产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用
阅读说明：本技术 产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用 (Recombinant saccharomyces cerevisiae for producing cannabidiol, construction method and application thereof ) 是由 李振皓 王彩霞 侯康鑫 李明焱 李振宇 史月姣 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了产大麻二酚的重组酿酒酵母,该重组酿酒酵母表达大麻二酚合成途径中的AAE1、CsPT4、OAC、OLS、CBDAS基因,且过表达tHMGR、AAE1和CBDAS基因;本发明还公开了该重组酿酒酵母的构建方法,是通过将AAE1、OLS、OAC、CBDAS、CsPT4基因整合到酵母菌染色体中,同时将tHMGR、AAE1和CBDAS的多拷贝添加诱导型启动子整合到酵母菌染色体中构建而成；本发明也公开了上述重量级酿酒酵母通过发酵生产大麻二酚的一种应用。本发明通过优化酵母菌株实现生物合成大麻二酚的目的,缓解当前市场上面临的大麻二酚缺口较大的问题,可广泛应用于大麻二酚的生产过程。(The invention discloses a recombinant saccharomyces cerevisiae for producing cannabidiol, which expresses AAE1, CsPT4, OAC, OLS and CBDAS genes in a cannabidiol synthesis pathway, and overexpresses tHMGR, AAE1 and CBDAS genes, and also discloses a construction method of the recombinant saccharomyces cerevisiae, which is constructed by integrating AAE1, OLS, OAC, CBDAS and CsPT4 genes into a yeast chromosome, and integrating multiple copies of tHMGR, AAE1 and CBDAS with an inducible promoter into the yeast chromosome; the invention also discloses an application of the weight-grade saccharomyces cerevisiae in producing cannabidiol by fermentation. The invention realizes the purpose of biologically synthesizing the cannabidiol by optimizing the yeast strains, relieves the problem of larger cannabidiol gaps in the current market, and can be widely applied to the production process of the cannabidiol.)
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域，涉及酿酒酵母，具体地说，是一种产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用。
背景技术
工业大麻及大麻二酚的生产和应用在全球逐步合法化，药理效果显著，市场前景巨大；全球大麻二酚产业价值在2019年将达到57亿美元，到2021年将达到181亿美元。
工业大麻(Cannabis sativa)为一年生草本植物，大麻素是工业大麻中特有的功效物质，大麻素达70多种，其中四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)为其主要成分。THC是工业大麻是重要的活性成分，具有神经保护作用，但是因其具有致幻作用，被很多国家禁用；CBD是工业大麻中非致幻成分，在精神镇定、抗癫痫、抗炎及抗抑郁方面展示了巨大的药用潜质。除了活性成分，工业大麻的种子可作为一款中药火麻仁，其纤维广泛用于纺织工业。2018年6月份，美国FDA宣布批准了制药公司GW的Epidiolex口服液上市，在此之前2016年美国FDA授予该公司的Epidiolex(大麻二酚，CBD)治疗罕见遗传性结节性硬化症(TSC)的孤儿药地位。目前美国公司作为主要投资的AXIM(R)Biotech 使用含大麻二酚口香糖治疗肠易激综合征进入临床试验。此外，文献调研CBD 还可以缓解各种不同的疾病，包括肌肉痉挛、焦虑、恶心、慢性疼痛、炎症、失眠等，在精神分裂等方面也有一定的效果，但未见临床试验报道。
CBD原料分为两个级别，原料药及食品或化妆品级别，其中原料药CBD的纯度需要在99％以上，食品和化妆品级别在5-95％不等，CBD原料药主要在欧洲和美国生产，国内有少量的供应。CBD原料主要销往美国，而欧洲暂不允许进口CBD原料。我国国内CBD产能远远低于美国和欧洲市场，产能最大的汉素称其可以年产2吨，其他公司几乎很少；而康恩贝、紫鑫药业、龙津药业、顺灏股份、仁和药业、方盛制药等企业纷纷宣布投资进入工业大麻市场，在云南和黑龙江两个省份进行工业大麻的种植、提取及产品深加工的业务。相比美国和欧洲，国内工业大麻产业整体处理起步阶段，主要问题是无品种、提取分离技术落后、产能低、无深加工产品以及政策限制等系列问题。
在CBD原料制备上，化学合成也是一种思路，综合目前文献调研结果，其化学合成方法存在着步骤冗长、反应条件苛刻、原料无法大量获取、反应规模小等诸多问题。真正依靠化学合成实现大麻二酚原料药的产业化比较困难。
除了化学合成，在2019年加州大学伯克利实验室Keasling教授率先开展了酵母菌发酵合成大麻素类成分的研究。专利号为CN201880046655.9的中国发明专利，涉及“在酵母中生产大麻素”，提供了一种遗传修饰的酵母，其不仅利用了大麻素的产生基因和合成途径基因，还需要加入其他辅助性基因片段以及其他辅料；专利号为CN201880042884.3的中国发明专利，涉及“产生大麻素和大麻素衍生物的微生物和方法”，公开了一种产生大麻素及其衍生物的基因修饰的宿主细胞以及具体多肽序列，该申请是利用多肽和编码所述多肽的核酸序列修饰宿主细胞，但是对于具体的构建方法和生产大麻素及其衍生物的过程并未详细地披露。
发明内容
本发明的目的，旨在提供一种产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，通过优化酵母菌株实现生物合成大麻二酚的目的；
本发明的另一个目的，旨在提供上述产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株的一种构建方法，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标；
本发明还有一个目的，旨在提供上述产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株的一种应用，以缓解当前应用市场上面临的大麻二酚资源有限导致的缺口较大的问题。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种产大麻二酚的重组酿酒酵母，它于2021年3月19日,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏编号为CGMCC No.22040，拉丁文名称是Saccharomyces cerevisiae。
作为一种限定，所述的产大麻二酚的重组酿酒酵母表达大麻二酚合成途径中的AAE1、CsPT4、OAC、OLS、CBDAS，并且所述的产大麻二酚的重组酿酒酵母异源表达tHMGR，及多拷贝表达AAE1与CBDAS基因。
作为另一种限定，所述CsPT4基因是密码子优化，且所述密码子优化的 CsPT4序列如下：
AAGCTTATGGGTTTGTCCCTAGTATGCACCTTCTCTTTCCAAACTAACTACCACACTTTGCTAA ACCCTCACAACAAGAACCCAAAGAACTCTTTATTGTCTTACCAACACCCAAAGACTCCAATTATAAAA TCTTCCTACGATAACTTCCCATCTAAGTACTGTTTGACAAAGAATTTCCATTTGTTGGGTTTGAACTC CCACAACAGAATCTCTTCTCAATCCCGTTCCATCAGAGCTGGTTCCGACCAAATCGAAGGTTCTCCAC ATCACGAATCTGACAACAGTATTGCCACCAAAATCTTAAATTTCGGTCACACTTGTTGGAAATTGCAA AGACCATACGTTGTCAAGGGTATGATCTCTATTGCTTGTGGTTTGTTCGGTAGAGAATTATTCAACAA CAGACACTTGTTTTCTTGGGGTTTGATGTGGAAGGCTTTCTTTGCTTTGGTCCCAATCTTGTCTTTCA ACTTCTTCGCCGCTATCATGAACCAAATCTACGATGTTGACATTGACAGAATCAACAAGCCAGACTTG CCATTGGTTTCTGGTGAAATGTCTATTGAAACTGCTTGGATTCTTTCAATTATCGTTGCTTTGACCGG TTTGATTGTCACCATCAAGTTGAAGTCTGCCCCATTATTTGTCTTCATTTACATTTTCGGTATATTTG CCGGTTTCGCTTACTCTGTTCCACCAATCAGATGGAAGCAATACCCATTCACCAACTTCTTGATCACT ATTTCATCTCACGTTGGTTTAGCCTTCACTTCTTATTCCGCTACCACCTCTGCTTTAGGTCTGCCTTT CGTCTGGAGACCAGCTTTCTCCTTCATTATTGCTTTCATGACTGTTATGGGTATGACCATCGCTTTCG CCAAGGATATCAGTGACATTGAAGGTGATGCTAAGTACGGTGTCTCCACCGTCGCTACTAAGTTAGGT GCTAGAAACATGACTTTCGTTGTTTCTGGCGTTTTGTTGTTGAATTACTTGGTTTCCATCTCCATTGG TATCATCTGGCCACAAGTTTTTAAGTCCAACATTATGATTTTGTCCCATGCCATCTTGGCTTTCTGTT TGATTTTCCAAACCCGTGAATTGGCTTTGGCCAACTATGCTTCTGCTCCATCCAGACAATTCTTCGAA TTCATCTGGTTATTGTACTACGCTGAATACTTCGTCTACGTCTTTATCCTCGAG。
本发明还提供了上述一种产大麻二酚的重组酿酒酵母的构建方法，包括依次进行的以下步骤：
a)从工业大麻植物中获得参与大麻二酚合成途径的AAE1、OLS、OAC、CBDAS 基因，同时合成酿酒酵母密码子偏好性CsPT4基因；
b)将步骤a)中获得的AAE1、OLS、OAC、CBDAS、CsPT4基因片段分别构建Ptef1-AAE1-Tpgk1，PTEF2-OLS-TCYC1，PPGK1-OAC-Tadh1，PTDH3-CBDAS-TCYC1，PTDH3-PT4-Ttdh3基因表达簇，将上述五个基因表达簇整合至酵母菌染色体Cen.pk2-1D的 Delta位点；
c)将实验室保存的tHMGR以及AAE1、CBDAS基因片段分别构建 PGAL10-tHMGR-Tadh1，PGAL1-AAE1-TCYC1，PGAL1-CBDAS-Tcyc1基因表达簇，将上述三个基因表达簇整合至酵母菌染色体Cen.pk2-1D的GAL80位点，获得重组酵母D-1；
d)将重组酵母D-1进行醋酸锂法转化处理，得产大麻二酚酵母菌株D-1-1，即所述的产大麻二酚的重组酿酒酵母。
本发明还提供了上述一种产大麻二酚的重组酿酒酵母的应用，所述产大麻二酚的重组酿酒酵母通过发酵的方式生产大麻二酚。
作为一种限定，所述发酵的条件为pH＝4-6，温度为30℃，用于发酵的培养基由20-30g/L的葡萄糖、15-25g/L的胰蛋白胨、5-15g/L的酵母粉组成。
作为另一种限定，所述培养基中葡萄糖耗尽后，采用半乳糖补料发酵。
作为第三种限定，所述半乳糖补料方式为每隔24h流加半乳糖，使得半乳糖的浓度为20-30g/L，同时向培养基中添加1mM的己酸。
在本发明中:
产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，于2021年3月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.22040；其分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供一种产大麻二酚的酿酒酵母菌株的构建方法和应用，该产大麻二酚的酿酒酵母菌株通过无缝克隆技术构建各功能基因质粒，并通过酵母醋酸锂转化法将基因表达盒整合至酵母染色体；本发明提供的产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，是通过优化酵母菌株而合成的，其应用能够实现生物合成大麻二酚。
本发明的构建方法可以简便、快速、有效、精准地构建产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株；本发明构建的产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，可以缓解当前应用市场上面临的大麻二酚资源有限导致的缺口较大的问题。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为整合构建的基因表达盒组合及整合位点示意图，其中图1a和图1b 分别表示实施例3和实施例4中所构建的基因表达簇的整合顺序；
图2为酵母阳性菌株电泳图；
图3为酵母菌株D-1产物GC-MS图，其中1为产物OA的示意图，2为产物 CBD的示意图，3为产物CBDA的示意图，4为产物CBGA的示意图；
图4为酵母菌株D-1产大麻二酚产量图。
具体实施方式
下面将结合实施例作进一步详细说明。
应当理解实施例是出于说明本发明各种实施方式的目的给出的，并非以任何方式限制本发明。下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实施例中所提到的基因，如无特殊说明，均为基因的完整编码框区。均可以从NCBI获得，所提到的启动子和终止子序列也可以从NCBI 下载获得，具体序列起始位置可根据引物表中的引物获悉。
实施例1大麻二酚合成所需基因以及模块化调控中酵母自身基因元件的获得
以新鲜工业大麻为材料，采用本领域公知的方法，提取RNA，反转录得到 cDNA。根据本领域的常规方法，设计AAE1、CsPT4、OAC、OLS、CBDAS基因的引物，扩增上述片断，以酿酒酵母CEN.PK2-1D的基因组为模板，设计tHMG基因片段的引物，扩增酵母中tHMG基因片段。
实施例2大麻二酚合成所需基因以及模块化调控中酵母自身基因元件构成表达簇的获得
具体地表达簇是指启动子+基因片段序列+终止子。进一步表达簇的构建分为两个步骤：首先将酵母常用的组成型启动子和终止子序列扩增出来，这里扩增的启动子包括TEF1、TDH3、PGK1、TEF2、GAL1、GAL10，终止子包括CYC1、ADH1、pgk1，扩增上述启动子和终止子序列所用的引物见表1。将扩增的启动子序列和终止子序列以启动子-功能基因-终止子的顺序连接到克隆载体 puc19L上构建pUC19L-Ptef1-AAE1-Tpgk1、pUC19L-PTDH3-PT4-Ttdh3、pUC19L-PPGK1-OAC-Tadh1、pUC19L-PTDH3-CBDAS-TCYC1、pUC19L-PTEF2-OLS-TCYC1载体，启动子和终止子序列的连接采用无缝连接的方式进行。
将实施例1中扩增的基因通过无缝连接的方式将基因片段连接到启动子和终止子中间，构建了相应基因的表达簇，具体为pTEF1-AAE1-tpgk1、 pTDH3-PT4-tTdh3、pPGK1-OAC-tAdh1、pTDH3-CBDAS-tCYC1、pTEF2-OLS-tCYC1，这些基因表达簇通过无缝连接的方式连接到启动子和终止子之间。
表1整合构建质粒所用引物
实施例3在产大麻二酚的重组酿酒酵母中创建大麻二酚的合成途径
将Ptef1-AAE1-Tpgk1、PTDH3-PT4-Ttdh3、PPGK1-OAC-Tadh1、 PTDH3-CBDAS-TCYC1和PTEF2-OLS-TCYC1这五个基因表达簇以同源重组的形式整合到整合到酵母染色体的Delta位点，进行PCR检测阳性克隆，检测阳性克隆菌株产大麻二酚的能力，得到产大麻二酚最高的酵母菌株命名D-1。其中，外源基因表达簇片段整合的顺序如图1a所示。
实施例4获得产大麻二酚的重组酿酒酵母
对CsPT4进行密码子优化，密码子优化的CsPT4的序列为：
AAGCTTATGGGTTTGTCCCTAGTATGCACCTTCTCTTTCCAAACTAACTACCACACTTTGCTAA ACCCTCACAACAAGAACCCAAAGAACTCTTTATTGTCTTACCAACACCCAAAGACTCCAATTATAAAA TCTTCCTACGATAACTTCCCATCTAAGTACTGTTTGACAAAGAATTTCCATTTGTTGGGTTTGAACTC CCACAACAGAATCTCTTCTCAATCCCGTTCCATCAGAGCTGGTTCCGACCAAATCGAAGGTTCTCCAC ATCACGAATCTGACAACAGTATTGCCACCAAAATCTTAAATTTCGGTCACACTTGTTGGAAATTGCAA AGACCATACGTTGTCAAGGGTATGATCTCTATTGCTTGTGGTTTGTTCGGTAGAGAATTATTCAACAA CAGACACTTGTTTTCTTGGGGTTTGATGTGGAAGGCTTTCTTTGCTTTGGTCCCAATCTTGTCTTTCA ACTTCTTCGCCGCTATCATGAACCAAATCTACGATGTTGACATTGACAGAATCAACAAGCCAGACTTG CCATTGGTTTCTGGTGAAATGTCTATTGAAACTGCTTGGATTCTTTCAATTATCGTTGCTTTGACCGG TTTGATTGTCACCATCAAGTTGAAGTCTGCCCCATTATTTGTCTTCATTTACATTTTCGGTATATTTG CCGGTTTCGCTTACTCTGTTCCACCAATCAGATGGAAGCAATACCCATTCACCAACTTCTTGATCACT ATTTCATCTCACGTTGGTTTAGCCTTCACTTCTTATTCCGCTACCACCTCTGCTTTAGGTCTGCCTTT CGTCTGGAGACCAGCTTTCTCCTTCATTATTGCTTTCATGACTGTTATGGGTATGACCATCGCTTTCG CCAAGGATATCAGTGACATTGAAGGTGATGCTAAGTACGGTGTCTCCACCGTCGCTACTAAGTTAGGT GCTAGAAACATGACTTTCGTTGTTTCTGGCGTTTTGTTGTTGAATTACTTGGTTTCCATCTCCATTGG TATCATCTGGCCACAAGTTTTTAAGTCCAACATTATGATTTTGTCCCATGCCATCTTGGCTTTCTGTT TGATTTTCCAAACCCGTGAATTGGCTTTGGCCAACTATGCTTCTGCTCCATCCAGACAATTCTTCGAA TTCATCTGGTTATTGTACTACGCTGAATACTTCGTCTACGTCTTTATCCTCGAG。
连接启动子和终止子形成表达簇GAL1-CBDA-CYC1、GAL10-tHMGr-ADH1、 GAL1-AAE1-CYC1,将以上基因表达簇以同源重组形式整合到酵母染色 Cen.pk2-1D体的GAL80位点，PCR检测阳性克隆，检测阳性克隆菌株产大麻二酚的能力，得到产大麻二酚最高的酵母菌株命名D-1-1，即所述的产大麻二酚的重组酿酒酵母。其中，外源基因表达簇片段整合的顺序如图1b所示。第一次整合构建菌株过程如表2所示。
表2第一次整合构建菌株
实施例5产大麻二酚的重组酿酒酵母通过发酵产大麻二酚
通过酿酒酵母醋酸锂转化法制备感受态并转化，详细步骤如下：
S1.D-1菌种划线(SD-Ura固体培养基)，在30℃条件下恒温培养36h，待单克隆长出,得单克隆菌株A；
S2.挑单克隆菌株A接种于5mLSD-Ura液体培养基中(15mL摇菌管)，于30℃恒温培养摇床中200rpm培养16h，得培养菌液B；
S3.取2mL培养菌液B接种于100mL新鲜SD-Ura培养基中，于30℃、 200rpm的恒温培养摇床中培养至OD600值达到1,得培养菌液C；
S4.将培养菌液C转移至50mL无菌离心管中，3000r·min-1离心5min，去上清，收集得菌体D；
S5.将菌体D重悬于10mL无菌水中，3000r·min-1离心5min，去上清，洗涤菌体，得菌体E；
S6.将菌体E转移至1.5mL的无菌离心管中，3000r·min-1离心2min，去上清，收集得菌体F；
S7.将菌体F重悬于1mL的100mmol·L-1LiAc中，13000r·min-1离心15 s，去上清，收集得菌体G；
S8.将菌体G重悬于400μL的100mmol·L-1LiAc中，得感受态细胞液H；
S9.将鲑鱼精子(ssDNA)放置于99℃干式恒温器加热10min变性后置于4℃，备用；
S10.取50μL的感受态细胞液H于13000r·min-1离心机中离心15s，去上清，依次加入：240μL的50％PEG3350、36μL的1mol·L-1LiAc和5μL的 10mg·mL-1变性ssDNA，用移液枪吹打混匀后，放置于30℃条件下保温30 min、42℃水浴25min，置于4℃2min，得混合溶液I；
S11.将混合溶液I于3000r·min-1离心机中离心2min，去上清，重悬于 800μL的YPD液体培养基中，在30℃、200r·min-1条件下振荡培养2h 后，于3000r·min-1离心2min，去上清，重悬于800μL无菌水中洗涤，再同条件离心弃上清，得菌液J；
S12.取100μL的菌液J涂布到SD-Leu-Ura固体培养基上，放入30℃恒温培养箱培2～3天，得产大麻二酚酵母菌株D-1-1。
通过以上步骤，获得产大麻二酚酵母菌株D-1-1，进一步对其发酵条件进行优化，具体的发酵条件为pH＝5,温度为30℃，培养基的组成为20g/L葡萄糖、 10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉；
待葡萄糖耗尽后，采用半乳糖补料发酵策略，每隔24h流加半乳糖使得半乳糖的浓度为20g/L；最终通过GCMS检测，摇瓶发酵产大麻二酚浓度达4.01 μg/L。
实施例6产大麻二酚的重组酿酒酵母细胞产大麻二酚及中间代谢物的样品及检测处理方法
样品处理：取10ml的产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，8000rmp离心5min 弃上清，加入纯水清洗2次，8000rmp离心10min弃上清，加入1mL的细胞破碎液(0.32M硫酸),使用沸水煮10min，取出放置室温；加入5mL乙酸乙酯，旋涡震荡5min，超声30min，12000rmp离心10min收集上清液，重复提取2 次。将收集的上清液行氮吹蒸干，加2mL甲醇复溶，过0.22μm滤膜备用。取 100ul过膜后液体加入内衬管进行氮吹吹干，加入N-甲基-N-三甲基硅三氟乙酰胺，80℃衍生化处理30min，上机检测。
样品检测：仪器：Agilent 7890GC-7000C-MS气相色谱-质谱仪。
色谱条件：色谱柱：Agilent HP-5石英毛细柱(30m×250μm×0.25μm)；升温程序：起始温度120℃,保持1min，以4℃/min升至160℃,然后以10℃ /min升至280℃,保持10min；进样口温度280℃；检测接口温度300℃；载气(He)恒压模式，压力17.5psi，进样量2μL；不分流。
质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量40eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；质谱MRM模式，溶剂延迟时间10min。
数据采集模式：MRM模式。
酵母菌株D-1的各产物GC-MS示意图见图3，其中1为产物OA的示意图， 2为产物CBD的示意图，3为产物CBDA的示意图，4为产物CBGA的示意图；
本实施例具体的定性离子结果见表3：
表3 MRM采集离子参数及结果
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江寿仙谷医药股份有限公司
浙江寿仙谷植物药研究院有限公司
<120> 产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用
<130> 20210707
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1206
<212> DNA
<213> 大麻（ Cannabis sativa L）
<400> 1
aagcttatgg gtttgtccct agtatgcacc ttctctttcc aaactaacta ccacactttg 60
ctaaaccctc acaacaagaa cccaaagaac tctttattgt cttaccaaca cccaaagact 120
ccaattataa aatcttccta cgataacttc ccatctaagt actgtttgac aaagaatttc 180
catttgttgg gtttgaactc ccacaacaga atctcttctc aatcccgttc catcagagct 240
ggttccgacc aaatcgaagg ttctccacat cacgaatctg acaacagtat tgccaccaaa 300
atcttaaatt tcggtcacac ttgttggaaa ttgcaaagac catacgttgt caagggtatg 360
atctctattg cttgtggttt gttcggtaga gaattattca acaacagaca cttgttttct 420
tggggtttga tgtggaaggc tttctttgct ttggtcccaa tcttgtcttt caacttcttc 480
gccgctatca tgaaccaaat ctacgatgtt gacattgaca gaatcaacaa gccagacttg 540
ccattggttt ctggtgaaat gtctattgaa actgcttgga ttctttcaat tatcgttgct 600
ttgaccggtt tgattgtcac catcaagttg aagtctgccc cattatttgt cttcatttac 660
attttcggta tatttgccgg tttcgcttac tctgttccac caatcagatg gaagcaatac 720
ccattcacca acttcttgat cactatttca tctcacgttg gtttagcctt cacttcttat 780
tccgctacca cctctgcttt aggtctgcct ttcgtctgga gaccagcttt ctccttcatt 840
attgctttca tgactgttat gggtatgacc atcgctttcg ccaaggatat cagtgacatt 900
gaaggtgatg ctaagtacgg tgtctccacc gtcgctacta agttaggtgc tagaaacatg 960
actttcgttg tttctggcgt tttgttgttg aattacttgg tttccatctc cattggtatc 1020
atctggccac aagtttttaa gtccaacatt atgattttgt cccatgccat cttggctttc 1080
tgtttgattt tccaaacccg tgaattggct ttggccaact atgcttctgc tccatccaga 1140
caattcttcg aattcatctg gttattgtac tacgctgaat acttcgtcta cgtctttatc 1200
ctcgag 1206
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种产beta-丙氨酸酵母菌及其构建方法