阅读说明：本技术 用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用 (Preparation and application of hypersensitive protein for biological prevention and treatment of tobacco mosaic virus disease ) 是由 张家韬 崔传斌 安德荣 董绘阳 陈超 耿伟 李立丹 王安然 于 2019-10-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用,以枯草芽孢杆菌为生产菌株,通过对枯草芽孢杆菌发酵粉的温水溶解、离心、膜分离、喷雾干燥处理制备超敏蛋白成品,采用两个连续梯度密度离心,再经过分级超滤膜分离,最大限度去除菌体和杂蛋白,得到活性较高的超敏蛋白浓缩液,再利用了超敏蛋白的耐热性,通过低温喷雾干燥技术,使超敏蛋白快速干燥,提高了超敏蛋白制备效率,且麦芽粉作为辅料具有溶解性好、稳定性高、含有丰富微量元素和矿物质等优点。本发明制得超敏蛋白对烟草花叶病毒病的防治具有明显的防治效果,防效可达82.66％；本发明分离纯化超敏蛋白活性高,成本低廉,工艺简单,后期处理损耗较低。(The invention relates to preparation and application of hypersensitive protein for biological control of tobacco mosaic virus diseases, bacillus subtilis is taken as a production strain, a hypersensitive protein finished product is prepared by warm water dissolution, centrifugation, membrane separation and spray drying treatment of bacillus subtilis fermentation powder, two continuous gradient density centrifuges are adopted, and then a graded ultrafiltration membrane is used for separation, so that thalli and foreign protein are removed to the maximum extent, a hypersensitive protein concentrated solution with higher activity is obtained, the heat resistance of the hypersensitive protein is utilized, and the hypersensitive protein is rapidly dried by a low-temperature spray drying technology, so that the preparation efficiency of the hypersensitive protein is improved, and the malt powder has the advantages of good solubility, high stability, rich trace elements and minerals and the like as an auxiliary material. The hypersensitive protein prepared by the invention has obvious prevention and treatment effects on tobacco mosaic virus, and the prevention and treatment effects can reach 82.66%; the invention has the advantages of high activity of the separated and purified hypersensitive protein, low cost, simple process and lower post-treatment loss.)

用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用

技术领域

本发明涉及生物提取工艺技术领域，尤其涉及用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用。

背景技术

烟草花叶病毒是一种单链RNA病毒，对植物具有极强的侵染性和致病力，寄主范围广泛，可侵染350余种植物，其中以茄科、十字花科、菊科受害最重，这些作物和植物感病后常常造成严重损失甚至毁田。烟草是重要的经济作物，极易感染TMV，烟草花叶病毒可以通过各种农事操作时接触传染的，特别在目前工厂化集中育苗大展，叶片扭曲不长，出现各种坏死斑，并且矮化和死亡，烟叶失去利用价值。因此烟草病毒病是烟草生产和其他易感作物的最重要的植物病害。

预防和防治花叶病一直是烟草及其他茄科植物生产中的重大课题，该病害难于防治，且各种化学防治效果差、残留大。目前对烟草花叶病的防治，国内外已做了大量研究，但目前市场上推广的各种防治烟草花叶病的农药效果均不理想。而且常用的化学农药防治，不但效果低、毒性大还会造成环境污染等严重问题，且长期连续高剂量的施用单一的抗病毒化学农药，容易造成大量农药的残留、环境再污染以及病毒的耐药性提高等问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中常用化学农药防治，效果低、毒性大和污染环境的问题，而提出的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法，所述超敏蛋白的提取工艺包括依次进行的温水溶解、密度梯度离心、分级超滤膜分离、调节pH值和低温喷雾干燥步骤。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所述温水溶解步骤，按照枯草芽孢杆菌发酵粉与水1：100的比例加入温度为36℃的温水中。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所述分级超滤膜分离步骤中将离心后的上清液进行分级过滤，过滤温度36℃，陶瓷膜设备的进出口压降为0.2～0.25MPa，平均通量为0.3m³/h，除去菌体和杂蛋白率达到98.99％～99.99％，膜分离后的上清液中超敏蛋白的抑菌效价U＝12000单位/mg。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所述分级过滤包括三级过滤；第一级过滤采用35万分子量陶瓷膜，第二级过滤采用15万分子量陶瓷膜，第三级过滤采用5万分子量陶瓷膜。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所述调节pH值步骤中具体调节方法如下：收集分级超滤膜分离后的清液，调整pH值至4.5，静置36h后，滤除上层上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复滤除操作直至浓缩液体积为调整pH值前上清液体积的40％；调节pH值的调节剂为盐酸。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，向所述浓缩液中加入30％麦芽粉作为助剂搅拌均匀后，按照40L/h的处理量进行低温喷雾干燥得到超敏蛋白干粉。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所述低温喷雾干燥的进风温度为30～45℃，出风温度为30～40℃。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法中，所采用的枯草芽孢杆菌发酵产物为固态发酵粉，其枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18089。

在上述的用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备方法所制得的超敏蛋白的应用中，超敏蛋白的应用方式为叶面喷雾，喷雾最佳时间应在烟草苗叶期进行喷雾，用水稀释300倍，用量1g/㎡。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明将温水提取液经过两个连续密度梯度离心机离心，再经过分级超滤膜分离，可最大限度去除菌体和杂蛋白，得到活性较高的超敏蛋白；

2、本发明将超敏蛋白加工成干粉时，利用了超敏蛋白的耐热性，通过低温喷雾干燥技术，使超敏蛋白快速干燥，提高了超敏蛋白制备效率，且麦芽粉作为辅料具有溶解性好、稳定性高、含有丰富微量元素和矿物质等优点；

3、本发明是通过枯草芽孢杆菌发酵粉提取而得的一种绿色环保无污染的生防菌剂，是一种绿色抗性蛋白，可提高植物的抗病毒特性，对人畜无害、不污染环境；

4、本发明具有对烟草花叶病毒的高效针对性，属于植物病害的绿色防控技术，本发明分离纯化超敏蛋白活性高，成本低廉，工艺简单，后期处理损耗较低。

具体实施方式

以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。

实施例

用于烟草花叶病毒病生物防治的超敏蛋白的制备及应用，超敏蛋白的提取工艺包括依次进行的温水溶解、密度梯度离心、分级超滤膜分离、调节pH值和低温喷雾干燥步骤。

温水溶解步骤，按照枯草芽孢杆菌发酵粉与水1：100的比例加入温度为36℃的温水中；采用该技术方案，使其有效成分保持较高活性，保证了超敏蛋白的抑菌效价。

分级超滤膜分离步骤中将离心后的上清液进行分级过滤，过滤温度36℃，陶瓷膜设备的进出口压降为0.2～0.25MPa，平均通量为0.3m³/h，除去菌体和杂蛋白率达到98.99％～99.99％，膜分离后的上清液中超敏蛋白的抑菌效价U＝12000单位/mg；采用该技术方案，除去菌体和杂蛋白的效果好，且有效保证超敏蛋白的活性；分级过滤包括三级过滤；第一级过滤采用35万分子量陶瓷膜，第二级过滤采用15万分子量陶瓷膜，第三级过滤采用5万分子量陶瓷膜；采用该技术方案，利用分级过滤，更加有效地去除上清液中的菌体和杂蛋白。

调节pH值步骤中具体调节方法如下：收集分级超滤膜分离后的清液，调整pH值至4.5，静置36h后，滤除上层上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复滤除操作直至浓缩液体积为调整pH值前上清液体积的40％；采用该技术方案，既保证了浓缩液中有效成分的含量，又利于后续工序的进行，为快速高效获得超敏蛋白干粉打下良好的基础；调节pH值的调节剂为盐酸；采用该技术方案，pH值调节效果好且不损失超敏蛋白的活性。

向浓缩液中加入30％麦芽粉作为助剂搅拌均匀后，按照40L/h的处理量进行低温喷雾干燥得到超敏蛋白干粉；低温喷雾干燥的进风温度为30～45℃，出风温度为30～40℃；采用该技术方案，可有效保证超敏蛋白的抑菌效价，且便于快速干燥获得超敏蛋白干粉，干燥效果好且不损失超敏蛋白的活性。

所采用的枯草芽孢杆菌发酵产物为固态发酵粉，其枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18089；超敏蛋白的应用方式为叶面喷雾，喷雾最佳时间应在烟草苗叶期进行喷雾，用水稀释300倍，用量1g/㎡。

本发明中具体制备过程如下：步骤一，温水溶解，将枯草芽孢杆菌发酵粉按照1：100比例加入水温为36℃的温水中。

步骤二，离心，将步骤一的发酵液通过连续的密度梯度离心机离心，除去沉淀，保留上清液，经过连续两次离心处理，可有效去除发酵液中的大量沉淀，有利于后续工序的进行。离心机的转速为14000rpm，离心机的处理量为2m³/h，离心后的上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序，转鼓中的固体杂质刮下后经灭菌等处理后弃掉。

步骤三分级超滤膜分离，上清液通过5万～35万分子量陶瓷膜进行分级过滤，第一级过滤，采用35万分子量陶瓷膜，35万分子量以上的大分子物质被分离，第二级过滤，将第一级过滤液采用15万分子量陶瓷膜再次过滤，第三级过滤将，第二级过滤液采用5万分子量陶瓷膜最终过滤。过滤滤温度36℃，陶瓷膜设备的进出口压降为0.2～0.25MPa，平均通量为0.3m³/h，上清液沿着陶瓷膜的表面流过，陶瓷膜对上清液进行错流过滤，在压力作用的驱动下，上清液在膜管内流动，小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，从而使上清液除去菌体和杂蛋白，除去率达到98.99％～99.99％，膜分离后的上清液中超敏蛋白的抑菌效价U＝12000单位/mg。

步骤四，PH值调节，提取步骤三的液体，向其加入盐酸将PH值调至4.5，在正式调节前将提取液分为多份，使得每份容量相对较少，以避免调节过程混合时间过程导致测量数值不准确，同时，逐滴少量多次的加入盐酸进行调节，滴入盐酸后用充分搅拌以确保整体ph值的稳定，再通过ph计进行准确度数值测量，在ph计使用时应遵循以下原则，每次使用前必须用标准缓冲溶液进行校正；在连续使用时,每天要标定一次，选择两种PH值约相差3个PH单位的标准缓冲并使供试品溶液的PH值处于两者之间；测量电极使用前、后都要清洗干净,电极头及其脆弱注意保护,使用前后擦拭时候用较软的纸进行擦拭；使用前应检查电极球泡前端是否有气泡,如有气泡应用力甩去；pH复合电极***被测溶液后,要搅拌晃动几下再静止放置,这样会加快电极的响应；在多份提取液ph值均为4.5时将多份提取液混合并充分搅拌，然后再次测量整体提取液的ph值，直至整体的ph值达到4.5，然后静置36h，静置完毕后再次经过膜分离除去沉淀物，制得浓缩液，重复上述步骤，直到浓缩液体积为原体积的40％。

步骤五，低温喷雾干燥，在浓缩液中加入30％麦芽粉作为助剂搅拌均匀后，按照40L/h的处理量，进风温度为30～45℃，出风温度为30～40℃，进行喷雾干燥处理，制得超敏蛋白干粉。

本发明的超敏蛋白是从枯草芽孢杆菌发酵粉中提取而得，草芽孢杆菌发酵粉的制备，包括以下步骤：

步骤一，菌种固体斜面培养：将枯草芽孢杆菌SL-19菌种接入固体斜面，在斜面培养基中培养，温度为28℃，培养时间36h；

步骤二，种子液扩大培养：将步骤一的枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml种子液培养基中摇瓶培养36h，培养温度29℃，转速280转/分；

步骤三，发酵培养：按8％的接种量将步骤二的种子液接种到2000升的大发酵罐中，变温变通气量的培养条件下：先在29℃、通气量0.4立方米/分钟、培养48小时，再升温到39℃、通气量加大到1.5立方米/分钟、再培养72小时，辅以转速280转/分进行培养，当发酵菌液中枯草芽孢杆菌SL-19的活孢子数≥500亿/ml时即可终止发酵，制得本发明的一种枯草芽孢杆菌液体菌剂。

步骤四，固体菌粉制备：将步骤三制得的发酵液体菌剂与固态载体混合后，进行喷雾干燥处理，制得枯草芽孢杆菌固体菌粉

其中步骤一中的斜面培养基组成成分及重量百分比为：蛋白胨1.5％，酵母浸膏1.0％，氯化钠0.8％，琼脂3.0％，余量为水，自然pH值。

其中步骤二中种子液培养基组成成分及重量百分比为：蛋白胨1.8％，酵母浸膏2.0％，氯化钠1.0％，余量为水，自然pH值。

其中步骤四所采用的发酵培养基组成成分及重量百分比为：酵母粉2.5％、玉米粉1.5％、碳酸钙0.55％、磷酸二氢钾0.68％、硫酸铵0.58以及消泡剂0.035％，余量为水，PH6.8-7.3。

枯草芽孢杆菌菌粉的固态载体为高岭土和硅藻土。

枯草芽孢杆菌菌剂的喷雾干燥处理，处理条件为：喷雾干燥的进风温度为40℃，出风温度为30℃。

本发明的田间防治试验结过程如下：

田间防治试验在洛南烟草地进行。试验小区选在洛南地区。

试验处理：在烟草生长到苗叶期时进行叶面喷雾处理，处理一：将实施例1制得超敏蛋白干粉与水(1：300比例)混合后进行喷雾，用量1g/㎡；处理二：使用市售的防治烟草花叶病毒的化学制剂，按照说明书进行等量喷施；处理三：使用等量清水喷施。

试验方法：在烟草的苗叶期进行喷雾处理，共喷雾3次，喷施后5天进行调查并记录发病株数，试验结果见表一。

表一：三种处理下对烟草花叶病毒的防治

注：烟草病毒病严重度分级标准(国家标准GB/T23222-2008)以株为单位分级调查：0级：全株无病；1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；3级：三分之一叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的四分之三以上；5级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的三分之二至四分之三；7级：二分之一至三分之二叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一至三分之二；9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一以上。

防治效果(％)＝(空白对照发病株数-处理组的发病株数)÷空白对照的发病株数×100％。

从表一可以看出使用本发明制得超敏蛋白对烟草花叶病毒病的防治具有明显的防治效果，防效可达82.66％，且相比较市售的化学防治剂52.76％更加有效，并且不会产生化学残留以及对环境造成污染。

以上所述：仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。