阅读说明：本技术 一种体外诱导神经细胞生长的生物支架及其制备方法与应用 (Biological scaffold for inducing growth of nerve cells in vitro and preparation method and application thereof ) 是由 夏宏燕 杨涵 陈廷阔 谢康 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及细胞培养技术领域,尤其涉及一种体外诱导神经细胞生长的生物支架及其制备方法与应用。本发明公开了一种体外诱导神经细胞生长的生物支架的制备方法,该制备方法依次采用多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行包被,提高神经细胞神经细胞的存活率。该制备方法制得的生物支架可以给神经细胞进行精确的方向性指导,有利于神经细胞的附着,进一步提高神经细胞的存活率。另外,该生物支架处理过程中未加入有机溶剂,避免有机溶剂给细胞造成伤害,而且所用的材料均有生物相容和生物降解特性。(The invention relates to the technical field of cell culture, in particular to a biological scaffold for in-vitro induction of nerve cell growth and a preparation method and application thereof. The invention discloses a preparation method of a biological scaffold for inducing the growth of nerve cells in vitro, which sequentially adopts polylysine solution and laminin solution for coating and improves the survival rate of nerve cells of the nerve cells. The biological scaffold prepared by the preparation method can provide accurate directional guidance for nerve cells, is beneficial to the attachment of the nerve cells, and further improves the survival rate of the nerve cells. In addition, no organic solvent is added in the biological scaffold treatment process, so that the damage of the organic solvent to cells is avoided, and the used materials have biocompatibility and biodegradation characteristics.)

一种体外诱导神经细胞生长的生物支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种体外诱导神经细胞生长的生物支架及其制备方法与应用。

背景技术

国内外诸多课题组都对三维生物支架诱导细胞进行了报道，结果表明生物支架的纤维直径、晶格孔径、排列方向和角度都对细胞的增殖、附着和生长方向有着显著的影响。

目前，采用三维生物支架培养的神经细胞还存在着存活率较低的问题。

发明内容

本发明提供了一种体外诱导神经细胞生长的生物支架及其制备方法与应用，解决了目前三维生物支架培养的神经细胞存活率较低的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种体外诱导神经细胞生长的生物支架的制备方法，包括以下步骤：

将三维生物支架依次采用多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行包被，得到体外诱导神经细胞生长的生物支架。

本发明依次采用多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行包被，可以提高神经细胞的存活率，该制备方法制得的生物支架可以给神经细胞进行精确的方向性指导，有利于神经细胞的附着，进一步提高神经细胞的存活率。另外，该生物支架处理过程中未加入有机溶剂，避免有机溶剂给细胞造成伤害，而且所用的材料均有生物相容和生物降解特性。

本发明中，三维生物支架的主体材料优选为聚己内酯，所述聚己内酯的分子量为50000。

本发明中，三维生物支架优选以聚己内酯为主体材料，采用近场纺丝装置制得。聚己内酯具有生物相容性和生物降解特性。近场纺丝为物理加热，且制备出的微纳米级纤维具有高空隙率、高面容比和超长连续特性，其制得的三维生物支架与体内细胞外基质的形态类似。采用近场纺丝装置制备三维生物支架的方法为现有技术，此处对三维生物支架的方法不做赘述。

本发明中，三维生物支架的纤维直径为10-20μm，纤维间隔均为100μm。该生物支架的纤维具有较好的均匀性、连续性和方向性。

本发明中，所述多聚赖氨酸溶液中的多聚赖氨酸与所述层粘连蛋白溶液中的层粘边蛋白的质量比为(0.8-4)：1，优选为(1-4)：1，更优选为1.6：1。

本发明中，所述多聚赖氨酸溶液的质量浓度为40-100μg/ml，优选为40μg/ml。多聚赖氨酸低于40μg/ml包被效果下降。

所述层粘连蛋白溶液的质量浓度为25-50μg/ml，优选为25μg/ml。层粘连蛋白低于25μg/ml包被效果下降。。

本发明中，所述多聚赖氨酸溶液包被的时间为2-4h，优选在37℃下包被2h。如果多聚赖氨酸溶液包被时间低于2小时，会造成包被液包被不完整，较少细胞与支架的相互作用效率。

所述层粘连蛋白溶液包被的时间为2-4h，优选在37℃下包被2h。如果层粘连蛋白溶液包被时间低于2小时，会造成包被液包被不完整，较少细胞与支架的相互作用效率。

本发明中，所述多聚赖氨酸溶液和所述层粘连蛋白溶液包被后，均需采用平衡盐溶液进行清洗，除去多余的多聚赖氨酸和层粘连蛋白，以免对细胞生长造成干扰。

本发明还提供了上述制备方法制得的体外诱导神经细胞生长的生物支架。该生物支架可以为神经细胞在体外生长提供良好的机械支撑和生存环境，对神经细胞方向性生长提供指导。

本发明还提供了上述体外诱导神经细胞生长的生物支架在体外诱导神经细胞生长中的应用，包括以下步骤：

将神经细胞接种于所述体外诱导神经细胞生长的生物支架上，然后加入培养基进行培养；

所述神经细胞为肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞。

本发明中，所述培养基优选为10％胎牛血清，所述神经细胞的接种量为40～80万个，优选为40万个。

本发明还提供了上述体外诱导神经细胞生长的生物支架在制备治疗脑中风受损神经细胞药物中的应用，将生物支架移植到体内神经细胞受损区域，使其恢复正常功能。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种体外诱导神经细胞生长的生物支架的制备方法，包括以下步骤：将三维生物支架依次采用多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行包被，得到体外诱导神经细胞生长的生物支架。

本发明依次采用多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行包被可以提高神经细胞的存活率。该制备方法制得的生物支架可以给神经细胞进行精确的方向性指导，有利于神经细胞的附着，进一步提高神经细胞的存活率。另外，该生物支架处理过程中未加入有机溶剂，避免有机溶剂给细胞造成伤害，而且所用的材料均有生物相容和生物降解特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的体外诱导神经细胞生长的生物支架的制备及体外诱导神经细胞生长的流程图；

图2为本发明实施例1提供的体外诱导神经细胞生长的生物支架显微电镜图；

图3为本发明实施例1和对比例1PC12细胞培养48h后的效果图，其中，(a)为对比例1PC12细胞培养48h后的效果图，(b)为实施例1PC12细胞培养48h后的效果图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中近场纺丝装置(QZNT-M08，佛山轻子精密测控技术有限公司)。

本发明实施例中肾上腺嗜铬细胞瘤PC12来源于暨南大学药学院。

实施例1

采用近场纺丝装置将聚己内酯PCL纤维沉积在设计运动轨迹上。如图1所示，该装置主要由接收运动台、气动系统、高压电源和加热系统四部分组成。其具体步骤如下：

(1)三维生物支架的制备：将适量的聚己内酯置于该设备的针筒中。其后对该设备的若干参数进行设置：高压电源电压为2.5kv，阵痛内气压为2kPa，喷嘴与接收板距离为1.5mm，针筒内温度为110℃，接收板运行速度为20mm/s，纤维间距为100μm，最后制备出三维生物支架。

如图2所示，该生物支架的纤维直径约为10-20μm，纤维间隔均为100μm。该支架的纤维具有较好的均匀性、连续性和方向性，并且支架拥有一种多层的、可扩展的、模块化的和高度组织化的方格结构，为神经细胞在体外生长提供良好的机械支撑和生存环境。

(2)对三维生物支架的表面进行处理(体外诱导神经细胞生长的生物支架的制备)：将步骤(1)制得的三维生物支架喷过量75％酒精后放进生物操作平台，然后紫外线照射15分钟，除去三维生物支架上的杂质并杀菌，然后将三维生物支架整体浸在1ml浓度为40μg/ml的多聚赖氨酸溶液中，在37℃下静置2小时。接着，用平衡盐溶液(HBSS)对支架进行清洗，再将支架浸入到1ml浓度为25μg/ml层粘连蛋白溶液中，37℃下静置2小时后，再次用HBSS完成清洗。

(3)接种肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞：将步骤(2)进行表面处理后的三维生物支架置于六孔板。其后把40万个PC12细胞接种到生物支架上，然后再加入含10％胎牛血清的培养基培养PC12在。最后将六孔板置于37℃、5％CO₂湿化的环境中孵育48h。

对比例1

接种PC12细胞：将实施例1步骤(1)制得的三维生物支架置于六孔板。其后把40万个PC12细胞接种到生物支架上，然后再加入含10％胎牛血清的培养基培养PC12细胞。最后将六孔板置于37℃、5％CO₂湿化的环境中孵育48h。

图3为本发明实施例1和对比例1PC12细胞培养48h后的效果图，其中，图3a和3b分别对应对比例1和实施例1。如图3所示，相对于实施例1(图3b)来说，对比例1(图3a)明显细胞存活率更低，未进行多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液的生物支架不适合神经细胞的生存、生长，得出包被多聚赖氨酸和层粘连蛋白溶液给神经细胞提供了一个适宜生长的生活环境。因此，实施例1经多聚赖氨酸溶液和层粘连蛋白溶液进行表面处理的生物支架培养神经细胞取得的效果最佳。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。