阅读说明：本技术 对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素 (Bacteriocin with bacteriostatic activity against various pathogenic bacteria ) 是由 信丙越 李峰 刘舒 曾化伟 曾昕 王光利 张标 徐大勇 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素bacicyclicin XIN-1,是一种新型环状细菌素,分子量为5848.2032 Da,其前体肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述细菌素bacicyclicin XIN-1产自相山芽胞杆菌XIN-1,对多种病原菌如蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等具有高效抑菌活性。(The invention discloses a bacteriocin XIN-1 with bacteriostatic activity to various pathogenic bacteria, which is a novel annular bacteriocin with molecular weight of 5848.2032Da, and the nucleotide sequence of a precursor peptide is shown as SEQ ID NO:1, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2, respectively. The bacteriocin bacicicin XIN-1 is produced from Bacillus faciopneumoniae XIN-1, and has high-efficiency antibacterial activity on various pathogenic bacteria such as Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and the like.)

对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素bacicyclicin XIN-1。

背景技术

随着人们对食品安全和自身健康的重视，传统保鲜技术如化学防腐剂因对血压、心脏、肾脏等会造成不良影响，甚至有些具有诱癌性、致畸性等问题已经不能满足人们的需要，而寻找天然、安全的食品防腐剂成为食品行业的一个研究热点。

细菌素是由细菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽类物质。细菌素本身具有很多优良特性：体内、体外的高抑菌活性；对人体或动物无毒，且易被动物消化道中的一些蛋白酶所降解；有很好的选择性杀菌效果；易于生物改造，满足人们不同的需求；具有热稳定性及耐酸碱能力，便于贮藏；本身无味，使用时不会影响食品、饲料的口感、味道等等(Cotter et al.,2013)。因此，细菌素在食品、饲料、医药等行业都有着广泛的应用价值和广阔的应用前景。

芽胞杆菌是一类广泛分布于多种生态环境中的、可形成芽胞的革兰氏阳性细菌。目前研究发现芽胞杆菌(Bacillus)可以产生多种多样的细菌素，如在人体粪便样本中分离到的一株苏云金芽胞杆菌产生的细菌素Thuricin CD可专一性抑制艰难梭菌，且在人体结肠模型下不会引起肠道菌群的失调，未来极有可能成为人类对抗艰难梭菌感染的新型药物(Rea et al., 2010)。另外本课题组也在苏云金芽胞杆菌BMB3201中鉴定了3种新型羊毛硫细菌素Ticin A1、 Ticin A3及Ticin A4，它们对食源性病原菌蜡样芽胞杆菌，单核细胞增生李斯特菌具有高效抑菌活性，且具有极强的耐热、酸碱特性，具有作为新型食品防腐剂的应用潜力(Xin et al.,2015)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素 bacicyclicin XIN-1。本发明提供的细菌素bacicyclicin XIN-1对多种病原细菌具有高效抑菌活性。

本发明对多种病原菌具有抑菌活性的细菌素bacicyclicin XIN-1，是一种新型的环状细菌素，分子量为5848.2032Da(用单一同位素测定)。

本发明细菌素bacicyclicin XIN-1的前体肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

序列表SEQ ID NO:1是bacicyclicin XIN-1的前体肽的核苷酸的序列，共195个核苷酸组成。

序列表SEQ ID NO:2是bacicyclicin XIN-1的前体肽的氨基酸的序列，共编码64个蛋白质。

本发明细菌素bacicyclicin XIN-1产自相山芽胞杆菌XIN-1，所述相山芽胞杆菌XIN-1的分类命名为：Bacillus xiangshan XIN-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2020年4月2日，保藏编号：CCTCC NO：M2020064。

本发明通过抑菌活性筛选确定相山芽胞杆菌XIN-1(Bacillus xiangshanXIN-1)菌株可产生对多种病原菌(如蜡样芽胞杆菌ATCC14579，单核细胞增生李斯特菌ATCC19115，金黄色葡萄球菌ATCC29523)具有抑菌活性的物质。经提取相山芽胞杆菌XIN-1菌株产生的抑菌活性物质为一新型的环状细菌素，该细菌素类物质被命名为bacicyclicin XIN-1。bacicyclicin XIN-1 对多种革兰氏阳性病原细菌(如蜡样芽胞杆菌，单核细胞增生李斯特菌，金黄色葡萄球菌等) 具有抑菌活性。

附图说明

图1：相山芽胞杆菌XIN-1菌株的不同生长时期的发酵上清对蜡样芽胞杆菌ATCC14579，单核细胞增生李斯特菌ATCC19115及金黄色葡萄球菌ATCC29523的抑菌活性检测结果。

图2：相山芽胞杆菌XIN-1菌株产生的细菌素-bacicyclicin XIN-1的HPLC分析及质谱分析结果。

图3：bacicyclicin XIN-1的合成基因簇和前体肽序列的对比分析。附图标记说明：图3中的A图是bacicyclicin XIN-1的合成基因簇，图3中的B图是bacicyclicin XIN-1的合成基因簇中每个基因的功能分析；图3中的C图是bacicyclicin XIN-1的前体肽序列与已报道的环状细菌素前体肽的比对分析。

图4：bacicyclicin XIN-1的结构。

具体实施方式

实施例1：

1、相山芽胞杆菌XIN-1菌株抑菌活性的检测

挑取相山芽胞杆菌XIN-1的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中于30℃过夜活化。将1mL 的培养物转移至100mL的LB液体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L，pH7.0，121℃灭菌30min)中，在220rpm/min，30℃下培养30h。从接种起每隔2h在超净台中取1mL培养液，连续取样12次。培养液经12000rpm/min，5min离心后将上清液转移至新的离心管，并测定发酵上清对指示菌的抑菌活性。利用琼脂扩散法检测发酵上清的抑菌活性(Cintas et al.,1995)。在未凝固的琼脂培养基中加入适量的指示菌(细菌个数约为 5×10⁵cfu/mL)，混匀，倒平板。选取蜡样芽胞杆菌ATCC14579、单核细胞增生李斯特菌 ATCC19115及金黄色葡萄球菌ATCC29523(以上3株菌均购买自美国菌种保藏中心)为指示菌。待其凝固后用孔径为6mm的打孔器打孔。每孔中加入约50μL样品后将平板先放置于4℃，2h 左右，让待测样品充分扩散，而后放置于28℃下培养12h，观察抑菌效果(观察有无透明的抑菌圈出现)。如附图1所示，相山芽胞杆菌XIN-1在6-14h的发酵上清对三种指示菌具有明显的抑菌活性。

2、相山芽胞杆菌XIN-1分泌的细菌素(bacicyclicin XIN-1)的鉴定

(1)相山芽胞杆菌XIN-1菌株的全基因组测序及抑菌活性物质的预测和分析

将相山芽胞杆菌XIN-1菌株送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序(通过Illuminate Hiseq2500测序仪完成)。测序使用双端测序，测序读长为125bp，测序数量为1G。最终测序数据经基因组拼接软件PGCGAP完成XIN-1的基因组拼接工作。

XIN-1菌株抑菌活性物质合成基因簇的预测分析由在线分析软件Antismath 3.0及Bagel 3.0 完成。如附图3中的A图所示，XIN-1菌株基因组中有一完整的环状细菌素合成基因组。该基因簇中细菌素前体肽序为：

MLFELTGIGIGSGTAATIVNWIMWGMSAATILSLISGVASGGAWILAGAREALKAGGKKAAI AW。

该前体肽序列通过BlastP分析，其与已鉴定的环状细菌素的氨基酸序列同源性均低于 36％，说明其为一新型的环状细菌素。而该基因簇分泌的产物申请人命名为bacicyclicin XIN-1。

(2)相山芽胞杆菌XIN-1菌株分泌的细菌素-bacicyclicin XIN-1的制备

挑取XIN-1菌株的单菌落于5mL LB液体培养基过夜活化。按1％(V/V)接种量转接至10瓶 200mL LB培养液中，28℃，220r/min培养8h；将发酵液离心(12,000r/min,10min)，并将获得的2L上清用200g的大孔吸附树脂安博莱特(Amberlite)XAD-7HP过柱吸附；吸附后的柱料首先用1L ddH₂O冲洗，再用0.5L 30％的乙醇溶液冲洗，最后用0.5L、80％的乙醇(pH2.0)将活性物质洗脱下来；洗脱液于40℃下通过旋转蒸发仪浓缩(注意浓缩过程中调节旋液pH，保持pH 6.0左右)，旋干至5mL左右后收集并做冻干处理；获得的干粉溶于50％乙腈(pH 5.0)，离心(12,000r/min,，10min)，所获得的上清即为抑菌物质粗提液；

(3)bacicyclicin XIN-1纯品的制备

获得抑菌物质粗体液采用高压液相色谱仪DionexUltimate3000system分析：

主要技术参数：

色谱柱：Agilent C18反相柱(250mm×4.6mm，5μL)；

流动相：ddH₂O(0.1％TFA)和乙腈；

流动相条件：0-20min，10％-90％乙腈梯度洗脱；

检测波长：220nm

流速：1mL/min

将20min内洗脱的流液分段收集(1min一次，收集20次)，用琼脂扩散法检测收集液的抑菌活性，判断出抑菌物质保留时间。当抑菌物质保留时间确定后，反复收集多次，旋干、冻干处理，获得的粉末称重，并溶于20％乙腈(pH 5.0)，并在相同流动相条件下检测其纯度。

(4)bacicyclicin XIN-1的一级质谱分析

将以上制备的抑菌物质纯品于质谱仪Agilent Technologies 6540UDHAccurate-Mass Q-TOF LC/MS测定其分子量。

一级质谱分析条件：

毛细管电压：3,500V；

喷雾压力：35lb/in2 gauge；

干燥气流速：9liters/min；

温度：350℃；

Q-TOF扫描范围：100-3,000m/z；

数据采集速率：1spectrum/s。

如图3所示，XIN-1分泌的活性物质在分子量为5848.2032Da(单一同位素峰)。而当预测的环肽前体肽 MLFELTGIGIGSGTAATIVNWIMWGMSAATILSLISGVASGGAWILAGAREALKAGGKKAAI AW在剪切掉前导肽MLFE后剩余氨基酸序列 LTGIGIGSGTAATIVNWIMWGMSAATILSLISGVASGGAWILAGAREALKAGGKKAAIAW经氨基端和羧基端发生环化反应后生成的成熟肽，分子量为5848.1792Da(用单一同位素峰测试)。而该分子量与XIN-1分泌的活性物质在分子量为5848.2032Da几乎是吻合的，这证明XIN-1 分泌的活性物质即为bacicyclicin XIN-1。

(5)bacicyclicin XIN-1酶解后的多肽片段的一级质谱分析

为进一步证明XIN-1分泌的活性物质即为bacicyclicin XIN-1，我们将XIN-1分泌的活性物质进行了胰蛋白酶处理，并得到的酶解片段进行了质谱分析。具体操作如下：将上述制备的活性物质纯品(约0.4mg)溶于0.1mL 100mM碳酸氢铵缓冲液中，胰蛋白酶(0.01mg)溶于 0.1mL100mM碳酸氢铵缓冲液，两者混合后置于37℃处理12h。处理后的样品再经的质谱分析。最终获得多肽片段有EALK，AGGK， AAIAWLTGIGIGSGTAATIVNWIMWGMSAATILSLISGVASGGAWILAGAR(见表1)。这三个片段均为bacicyclicin XIN-1内存在的多肽片段，这进一步证实了XIN-1分泌的活性物质即为 bacicyclicin XIN-1。

表1 XIN-1分泌的活性物质经胰蛋白酶处理后的酶解片段的质谱分析

3、bacicyclicin XIN-1抑菌活性的测定

将上述获得的bacicyclicin XIN-1纯品制成终浓度为(0.19，0.39，0.78，1.56，3.13，6.25， 12.5，25，50，100μM)的试验样品。利用上述介绍的琼脂扩散法检测不同浓度下的bacicyclicin XIN-1对15种指示菌的抑菌活性。如表2所示，bacicyclicin XIN-1对蜡样芽胞杆菌ATCC14579、蜡样芽胞杆菌ATCC49604、粪肠球菌ATCC29212、粪肠球菌ATCC51299、屎肠球菌 ATCC33186、单核细胞增生李斯特菌LM201、单核细胞增生李斯特菌CMCC54002、单核细胞增生李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC29213、金黄色葡萄球菌ATCC43300、金黄色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌CMCC26069、酿脓链球菌ATCC19615、肺炎链球菌ATCC49619和猪链球菌SC19 15种病原菌具有抑菌活性。bacicyclicin XIN-1对15种病原菌的最低抑菌浓度范围在0.19-1.56μM。

表2 bacicyclicin XIN-1抑菌活性的检测

^aNB，牛肉膏蛋白培养基；LB，细菌基础培养基；TSB，胰酪大豆胨液体培养基；BHI，脑心浸液培养基

参考文献

1.Cintas LM,Rodriguez JM,Fernandez MF,Sletten K,Nes IF,Hernandez PE,Holo H.Isolation and characterization of pediocin L50,a new bacteriocin fromPediococcusacidilactici with a broad inhibitory spectrum.Applied andenvironmental microbiology,1995,61:2643-8.

2.Cotter PD,Ross RP,Hill C.Bacteriocins-a viable alternative toantibiotics？Nature Reiewv Microbiology,2013,11:95-105.

3.Rea MC,Sit CS,Clayton E,O'Connor PM,Whittal RM,Zheng J,Vederas JC,Ross RP,Hill C. Thuricin CD,a posttranslationally modified bacteriocin with anarrow spectrum of activity against Clostridium difficile.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,2010,107:9352-7.

4.Xin B,Zheng J,Xu Z,Li C,Ruan L,Peng D,Sun M.Three novellantibiotics,ticins A1,A3,and A4,have extremely stable properties and arepromising food biopreservatives.Applied.

序列表

SEQ ID NO:1

相山芽胞杆菌XIN-1菌株分泌的环状细菌素bacicyclicin XIN-1的前体肽核苷酸序列：ATGTTATTCGAATTAACTGGTATTGGTATTGGCTCTGGTACAGCTGCAACTATTGTAAACT GGATTATGTGGGGAATGAGTGCTGCTACTATTCTTAGCTTAATTAGTGGAGTTGCAAGTG GTGGAGCATGGATCCTTGCAGGTGCTAGAGAAGCTCTTAAAGCAGGCGGTAAAAAAGC TGCTATTGCTTGGTAA

SEQ ID NO:2

相山芽胞杆菌XIN-1菌株分泌的环状细菌素bacicyclicin XIN-1的前体肽的氨基酸序列：

MLFELTGIGIGSGTAATIVNWIMWGMSAATILSLISGVASGGAWILAGAREALKAGGKKAAI AW。

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