阅读说明：本技术 鱼鳞角蛋白的制备方法 (Preparation method of fish scale keratin ) 是由 刘焱 李秋雨 陈韬 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种鱼鳞角蛋白的制备方法,包括以下步骤：a)将鱼鳞进行预处理；b)提取预处理后的鱼鳞中的胶原蛋白；c)采用碱性蛋白酶法提取步骤b)获得的残渣,得到鱼鳞角蛋白；d)采用碱法提取步骤c)获得的残渣,得到鱼鳞角蛋白。本发明首先将鱼鳞预处理后提取其中的胶原蛋白,然后通过两步法提取剩余残渣中的角蛋白,第一步采用碱性蛋白酶法提取残渣中的角蛋白,第二步继续用碱法提取残渣中得角蛋白,本发明将碱性蛋白酶法和碱法联用提取角蛋白,不仅提高了角蛋白的收率,而且提高了其收率。(The invention provides a preparation method of fish scale keratin, which comprises the following steps: a) preprocessing fish scales; b) extracting collagen from the pretreated fish scales; c) extracting the residue obtained in the step b) by adopting an alkaline protease method to obtain fish scale keratin; d) extracting the residue obtained in the step c) by an alkaline method to obtain the fish scale keratin. The method comprises the steps of firstly pretreating fish scales, extracting collagen from the fish scales, then extracting keratin from the residual residues through a two-step method, extracting the keratin from the residues through an alkaline protease method in the first step, and continuously extracting the keratin from the residues through the alkaline method in the second step.)

鱼鳞角蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白领域，尤其涉及一种鱼鳞角蛋白的制备方法。

背景技术

角蛋白是一类具有结缔和保护功能的纤维状硬蛋白，其结构稳定，变性温度高，常被用于医药和生物材料。目前关于角蛋白的研究主要集中在动物毛发角蛋白的提取方面，其中关于还原法提取羊毛角蛋白的研究最多，有关还原剂的选择与优化等为研究热点。

鱼鳞作为鱼肉制品的副产物在工业化生产和日常消费中常被废弃，近年来，研究发现鱼鳞中含有多种有效成分，关于鱼鳞胶原蛋白、鱼鳞羟基磷灰石等的研究越来越多，提高了鱼鳞的附加值，变废为宝。但是，鱼鳞在提取胶原蛋白后仍剩余大量残渣，这些残渣中还含有丰富有效物质角蛋白。将这些残渣中的角蛋白提取出来，可大大提高鱼鳞的附加值，变废为宝。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鱼鳞角蛋白的制备方法，本发明提供的方法获得的鱼鳞角蛋白纯度较高、收率较高，且分子量较高。

本发明提供了一种鱼鳞角蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a)将鱼鳞进行预处理；

b)提取预处理后的鱼鳞中的胶原蛋白；

c)采用碱性蛋白酶法提取步骤b)获得的残渣，得到鱼鳞角蛋白；

d)采用碱法提取步骤c)获得的残渣，得到鱼鳞角蛋白。

本发明首先将鱼鳞预处理后提取其中的胶原蛋白，然后通过两步法提取剩余残渣中的角蛋白，第一步采用碱性蛋白酶法提取残渣中的角蛋白，第二步继续用碱法提取残渣中得角蛋白，本发明将碱性蛋白酶法和碱法联用提取角蛋白，不仅提高了角蛋白的收率，而且提高了其收率。

具体而言，本发明首先对鱼鳞进行预处理，步骤如下：

所述步骤a)具体包括：

a1)将鱼鳞浸泡在氯化钠溶液中脱杂蛋白；

a2)将步骤a1)得到的鱼鳞在氢氧化钠溶液中浸泡进行脱脂；

a3)将步骤a2)得到的鱼鳞在过氧化氢溶液中浸泡进行脱色；

a4)将步骤a4)得到的鱼鳞在柠檬酸溶液中进行浸泡进行脱灰。

在一个实施例中，所述步骤a1)中，氯化钠的浓度为80～120g/L。

在一个实施例中，所述步骤a2)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1.5mol/L；

在一个实施例中，所述步骤a3)中，过氧化氢溶液的浓度为0.5～1wt％；

在一个实施例中，所述步骤a4)中，柠檬酸溶液的浓度为3～4wt％。

具体而言，所述步骤a)可以包括：

a1)脱杂蛋白：新鲜鱼鳞洗净，用100g/L的氯化钠溶液于4℃浸泡12h；

a2)脱脂：脱杂蛋白后鱼鳞用自来水洗净后再用蒸馏水漂洗三次，然后用0.1mol/L的氢氧化钠溶液于4℃浸泡12h。

a3)脱色：脱脂后鱼鳞用自来水洗净后再用蒸馏水漂洗三次，然后用0.5～1％的过氧化氢溶液于4℃脱色6h。

a4)脱灰：脱色后鱼鳞用自来水洗净后再用蒸馏水漂洗三次，然后用12～14倍体积的3～4％柠檬酸溶液于4℃浸泡6h。

对鱼鳞进行预处理后，提取其中的胶原蛋白，具体可以采用酶法或者酸法提取其中的胶原蛋白。

具体而言，酸法提取胶原蛋白为：将步骤a)得到的鱼鳞在柠檬酸溶液中浸泡提取。

酶法提取胶原蛋白为：将步骤a)得到的鱼鳞在胃蛋白酶的柠檬酸溶液中浸泡提取。

提取完胶原蛋白后得到的残渣可以继续依次采用碱性蛋白酶法和碱法提取角蛋白，首先采用碱性蛋白酶法提取角蛋白能够提高后续碱法提取角蛋白的收率和纯度。

具体而言，采用碱性蛋白酶法提取角蛋白过程如下：

向步骤b)获得的残渣中加入0.005～0.2mol/L的氢氧化钠溶液和占残渣1～5wt％的碱性蛋白酶，50～80℃反应后过滤，将滤液离心，将上清液调节pH值至角蛋白等电点，将得到的沉淀离心、溶解、透析、冻干后得到鱼鳞角蛋白。

具体而言，采用碱法提取角蛋白过程如下：

向步骤c)获得的残渣中加入质量浓度为7～9wt％的氢氧化钠溶液，55～65℃反应后过滤，将滤液调节pH值至等电点，将得到的沉淀离心、溶解、透析、冻干后得到鱼鳞角蛋白。

在一个实施例中，所述步骤c)中，氢氧化钠溶液的加入量为步骤b)获得的残渣重量的15～25倍。

在一个实施例中，氢氧化钠溶液的加入量为步骤c)获得的残渣重量的15～25倍。

本发明提供了一种鱼鳞角蛋白的制备方法，包括以下步骤：a)将鱼鳞进行预处理；b)提取预处理后的鱼鳞中的胶原蛋白；c)采用碱性蛋白酶法提取步骤b)获得的残渣，得到鱼鳞角蛋白；d)采用碱法提取步骤c)获得的残渣，得到鱼鳞角蛋白。本发明首先将鱼鳞预处理后提取其中的胶原蛋白，然后通过两步法提取剩余残渣中的角蛋白，第一步采用碱性蛋白酶法提取残渣中的角蛋白，第二步继续用碱法提取残渣中得角蛋白，本发明将碱性蛋白酶法和碱法联用提取角蛋白，不仅提高了角蛋白的收率，而且提高了其收率。

具体实施方式

实施例1

1)鱼鳞预处理：

A，鱼鳞脱杂蛋白：将10g干净的草鱼鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为100g/L的氯化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱杂蛋白鱼鳞。

B，鱼鳞脱脂：将脱杂蛋白鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱脂鱼鳞。

C，鱼鳞脱色：将脱脂鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为0.5～1％的过氧化氢溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱色鱼鳞。

D，鱼鳞脱灰：将脱色鱼鳞置于锥形瓶中，加入120～140mL质量浓度为2～4％的柠檬酸溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱灰鱼鳞，鱼鳞灰分脱除率达97.53％，脱灰后鱼鳞重8.5g。

2)鱼鳞脱胶：将步骤1)得到的鱼鳞用200mL0.5mol/L的柠檬酸溶液4℃下浸泡提取24h后过滤，得到6.84g残渣。

3)鱼鳞角蛋白提取：向步骤2)得到的残渣中加入20倍残渣重量的0.01mol/L的氢氧化钠溶液及3％残渣重的碱性蛋白酶，于60℃水浴锅中反应3h后取出，过滤，滤液于离心机中4000r/min离心20min，上清液加入浓盐酸调pH至角蛋白等电点，静置30min待角蛋白沉淀完全后于离心机中4000r/min离心20min，沉淀用适量提取剂溶解后装入透析袋中，对蒸馏水透析3d，每4h换水一次，透析完成后经冷冻干燥得0.13g成品，角蛋白得率1.3％；

4)鱼鳞角蛋白第二次提取：向步骤3)得到的鱼鳞残渣中加入100mL质量浓度为7％的氢氧化钠溶液于60℃反应30min后过滤得鱼鳞角蛋白提取液，用浓盐酸调节提取液pH值至等电点，静置30min，待角蛋白完全沉淀后置于离心机中4000～5000r/min离心20min，弃去上清液，得到纯净的米白色沉淀即为鱼鳞角蛋白；所得角蛋白沉淀用5mL质量浓度为2～4％氢氧化钠溶液溶解后转入透析袋中对蒸馏水透析3天，每隔4h换水一次；纯化后的角蛋白溶液转入平皿中，覆膜，-20℃冷冻过夜后置于真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的角蛋白粉末0.51g，角蛋白得率5.1％。

经测定，本实施例提取的角蛋白，其含量为99.9％，纯度较高，其分子量在48KD左右，分子结构保存完整。

实施例2

1)鱼鳞预处理：

A，鱼鳞脱杂蛋白：将10g干净的草鱼鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为100g/L的氯化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱杂蛋白鱼鳞。

B，鱼鳞脱脂：将脱杂蛋白鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱脂鱼鳞。

C，鱼鳞脱色：将脱脂鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为0.5～1％的过氧化氢溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱色鱼鳞。

D，鱼鳞脱灰：将脱色鱼鳞置于锥形瓶中，加入120～140mL质量浓度为2～4％的柠檬酸溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱灰鱼鳞，鱼鳞灰分脱除率达97.53％，脱灰后鱼鳞重8.6g。

2)鱼鳞脱胶：将步骤1)得到的鱼鳞用200mL含0.30g胃蛋白酶的1wt％的柠檬酸溶液4℃下浸泡提取24h后过滤，得到6.43g残渣。

3)鱼鳞角蛋白提取：向步骤2)得到的残渣中加入20倍残渣重量的0.01mol/L的氢氧化钠溶液及3％残渣重的碱性蛋白酶，于60℃水浴锅中反应3h后取出，过滤，滤液于离心机中4000r/min离心20min，上清液加入浓盐酸调pH至角蛋白等电点，静置30min待角蛋白沉淀完全后于离心机中4000r/min离心20min，沉淀用适量提取剂溶解后装入透析袋中，对蒸馏水透析3d，每4h换水一次，透析完成后经冷冻干燥得0.15g成品，角蛋白得率1.5％；

4)鱼鳞角蛋白第二次提取：向步骤3)得到的鱼鳞残渣中加入80mL质量浓度为9％的氢氧化钠溶液于60℃反应30min后过滤得鱼鳞角蛋白提取液，用浓盐酸调节提取液pH值至等电点，静置30min，待角蛋白完全沉淀后置于离心机中4000～5000r/min离心20min，弃去上清液，得到纯净的米白色沉淀即为鱼鳞角蛋白；所得角蛋白沉淀用5mL质量浓度为2～4％氢氧化钠溶液溶解后转入透析袋中对蒸馏水透析3天，每隔4h换水一次；纯化后的角蛋白溶液转入平皿中，覆膜，-20℃冷冻过夜后置于真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的角蛋白粉末0.54g，角蛋白得率5.4％。

经测定，本实施例提取的角蛋白，其含量为99.7％，纯度较高，其分子量在48KD左右，分子结构保存完整。

实施例3

1)鱼鳞预处理：

A，鱼鳞脱杂蛋白：将10g干净的草鱼鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为100g/L的氯化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱杂蛋白鱼鳞。

B，鱼鳞脱脂：将脱杂蛋白鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱脂鱼鳞。

C，鱼鳞脱色：将脱脂鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为0.5～1％的过氧化氢溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱色鱼鳞。

D，鱼鳞脱灰：将脱色鱼鳞置于锥形瓶中，加入120～140mL质量浓度为2～4％的柠檬酸溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱灰鱼鳞，鱼鳞灰分脱除率达97.53％，脱灰后鱼鳞重8.6g。

2)鱼鳞脱胶：将步骤1)得到的鱼鳞用200mL含0.30g胃蛋白酶的1wt％的柠檬酸溶液4℃下浸泡提取24h后过滤，得到6.43g残渣。

3)鱼鳞角蛋白提取：向步骤2)得到的残渣中加入20倍残渣重量的0.01mol/L的氢氧化钠溶液及3％残渣重的碱性蛋白酶，于60℃水浴锅中反应3h后取出，过滤，滤液于离心机中4000r/min离心20min，上清液加入浓盐酸调pH至角蛋白等电点，静置30min待角蛋白沉淀完全后于离心机中4000r/min离心20min，沉淀用适量提取剂溶解后装入透析袋中，对蒸馏水透析3d，每4h换水一次，透析完成后经冷冻干燥得0.13g成品，角蛋白得率1.3％；

4)鱼鳞角蛋白第二次提取：向步骤3)得到的鱼鳞残渣中加入80mL质量浓度为8％的氢氧化钠溶液于60℃反应30min后过滤得鱼鳞角蛋白提取液，用浓盐酸调节提取液pH值至等电点，静置30min，待角蛋白完全沉淀后置于离心机中4000～5000r/min离心20min，弃去上清液，得到纯净的米白色沉淀即为鱼鳞角蛋白；所得角蛋白沉淀用5mL质量浓度为2～4％氢氧化钠溶液溶解后转入透析袋中对蒸馏水透析3天，每隔4h换水一次；纯化后的角蛋白溶液转入平皿中，覆膜，-20℃冷冻过夜后置于真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的角蛋白粉末0.52g，角蛋白得率5.2％。

经测定，本实施例提取的角蛋白，其含量为99.7％，纯度较高，其分子量在48KD左右，分子结构保存完整。

比较例1

1)鱼鳞预处理：

A，鱼鳞脱杂蛋白：将10g干净的草鱼鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为100g/L的氯化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱杂蛋白鱼鳞。

B，鱼鳞脱脂：将脱杂蛋白鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱脂鱼鳞。

C，鱼鳞脱色：将脱脂鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为0.5～1％的过氧化氢溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱色鱼鳞。

D，鱼鳞脱灰：将脱色鱼鳞置于锥形瓶中，加入120～140mL质量浓度为2～4％的柠檬酸溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱灰鱼鳞，鱼鳞灰分脱除率达97.53％，脱灰后鱼鳞重8.5g。

2)鱼鳞脱胶：将步骤1)得到的鱼鳞用200mL0.5mol/L的柠檬酸溶液4℃下浸泡提取24h后过滤，得到6.84g残渣。

3)鱼鳞角蛋白提取：向步骤2)得到的鱼鳞残渣中加入100mL质量浓度为7％的氢氧化钠溶液于60℃反应30min后过滤得鱼鳞角蛋白提取液，用浓盐酸调节提取液pH值至等电点，静置30min，待角蛋白完全沉淀后置于离心机中4000～5000r/min离心20min，弃去上清液，得到纯净的米白色沉淀即为鱼鳞角蛋白；所得角蛋白沉淀用5mL质量浓度为2～4％氢氧化钠溶液溶解后转入透析袋中对蒸馏水透析3天，每隔4h换水一次；纯化后的角蛋白溶液转入平皿中，覆膜，-20℃冷冻过夜后置于真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的角蛋白粉末0.44g，角蛋白得率4.4％。

经测定，本实施例提取的角蛋白，其含量为99％，纯度较高，其分子量在48KD左右，分子结构保存完整。

比较例2

1)鱼鳞预处理：

A，鱼鳞脱杂蛋白：将10g干净的草鱼鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为100g/L的氯化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱杂蛋白鱼鳞。

B，鱼鳞脱脂：将脱杂蛋白鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，于4℃浸泡12h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱脂鱼鳞。

C，鱼鳞脱色：将脱脂鱼鳞置于锥形瓶中，加入150mL质量浓度为0.5～1％的过氧化氢溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱色鱼鳞。

D，鱼鳞脱灰：将脱色鱼鳞置于锥形瓶中，加入120～140mL质量浓度为2～4％的柠檬酸溶液，于4℃浸泡6h后过滤，分别用自来水、蒸馏水清洗数次，得脱灰鱼鳞，鱼鳞灰分脱除率达97.53％，脱灰后鱼鳞重8.5g。

2)鱼鳞脱胶：将步骤1)得到的鱼鳞用200mL0.5mol/L的柠檬酸溶液4℃下浸泡提取24h后过滤，得到6.84g残渣。

3)鱼鳞角蛋白第一次提取：向步骤2)得到的鱼鳞残渣中加入100mL质量浓度为7％的氢氧化钠溶液于60℃反应30min后过滤得鱼鳞角蛋白提取液，用浓盐酸调节提取液pH值至等电点，静置30min，待角蛋白完全沉淀后置于离心机中4000～5000r/min离心20min，弃去上清液，得到纯净的米白色沉淀即为鱼鳞角蛋白；所得角蛋白沉淀用5mL质量浓度为2～4％氢氧化钠溶液溶解后转入透析袋中对蒸馏水透析3天，每隔4h换水一次；纯化后的角蛋白溶液转入平皿中，覆膜，-20℃冷冻过夜后置于真空冷冻干燥机中冻干，得到干燥的角蛋白粉末0.43g，角蛋白得率4.3％；

4)鱼鳞角蛋白第二次提取：向步骤3)得到的残渣中加入20倍残渣重量的0.01mol/L的氢氧化钠溶液及3％残渣重的碱性蛋白酶，于60℃水浴锅中反应3h后取出，过滤，滤液于离心机中4000r/min离心20min，上清液加入浓盐酸调pH至角蛋白等电点，静置30min待角蛋白沉淀完全后于离心机中4000r/min离心20min，沉淀用适量提取剂溶解后装入透析袋中，对蒸馏水透析3d，每4h换水一次，透析完成后经冷冻干燥得0.01g成品，角蛋白得率0.1％；

经测定，本实施例提取的角蛋白，其含量为99％，纯度较高，其分子量在48KD左右，分子结构保存完整。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。