阅读说明：本技术 一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用 (Fluorescent probe for detecting butyrylcholine esterase activity and synthetic method and application thereof ) 是由 丁彩凤 张倩 傅彩霞 滕葆晖 张鹏 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用,其公开了一种在无背景信号检测基础上建立的新型丁酰胆碱酯酶传感策略,在丁酰胆碱酯酶的作用下,实现荧光信号从无到有的转变,进而检测丁酰胆碱酯酶的浓度水平。所述荧光探针通过将丁酰胆碱酯酶的靶向位点引入非发射骨架生成探针P1,避免了检测探针的固有荧光背景,极大地提高了检测灵敏度。在加入丁酰胆碱酯酶后,可以除去环丙基丁酸,进而自发的原位环化,生成荧光产物PF以作为反映BChE活性的指示剂。本发明不仅可以大幅提高检测灵敏度,还具有良好的选择性及生物相容性,在临床诊断领域具有很大的潜力。(The invention discloses a fluorescent probe for detecting butyrylcholinesterase activity and a synthesis method and application thereof, and discloses a novel butyrylcholinesterase sensing strategy established on the basis of background signal-free detection, which realizes the conversion of a fluorescent signal from nothing to nothing under the action of butyrylcholinesterase so as to detect the concentration level of butyrylcholinesterase. The fluorescent probe generates the probe P1 by introducing the target site of butyrylcholinesterase into a non-emission skeleton, so that the inherent fluorescent background of the detection probe is avoided, and the detection sensitivity is greatly improved. After butyrylcholinesterase is added, cyclopropyl butyric acid can be removed, and then spontaneous in-situ cyclization is carried out, so that a fluorescent product PF is generated to serve as an indicator reflecting BChE activity. The invention not only can greatly improve the detection sensitivity, but also has good selectivity and biocompatibility, and has great potential in the field of clinical diagnosis.)

一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与 应用

技术领域

本发明属于丁酰胆碱酯酶活性检测技术领域，涉及一种用于检测细胞内以及组织切片和生物体内的丁酰胆碱酯酶活性水平的方法策略。更具体地，涉及一种非发射探针及其合成方法和它在检测丁酰胆碱酯酶时自发环化生成荧光团进而作为指示剂的应用。

背景技术

丁酰胆碱酯酶(BChE)又称假性胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅱ。由于BuChE在肝脏合成后立即释放进入血液，因此可作为评价肝细胞合成功能的灵敏指标，测定血清中的BChE浓度水平一般用作肝功能检测试验。据报道，BChE也与阿尔茨海默症(AD)等复杂的神经退行性疾病密切相关，随着AD的发展，BChE水平显著上升，通过跟踪BChE活性来监测相关疾病的发生具有十分重要的意义。

现今，BChE活性的检测方法主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、拉曼光谱、pH电位法、分光光度法、放射化学、羟胺比色法和5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)分析等等。对于前三种方法，很难避免操作复杂，灵敏度低和稳定性差的问题，从而阻碍了它们的进一步应用。然而虽然DTNB测定法以硫代丁酰胆碱为底物，具有较高的灵敏度，但因其受到检测系统的潜在干扰，这可能会导致准确性降低。且在羟胺比色法中，乙酰胆碱用作反应性底物，不利于BChE测定，导致不可避免地降低检测灵敏度。

因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的非发射型荧光探针。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针，所述探针的结构式为：

所述探针将特定的反应位点环丙基丁酸酯引入非发射骨架上，以产生BChE靶标受体P1，从而排除了探针本身中的固有荧光。同时引入BChE后，可以特异性切除环丙基丁酸，并进行自发环化反应，生成的荧光产物可以指示BChE的活性。本发明可以通过荧光检测设备进行可视化鉴别，也可进入活细胞、脑组织切片和生物体对内源性丁酰胆碱酯酶进行测定。

本发明的另一目的是提供一种检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)在0℃下，以无水二氯甲烷为反应介质，以4-(二乙氨基)-水杨醛和环丙烷甲酰氯为反应物，以三乙胺创造碱性环境，混合物在室温搅拌过夜，随后利用二氯甲烷和去离子水萃取分离，通过减压蒸馏除去溶剂，并将粗产物通过柱色谱法纯化(PE：EA＝10：1)，得到化合物1；

(2)以无水乙醇为反应介质，以2-氨基苯硫醇和丙二腈为反应物，加入3-5滴乙酸创造酸性环境，室温下搅拌反应4～6h，萃取分离，经减压旋蒸得到化合物2；

(3)以无水乙醇为反应介质，以步骤(1)制备的化合物1和步骤(2)制备的化合物2为反应物，加入哌啶作为催化剂，于60℃～90℃下回流4～8h，经减压旋蒸除去溶剂，并将残余物溶于乙酸乙酯，然后用稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤后通过硅胶柱色谱法纯化，使用混合物(CH₂Cl₂：MeOH＝80：1)作为洗脱溶剂，最终得到所述用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针P1。

上述荧光探针P1的合成路线如下：

上述公开的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针P1的合成方法不仅操作简单，而且提纯方便快捷，适于市面推广与应用。

通过本发明合成的荧光探针其是一种非发射探针，避免了固有荧光背景带来的干扰，引入检测物后可以进行自发的原位取代反应，生成绿色的发射荧光团用于检测物的指示，且该荧光探针可用于细胞、脑组织切片和生物体水平上的成像。

另外，发明人通过核磁共振氢谱、碳谱等手段进行表征，以表明荧光探针P1合成成功，具体参见说明书附图1及附图2。

优选的，所述步骤(1)中，4-(二乙氨基)-水杨醛、环丙烷甲酰氯和三乙胺的摩尔比为1：(1.2～1.5)：(1.5～2.5)。

优选的，所述步骤(2)中，2-氨基苯硫醇和丙二腈的摩尔比为1：(1.2～2.5)。

优选的，所述步骤(3)中，化合物1、化合物2与哌啶的摩尔比为1：(1.2～1.5)：(1.2～2.5)。

需要说明的是，针对上述公开的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针的合成反应，发明人通过创造性试验得到各种原料配比，其中哌啶和三乙胺的配比尤为重要，且哌啶的含量直接影响到反应进行的程度，关系到反应完全及过量处理的步骤；而三乙胺影响到反应的酸碱调控，关系到反应能否顺利进行。

本发明还有一个目的，就是提供上述荧光探针P1在检测丁酰胆碱酯酶活性中的具体应用。

具体包括所述荧光探针在溶剂体系中选择性识别丁酰胆碱酯酶的应用。

其中，本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应操作如下所示：

向含有探针P1的PBS缓冲溶液中加入丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶特异性催化环丙基甲酸酯水解，产生的O^-具有亲核性，O^-进攻-CN，进而自发的原位环化，生成荧光产物PF。其中本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应后形成化合物荧光团PF的¹H NMR图谱如附图3所示。

优选的，探针与丁酰胆碱酯酶反应的最适条件是：在37℃下于pH为7.4的PBS缓冲溶液中共同孵育90min。

具体反应方程式如下所示：

并且，如图5所示，所述荧光探针对于丁酰胆碱酯酶的检测限低至0.092μg/mL(由LOD＝3.3σ/k计算所得)，其检测灵敏度相比于大多数现有技术文献均高。

在一些应用场景中，还包括所述荧光探针在以丁酰胆碱酯酶为标志物的检测及筛选丁酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明合成的荧光探针用以丁酰胆碱酯酶的特异性识别检测，因其结构上含有丁酰胆碱酯酶的识别位点环丙基丁酸酯，该探针本身是基于非发射骨架构建的，避免了自身的荧光背景干扰，在丁酰胆碱酯酶的存在下，此探针会迅速切割环丙基丁酸酯键进而自身发生环化反应，形成具有绿色荧光的荧光团指示剂，因此可以实现对目标物丁酰胆碱酯酶的荧光开启响应。

优选的，所述丁酰胆碱酯酶在HEK293细胞中过度表达，在一些癌细胞中表达较低，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性丁酰胆碱酯酶进行检测。

优选的，所述荧光探针可用于脑组织切片和生物体内中丁酰胆碱酯酶活性的检测。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针及其合成方法与应用，其是一种基于零背景设计的非发射探针的合成方法及其检测细胞内、脑组织切片和生物体内源性丁酰胆碱酯酶的应用，具有如下优异特性：

本发明公开合成的荧光探针基于非发射骨架通过引入丁酰胆碱酯酶的识别基团构成靶标探针，在丁酰胆碱酯酶存在时，探针的识别基团被切割，形成了一种荧光团，具有绿色发射性质，通过绿色荧光的强度进而达到检测丁酰胆碱酯酶水平的目的。并且本发明所公开的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的方法策略极具市场应用与推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明荧光探针的¹H NMR图谱。

图2为本发明荧光探针的¹³C NMR图谱。

图3为本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应后形成荧光团的¹H NMR图谱。

图4为本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶反应后的吸收光谱(a)及荧光发射光谱(b)。

图5为本发明荧光探针与不同浓度的丁酰胆碱酯酶反应的荧光光谱图(a)及二者反应的线性响应曲线图(b)。

图6为本发明荧光探针与丁酰胆碱酯酶在加入抑制剂反应后的荧光发射光谱(a)与抑制效率曲线(b)。

图7为本发明荧光探针用于HEK 293，HeLa和HepG2三种细胞株中丁酰胆碱酯酶活性检测的荧光成像图。

图8为本发明荧光探针用于脑组织切片中丁酰胆碱酯酶活性检测的荧光成像图。

图9为本发明荧光探针用于裸鼠体内丁酰胆碱酯酶活性检测的荧光成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的测定丁酰胆碱酯酶的探针及其合成方法与应用。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明公开了一种测定丁酰胆碱酯酶活性的探针，所述探针的结构式为：

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1：荧光探针的合成

1.合成步骤：

(1)在0℃下，将4-(二乙氨基)水杨醛(0.97g，5.0mmol)和三乙胺(1.40mL，10.0mmol)溶解在20mL无水二氯甲烷中，随后加入在10mL二氯甲烷中的环丙烷甲酰氯(0.63g，6.0mmol)，混合物在室温搅拌过夜；猝灭反应后，溶液用盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，然后通过减压蒸馏除去溶剂，并将粗产物通过柱色谱法纯化(PE：EA＝10：1)，以83％的产率得到化合物1，且反应过程如式(1)所示：

(2)称取1.25g(10.0mmol)2-氨基苯硫醇和0.8g(12.0mmol)丙二腈，溶于20mL无水乙醇，加入0.5mL乙酸，室温下搅拌反应5h，萃取分离，经减压旋蒸得到化合物2，反应过程如式(2)所示：

(3)将化合物1(0.26g，1.0mmol)和化合物2(0.19g，1.1mmol)搅拌加入至30mL乙醇中，然后加入几滴哌啶作为催化剂；将混合物在80℃加热6h后，通过减压蒸馏除去溶剂，并将残余物溶于乙酸乙酯，然后用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，将其通过硅胶柱色谱法纯化，使用混合物(CH₂Cl₂：MeOH＝80：1)作为洗脱溶剂，得到探针P1(0.153g，产率为63％)，反应过程如式(3)所示：

2.测试分析：

图1为探针P1的¹H NMR图谱，具体谱峰值为：δppm8.89(s,1H),8.13(d,J＝7.9Hz,1H),8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.73(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.41(t,J＝7.6Hz,1H),6.80(d,J＝8.9Hz,1H),6.47(s,1H),3.50(q,J＝6.9Hz,4H),1.92(d,J＝4.1Hz,1H),1.15(t,J＝7.0Hz,6H),1.08(s,2H),1.02–1.00(m,2H)，其与探针基团相对应，可证明探针合成成功。

图2为探针P1的¹³H NMR图谱，具体谱峰值为：δppm195.18,164.60,162.00,152.82,145.27,144.65,137.48,135.49,135.17,133.31,131.79,131.60,128.96,127.84,127.76,127.51,126.68,123.48,122.64,20.76，与探针基团对应，进一步证实该探针结构正确。

为了进一步验证本发明公开合成的荧光探针在检测丁酰胆碱酯酶活性中的优异效果，发明人还进行了如下实验操作：

实验1：探针在缓冲溶液中与丁酰胆碱酯酶反应能力测试

(1)将合成的探针制成2.0mmol·L^-1的水溶液，取20μL加入到含有2mL PBS缓冲溶液(10mmol·L^-1，pH＝7.4)的离心管中，加入4μL丁酰胆碱酯酶(50mg·mL^-1)，于37℃孵育90分钟后检测吸收光谱和荧光发射光谱变化。

图4为探针与丁酰胆碱酯酶反应前后的吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b)。由图4(a)可知，反应后溶液的最大紫外吸收在490nm左右，保留了原探针的基本骨架，由图4(b)知晓原探针的荧光强度可忽略不计，在BChE酶促水解探针P1时，在528nm处可以监测到强烈的荧光信号，这提供了一种无背景检测的传感方法。

(2)取系列离心管，分别加入2mLPBS缓冲溶液(10mmol·L^-1，pH＝7.4)和探针20μL，加入系列浓度的丁酰胆碱酯酶(0-300μg·mL^-1)，分别于37℃孵育90分钟后检测荧光发射光谱变化。

图5为探针对丁酰胆碱酯酶浓度的滴定实验，从图中可以很容易地捕获到P1对BChE明显的荧光响应，甚至在BChE浓度为0.5μg/mL时依旧可以观察到增强的荧光响应，这暗示着此策略具有较高的传感灵敏度。随着BChE浓度的增大，528nm处的荧光强度逐渐增加，当BChE浓度水平升高至40μg/mL时趋于饱和状态，528nm处的荧光强度与BChE浓度在0.5-7.0μg/mL之内表现出良好的线性关系，从而产生了高相关系数和0.092μg/mL的低检测限(LOD)，相对而言要显著低于报道过的文献中的检测限值。

由此说明丁酰胆碱酯酶可与探针发生特异性反应，形成具有绿色荧光的荧光团以指示丁酰胆碱酯酶的浓度水平。

实验2：荧光探针的抑制剂表征

用不同浓度的他克林(丁酰胆碱酯酶抑制剂)与丁酰胆碱酯酶(100μg/mL)预处理30分钟，然后再与探针(20μM)在37℃孵育90分钟后检测荧光光谱变化。

图6为抑制剂对丁酰胆碱酯酶预处理与P1反应后的荧光光谱，当引入他克林时，可以观察到528nm处的荧光强度大大降低，具有明显的抑制效果。表明探针P1对BChE的检测灵敏度很高，从抑制效率曲线可以计算出对应于100μg/mL的BChE，他克林的IC₅₀值为8.57nM。

由此表明探针是与丁酰胆碱酯酶发生酶催化反应后导致的荧光开启响应。

实验3：探针对细胞中丁酰胆碱酯酶水平的测定

将三种细胞系分别与P1(5μM)孵育0.5小时。对照组：HEK293细胞用他克林(50μM)预处理0.5h然后用5μM探针P1处理30分钟后，将这些细胞用PBS缓冲液洗涤，并在488nm激发后拍摄图像。由图7可知，在HEK293细胞中可以观察到明亮的荧光，这是由于在这种细胞系中具有正常水平的BChE，HeLa和HepG2细胞中微弱的荧光响应进一步证实了血清测试的结论，即疾病尤其是癌症可能导致BChE活性降低。作为对照，通过抑制剂他克林预处理以抑制BChE活性，得到与肿瘤细胞相似的结果，微弱的荧光响应证实了探针P1可以特异性检测细胞内的BChE活性。

实验4：探针对脑组织切片中丁酰胆碱酯酶水平的测定

用10μMP1孵育0.5小时，用或不用50μM他克林预处理0.5小时的新鲜大鼠脑切片在488nm激发后拍摄图像。由图8可知，与P1孵育后，在图中观察到强烈的荧光，尤其是在血管横截面附近的区域，而用抑制剂他克林预处理后，将对照样品与探针P1培养，产生了鲜明的对比，即用抑制剂预处理的切片显示出响应强度的大幅度下降。这些结果证实探针P1也可以用于脑切片测试。

实验5：探针对生物体内丁酰胆碱酯酶水平的测定

实验小鼠的BChE水平在正常范围内，足以触发感测程序。一组小鼠用探针P1处理后，在一段时间后检测小鼠脑部区域的发射反应，同时对另一组小鼠进行他克林原位注射以抑制BChE活性，然后使用探针P1，在一段时间后检测小鼠脑部区域的发射反应。

由图9可知，不用他克林处理的小鼠可以在0.5小时内轻松捕获脑部区域的发射反应，这展示了对活生物体中内源性BChE的快速检测方式。在接下来的2小时研究中，荧光总体上保持在相同的范围内，并且伴随着强度的增长。而进行他克林原位注射以抑制BChE活性的小鼠，弱响应会持续2小时以上，而强度不会明显下降。

结果表明，本发明公开合成的用于检测丁酰胆碱酯酶活性的荧光探针能够以高选择性可视化内源性BChE的表达水平，进一步表明其在病理学研究中的潜在应用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。