一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用 (Lanthionine precursor peptide amyA6, and preparation method and application thereof ) 是由 刘洪伟 张丽萍 赵雯雅 程辉彩 张飞燕 王雅娜 崔冠慧 段普凡 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用,涉及生物技术领域。羊毛硫肽前体肽amyA6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA6,可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性,抗菌活性持续时间是原来的4倍以上。(The invention discloses a lantibiotic peptide precursor peptide amyA6, a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of biology. The amino acid sequence of the lantibiotic precursor peptide amyA6 is shown in SEQ ID NO 1. The lantibiotic peptide precursor amyA6 is added in the fermentation process of the bacillus amyloliquefaciens, so that the antibacterial activity of the metabolite of the bacillus amyloliquefaciens can be obviously improved, and the duration of the antibacterial activity is more than 4 times of the original antibacterial activity.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。
背景技术
在如今农业生产过程中，植物病害是影响作物产量的一个主要原因。解决农业病害的问题，目前多采用播撒化学农药的传统方法。该种方法不仅会对环境造成污染，还会危害其他动植物以及人类的健康。近年来，科研人员开始采用生物防治的方法治理植物病害，生物农药具有高效、环保、不产生抗药性等一系列优点。因此，寻求新型高效生物防治手段来解决植物病害已刻不容缓。
目前关于生防菌株的研究主要包括生防细菌(芽孢杆菌、土壤放射杆菌、假单胞杆菌)和生防真菌(木霉菌)。其中芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌对于多种植物病害具较好的抑制作用，并具有广谱的抗菌活性。大量研究表明来源于解淀粉芽孢杆菌抗菌物质对于镰刀干腐病、早疫病、灰霉病、等植物病害都有良好的防治作用。
如今无论是在防治植物病害还是医学临床治疗过程中，病菌的耐药性都是一大难题。芽孢杆菌能够产生多种代谢产物，羊毛硫肽作为一种抗菌肽与传统抗生素相比具有双重作用机制，能够对多种细菌、真菌(多重耐药菌)有抑制作用并且不易产生耐药性，有望应用于农业生产以及临床医学等方面。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用，在解淀粉芽孢杆菌发酵过程中添加本发明羊毛硫肽前体肽amyA6，可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性，抗菌活性持续时间是原来的4倍以上。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种羊毛硫肽前体肽amyA6，该羊毛硫肽前体肽amyA6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上所羊毛硫肽前体肽amyA6的制备方法为：羊毛硫肽前体肽amyA6由具有特定基因序列的羊毛硫肽前体肽amyA6基因通过大肠杆菌异源表达或人工合成获得。
上述羊毛硫肽前体肽amyA6基因来源于解淀粉芽胞杆菌S499。提取解淀粉芽胞杆菌S499的基因组为模板，以引物A6-S、A6-A为上下游引物(SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4)，PCR扩增获得羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段。
上述羊毛硫肽前体肽amyA6，该前体肽amyA6的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
大肠杆菌异源表达方法：
(1)羊毛硫肽前体肽amyA6重组载体构建及转化：将羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段通过基因重组的方法构建到PET-28a载体上。利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)羊毛硫肽前体肽amyA6诱导表达：在液体LB培养基中培养BL21表达菌种，通过添加IPTG诱导羊毛硫肽前体肽amyA6蛋白的异源表达，用8M尿素溶液重悬菌体后，超声破碎菌体，释放羊毛硫肽前体肽amyA6。离心收集上清，使用孔径为1000Da大小的透析袋，透析三天，最后冷冻干燥至粉末状羊毛硫肽前体肽amyA6。
上述羊毛硫肽前体肽amyA6的应用为：羊毛硫肽前体肽amyA6在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用。
优选地，羊毛硫肽前体肽amyA6的添加时期为：解淀粉芽孢杆菌发酵起始至对数生长期末期。
优选地，羊毛硫肽前体肽amyA6的添加量为：解淀粉芽孢杆菌发酵液中加入0.001-10mg/L的羊毛硫肽前体肽amyA6。
具体的，上述应用，包括如下步骤：在液体NB培养基中培养(发酵)12小时解淀粉芽孢杆菌至对数生长期，取出摇床，在发酵液中加入0.001-10mg/L的羊毛硫肽前体肽amyA6，继续发酵培养，24小时后离心收集上清。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
首先，将本发明羊毛硫肽前体肽amyA6加入到解淀粉芽孢杆菌发酵液中，可明显增强其抑菌活性。结果显示实验组与对照相比抑菌圈直径扩大2倍以上，抑菌圈存在时间与对照相比可延长4倍以上。其次，该方法生产成本低、生产周期短、工艺简单、收率高。最后，该方法是采用生物防治治理植物病害，不会对人体及动植物以及生态环境不会造成危害。因此具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一、下述实施例中所需要的实验材料和试剂
1、菌株和载体：
解淀粉芽胞杆菌S499购自比利时微生物保藏委员会细菌保藏中心(BCCM/LMG)，编号为LMG 29676。大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物技术公司(TransGen Biotech)。pET-28a载体购自天恩泽生物技术公司(TIANDZ)。
2、酶类及其它生化试剂：
KOD-Plus聚合酶购自上海根生生物有限公司(TOYOBO)。TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司公司产品。Axygen凝胶回收试剂盒为美国爱思进公司产品。Vazyme试剂盒为南京诺唯赞生物科技有限公司产品。
3、除非特殊说明，本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。
二、下述实施例中所需要的培养基配方：
LB培养基：胰蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母提取物5g，加去离子水定容至1000ml，调节pH值为7.0-7.2。
NB培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，加去离子水定容至1000ml，调节pH值为7.0-7.2。
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，加去离子水定容至1000ml。
上述培养基均为液体培养基，相应的固体培养基要再加入12g琼脂。
实施例1羊毛硫肽前体肽amyA6的来源及筛选过程
羊毛硫肽前体肽amyA6基因来源于解淀粉芽胞杆菌S499。
使用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取解淀粉芽胞杆菌S499的全基因组。
利用Primer 5.0设计羊毛硫肽前体肽amyA6引物，在前体肽序列两端加上pET-28a两端的同源片段作为同源臂(A6-S：CTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAAAAGAACTTCAGCGCG，SEQID NO:3；A6-A：CCTTTCGGGCTTTGTTATACTTGCCTTTGCGGAC，SEQ ID NO:4)。
PCR扩增羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段。PCR反应以解淀粉芽孢杆菌S499的基因组DNA为模板，以引物A6-S、A6-A为上下游引物，使用KOD-Plus聚合酶进行扩增，PCR扩增获得羊毛硫肽前体肽amyA6基因片段。
该前体肽amyA6的基因序列为：ATGAAAAAGAACTTCAGCGCGTTGTATGAAACATCAGAACAAGAATTAAAAGAGCTTGTTGGAGGGCAAAACTCAGTATCAATAACAACATATCCAATCACAAATCATATTTGTCCAACTATCACAGTAGGCTGCGCATGTCCGCAAAGGCAAGTATAA。如SEQ ID NO:2所示。
PCR反应体系如下：DNA模板，约100ng；10μM上下游引物，各1.5μL；10×Buffer，5μL；2Mm dNTPs，5μL；25mM MgSO4，2μL；KOD-Plus，1μL，加水定容至50μL。PCR反应程序为：98℃，预变性2min；98℃，变性30s；Tm-5℃，复性40s；68℃，延伸1min；68℃，延伸10min；4℃，保存。
实施例2大肠杆菌异源表达
(1)构建前体肽基因表达载体
利用Primer 5.0设计前体肽引物以及pET-28a载体序列特异性引物，在前体肽序列两端加上pET-28a两端的同源片段作为同源臂。PCR扩增前体肽基因片段以及pET-28a载体片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物并使用Axygen凝胶回收试剂盒，对目的条带进行回收。将纯化前体肽基因片段、pET-28a载体片段利用Vazyme试剂盒中的连接酶进行连接构建重组载体。利用热激转化的方法将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)诱导表达前体肽蛋白的获得
采用分子生物学技术异源表达的方式获得前体肽蛋白。在液体LB培养基中培养BL21表达菌种，通过添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导前体肽蛋白的异源表达，用8M尿素溶液重悬菌体后，超声破碎菌体，释放前体肽。离心收集上清，使用孔径为1000Da大小的透析袋，透析三天，最后冷冻干燥至粉末状羊毛硫肽前体肽amyA6。
该前体肽amyA6的氨基酸序列为：
Met-Lys-Lys-Asn-Phe-Ser-Ala-Leu-Tyr-Glu-Thr-Ser-Glu-Gln-Glu-Leu-Lys-Glu-Leu-Val-Gly-Gly-Gln-Asn-Ser-Val-Ser-Ile-Thr-Thr-Tyr-Pro-Ile-Thr-Asn-His-Ile-Cys-Pro-Thr-Ile-Thr-Val-Gly-Cys-Ala-Cys-Pro-Gln-Arg-Gln-Val。如SEQ ID NO:1所示。
实施例3
羊毛硫肽前体肽amyA6在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用，包括如下步骤：
(1)解淀粉芽孢杆菌的发酵：
实验组：在液体NB培养基中培养(发酵)12小时解淀粉芽孢杆菌至对数生长期，取出摇床，在发酵液中加入0.001-10mg/L的羊毛硫肽前体肽amyA6，继续发酵培养，24小时后离心收集上清(上清液1)；
对照组：在液体NB培养基中培养(发酵)12小时解淀粉芽孢杆菌至对数生长期，与实验组同时取出摇床，不加入羊毛硫肽前体肽amyA6，继续发酵培养，24小时后离心收集上清(上清液2)。
(2)平板对峙试验：
以灰葡萄孢菌、接骨木镰刀菌和茄链格孢菌为指示菌做平板对峙实验；
实验组：制备指示菌菌悬液倒入预热融化的固体PDA培养基中混匀后到平板，每个平板定量倒入30mL；待平板凝固后，使用直径为8mm的打孔器打孔；孔内加入100uL制备好的发酵“上清液1”，最后置于26℃恒温培养箱中培养数天后观察结果。
对照组：在另外的孔内加入100uL制备好的发酵液“上清液2”作为对照，最后置于26℃恒温培养箱中培养数天后观察结果。
实施例4羊毛硫肽前体肽amyA6在提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抗菌活性过程中的应用
用NB培养基培养解淀粉芽孢杆菌，至对数生长期，在发酵液中加入0.1mg/L的羊毛硫肽前体肽amyA6，该组作为实验组(上清液1)。以不加入羊毛硫肽前体肽amyA6的发酵液作为对照组(上清液2)。培养至结束，收集发酵液上清。以灰葡萄孢菌、接骨木镰刀菌和茄链格孢菌为指示菌做平板对峙实验。制备菌悬液倒入预热融化的固体PDA培养基中混匀后到平板，每个平板定量倒入30mL。待平板凝固后，使用直径为8mm的打孔器打孔，每个平板打两个孔，其中一个孔内加入100uL制备好的发酵液上清1(实验组)，另一个孔内加入100uL制备好的发酵液上清2(对照组)，最后置于26℃恒温培养箱中培养数天后观察结果。结果显示实验组与对照组相比抑菌圈直径扩大2倍以上，抑菌圈存在时间与对照组相比可延长4倍以上。
实施例5-8不同添加量羊毛硫肽前体肽amyA6的应用结果
设置不同前体肽添加量，按照上述实施例3操作，通过实验观察不同前体肽添加量对解淀粉芽孢杆菌抑制灰葡萄孢菌、接骨木镰刀菌和茄链格孢菌活性影响。
表1.不同前体肽添加量对解淀粉芽孢杆菌抑菌活性影响
结果显示，添加羊毛硫肽前体肽amyA6，可以显著提高解淀粉芽孢杆菌代谢产物抑菌活性，延长抑菌效果持续时间。
序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种羊毛硫肽前体肽amyA6及其制备方法和应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Lys Asn Phe Ser Ala Leu Tyr Glu Thr Ser Glu Gln Glu Leu
1 5 10 15
Lys Glu Leu Val Gly Gly Gln Asn Ser Val Ser Ile Thr Thr Tyr Pro
20 25 30
Ile Thr Asn His Ile Cys Pro Thr Ile Thr Val Gly Cys Ala Cys Pro
35 40 45
Gln Arg Gln Val
50
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaaga acttcagcgc gttgtatgaa acatcagaac aagaattaaa agagcttgtt 60
ggagggcaaa actcagtatc aataacaaca tatccaatca caaatcatat ttgtccaact 120
atcacagtag gctgcgcatg tccgcaaagg caagtataa 159
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctttaagaag gagatatacc atgaaaaaga acttcagcgc g 41
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctttcgggc tttgttatac ttgcctttgc ggac 34