍照，通过测量划痕宽度，计算迁移率。迁移率＝(0h划痕宽度-其他时间点划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。

2.结果

实验结果见表2，药物与细胞共培养后，除鲜叶乙醇提取物3.807ug/ml、干叶乙醇提取物7.614ug/ml在48h时对细胞迁移没有明显的抑制作用外，其余各组在不同的时间点，对LS513细胞迁移均有显著的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。

表2马甲子提取物对LS513细胞迁移的影响

**与空白对照组比较，P<0.01

综上，本发明提供了马甲子或其提取物，特别是马甲子鲜叶的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物在制备抗肿瘤迁移药物上的用途。实验证明，马甲子鲜叶提取物对肿瘤细胞迁移有明显抑制作用，在制备抗肿瘤转移的药物上具有很好的应用前景。