阅读说明：本技术 一种双链dna结合荧光染料及其制备与应用 (Double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) combined fluorescent dye as well as preparation and application thereof ) 是由 徐祎春 崔雷 韩峻松 袁箐 周佳菁 苏军 周欣怡 于 2019-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双链DNA结合荧光染料,该染料包含有式ⅰ所示结构或其立体异构体。本发明还公开了上述染料的制备方法及用途。本发明通过叔胺连接两个荧光团,且荧光团易于π-π堆积错位,降低两个分子结合前的荧光强度,获得更强的扩增信号,从而提高了双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性,降低了其细胞毒性和对PCR的抑制性。(The invention discloses a double-stranded DNA binding fluorescent dye, which comprises a structure shown as a formula i or a stereoisomer thereof. The invention also discloses a preparation method and application of the dye. According to the invention, the tertiary amine is used for connecting the two fluorophores, and the fluorophores are easy to be subjected to pi-pi stacking dislocation, so that the fluorescence intensity before the combination of the two molecules is reduced, and a stronger amplification signal is obtained, thereby improving the sensitivity and stability of the double-stranded DNA combined fluorescent dye, and reducing the cytotoxicity and the inhibition on PCR.)

一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用

技术领域

本发明涉及核酸染料领域，特别是涉及一种新型的双链DNA结合荧光染料。

背景技术

双链DNA（dsDNA）结合荧光染料中最具代表性的是分子溴化乙锭，其早已用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。

双链DNA结合荧光染料同样应用于检测核酸的实时扩增，例如PCR。对应的扩增产物可以通过DNA结合荧光染料予以识别，当该染料和双链核酸相互作用后，再用适宜的波长激发，可以发射相应的荧光信号。在PCR反应过程中，待测样品中只要存在双链的DNA，染料就可以选择性的结合，同时可以检测到荧光信号。当双链DNA解离时，信号会迅速降低。这种信号的衰减同样适合于荧光强度对温度-时间曲线的监测。

双链DNA结合荧光染料还可用于实时PCR的检测。此时，最经常使用的荧光染料是SYBRGreen I。SYBRGreen I因为其高效低毒得到广泛的应用，但是由于其本身不能用于普通的PCR缓冲液，需要添加DMSO、DBA等额外试剂；同时，虽然可以通过增加MgCl2的浓度降低其PCR抑制效应，但是浓度依赖的抑制效果依然存在，因此SYBRGreen I在多重PCR应用中受限。研究发现，当进行双重PCR扩增时，只能检测到一个产物的溶解曲线，但是电泳分析却明确显示含有两个产物。因此，尽管SYBRGreen I应用范围较广，但仍存在可用浓度范围小、序列结合偏差性大等缺点。

此外，现有的多种核酸染料本身具有较高的毒性，这主要是由于染料分子可以轻易地穿透细胞膜，从而和细胞内的核酸DNA结合，导致基因突变，具有一定的致癌性。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种双链DNA结合荧光染料，它灵敏性和稳定性好，细胞毒性低，对PCR的抑制性小。

为解决上述技术问题，本发明的双链DNA结合荧光染料，其分子结构中包含有式ⅰ所示的结构或其立体异构体：

（ⅰ）

较佳的，所述荧光染料的分子结构式优选为：

其中，X为卤素，例如Br或I。

所述式ⅰ的立体异构体主要为ZE异构：

（ⅲ）

（ⅳ）

本发明要解决的技术问题之二是提供上述双链DNA结合荧光染料的制备方法。该方法主要包括以下步骤：

1）2-甲基苯并噻唑与1,2-二碘乙烷反应获得中间体I：

2）中间体I与甲胺反应获得中间体Ⅱ：

3）中间体Ⅱ与对氨基苯甲醛反应获得式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料：

。

上述步骤1）中的原料1,2-二碘乙烷也可以选用其他邻二卤代乙烷替代，例如1,2-二溴乙烷。

上述步骤2）优选采用封管反应法，反应体系中可以添加缚酸剂，所述缚酸剂可以选用二异丙基乙胺，添加量优选为1.5当量。

上述步骤3）的反应优选采用乙酸和哌啶的混合液作为催化体系，乙酸和哌啶的体积比优选为1:1～1:4。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述双链DNA结合荧光染料的用途，该双链DNA结合荧光染料可用于核酸的实时定量PCR检测。

本发明的双链DNA结合荧光染料，通过叔胺连接两个荧光团，且荧光团中的N,N'-二甲基苯易于形成强烈的π-π堆积，从而形成类分子簇的结构，导致该染料本身的荧光强度降低；当该染料和核酸结合以后，由于苯并噻唑和N,N'-二甲基苯的双键连接臂易于受到核酸结构的限制而固定，导致整个荧光团结构的刚性化，便于形成共轭，从而可以获得更强的扩增信号，提高双链DNA结合荧光染料的灵敏性和稳定性，同时降低其细胞毒性和对PCR的抑制性。另外，本发明的双链DNA结合荧光染料可以直接用于普通的PCR缓冲液，不需要添加DMSO、DBA等额外试剂。

附图说明

图1为本发明实施例1的中间体Ⅱ的核磁共振谱图；

图2为本发明实施例1的最终产物（式Ⅲ化合物）的核磁共振谱图；

图3～图6为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于实时荧光定量PCR的扩增曲线结果图；

图7为使用对比试剂SYBR的实时荧光定量PCR扩增曲线结果图；

图8～图11为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于PCR定量的标准曲线结果图；

图12为使用对比试剂SYBR的PCR定量的标准曲线结果图。

图13为对照品EB用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

图14为对照品GelRed用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

图15为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物用于琼脂糖凝胶电泳结果图；

图16为对照品SYBR Safe细胞毒性安全性能测试图；

图17为本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物细胞毒性安全性能测试图。

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1 双链DNA结合荧光染料的制备

本实施例的双链DNA结合荧光染料的制备方法如下：

1）将原料2-甲基苯并噻唑(0.30 g，2.0 mmol，1 eq)缓慢滴加到1,2-二碘乙烷(2.85g， 10.1 mmol，5eq)的乙醇溶液中，温度控制在60℃。30 min左右滴加完毕后，将温度调至回流温度，并持续90min。反应完成后，移除溶剂，并在丙酮中结晶得到目标产物中间体I：

。

2）分别将中间体I（1.0 mmol，1eq）、甲胺（0.48mmol，0.48eq）的甲醇溶液和二异丙基乙胺（2.5eq）并液，加入10mL的正丁醇做溶剂，反应采用封管，加热温度为135℃，制备并液相分离得到中间体Ⅱ：

所得中间体Ⅱ的核磁共振谱图如图1所示。

3）由中间体Ⅱ（0.5 mmol，1.0 eq）、4-N,N'-二甲氨基苯甲醛（0.75mmol，1.5eq）和催化量的乙酸:哌啶（v/v）混合液（0.8 mL）一次溶于25mL的乙醇中。混合溶液回流反应4h后，真空移除溶液，制备并液相分离、纯化得到最终产物（Ⅲ）：

其中，催化剂体系乙酸:哌啶（v/v）= 1:1～1:4。

该最终产物（即式Ⅲ结构的双链DNA结合荧光染料）的核磁共振谱图如图2所示。

实施例2 实时荧光定量PCR扩增

针对目的基因GAPDH，以Promega Control DNA为模板，以实施例1制备的式Ⅲ化合物为荧光染料，使用ABI 7500荧光定量PCR仪，进行实时荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR扩增的引物序列分别如下：

上游引物：CTGCCAGCCTAGCGTTGAC （SEQ ID NO:1）

下游引物：CCAATCCTCCCGGTGACAT （SEQ ID NO:2）

20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，2.5mM dNTP 1.6μL，25mM MgCl21.6μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ROX II 0.2μL，5U/μL rTap酶（TAKARA）0.125μL，模板DNA（Promega Control DNA）1.0μL (分别含80、40、20、10、5ng DNA)，式Ⅲ结构的荧光染料1.0μL（终浓度分别为0.375nM、0.75nM、1.5nM和3nM），加水补齐至最终体积20.0μL。

PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃扩增5s，60℃ 34s，共40个循环。

对比试剂20μL PCR反应体系为：2×SYBR® Premix Ex Taq™ II缓冲液 10μL，ROX II 0.2μL，模板DNA（Promega Control DNA）1.0 μL(含20ng DNA) ，加水补齐至最终体积20.0μL。PCR反应条件同上。

使用式Ⅲ结构的荧光染料的PCR扩增曲线结果如图3-6所示。使用对比试剂SYBR的PCR扩增曲线结果如图7所示。使用式Ⅲ结构的荧光染料的PCR定量的标准曲线结果如图8～11所示。使用对比试剂SYBR的PCR定量的标准曲线结果如图12所示。由图3～6和图8～11可以证实，本发明实施例1制备的式Ⅲ化合物可以用作荧光染料，在较大的浓度范围内，均能应用于核酸的实时扩增检测，通过荧光强度的变化实时监测荧光定量PCR反应，实现基因的相对定量分析。

实施例3 染色效果对比实验

将上述实施例1制备的双链DNA结合荧光染料（终浓度为0.6μM）与EB溴化乙锭（终浓度为5μM）和1× Gelred商业化核酸染料分别用DL2000 Marker进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图13-15所示，其中，图13为EB染料，图14为Gelred染料，图15为实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，1-4条带对应的DL2000 Marker上样量依次为：200、100、50和25ng。

由图13-15可以看到，本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，相比Gelred和EB染料，不仅可以获得与Gelred 和EB染料相当的染色效果，而且根据同样条件下获得的凝胶电泳测试结果可知，与Gelred染料相比，使用本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料染色后的核酸，在凝胶电泳中不存在拖尾现象，对不同大小的DNA片段的区分更为明显。

实施例4 细胞毒性实验

将Hela细胞在37℃下分别在1×本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料和1×SYBR Safe内培育30分钟。所得样品在荧光显微镜下拍照，曝光时间均为400ms。实施例1制备的双链DNA结合荧光染料选用CY3滤光片，SYBR Safe选用FITC滤光片。SYBR Safe和实施例1制备的双链DNA结合荧光染料的细胞毒性安全性能测试结果分别如图16和图17所示。由图16可以清晰看到，SYBR Safe可以很快穿透细胞膜并将核酸部分染色，但是由图17所示可以证实，本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，因为不能穿透细胞膜，所以几乎看不到任何被染色的物质，可见本发明实施例1制备的双链DNA结合荧光染料，相比SYBR Safe核酸染料，对细胞具有更高的安全性。

序列表

<110> 上海生物芯片有限公司

<120> 一种双链DNA结合荧光染料及其制备与应用

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