一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法
阅读说明：本技术 一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法 (Preparation method of mesenchymal stem cells derived from early-stage developmental mesoderm ) 是由 韦丹 朱学义 张云国 唐成 王迎耀 薛晓锋 于 2020-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法,包括清洗、酶解、过滤、原代培养、传代培养、诱导分化和冷冻保存。本发明的有益效果是：提高干细胞的分离效率,使干细胞加热和冷藏过程中温度变化更加平和,避免细胞提取过程中的温度改变使细胞失活,降低细胞的提取率的问题,能够提高间充质干细胞的分离速度,多聚赖氨酸确保其在分离过程中保证纯度,且促进分离后的贴壁生长。(The invention discloses a preparation method of mesenchymal stem cells derived from early-stage developmental mesoderm, which comprises the steps of cleaning, enzymolysis, filtering, primary culture, subculture, induced differentiation and cryopreservation. The invention has the beneficial effects that: the separation efficiency of the stem cells is improved, the temperature change in the heating and refrigerating processes of the stem cells is smoother, the problems that the cells are inactivated due to the temperature change in the cell extraction process and the extraction rate of the cells is reduced are solved, the separation speed of the mesenchymal stem cells can be improved, the polylysine ensures that the purity of the mesenchymal stem cells is ensured in the separation process, and the adherent growth after separation is promoted.)
技术领域
本发明涉及一种细胞制备方法，具体为一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，属于细胞制备技术领域。
背景技术
间充质干细胞是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类具有多向分 化潜能的干细胞，可以诱导分化为骨骼肌、平滑肌、骨、软骨、脂 肪、心肌细胞、神经细胞及造血干细胞等多种类型细胞，并且外源基因易于导入和表达，是潜在的基因治疗和干细胞研究的靶细胞，人脐带间充质干细胞因其来源广泛、易于获取、增殖能力强、不涉 及伦理问题等优点，可作为新型的种子细胞。
研究证实，人脐带间充质干细胞及其诱导后的胰岛样细胞均不表达 移植排斥相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40、CD40L,表明人脐带间充质干细胞诱导前后均为低免疫原性，细胞移植后不会产生免 疫排斥反应，这为人脐带间充质干细胞诱导前后的移植治疗提供理 论基础，从而可以作为移植治疗糖尿病的细胞来源。
以往的干细胞提取方法提取出的细胞可能存在基因缺陷，容易影响接受者的健康，同时细胞提取过程中的温度改变容易使细胞失活，存在降低细胞的提取率的问题。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，包括以下步骤：
步骤A：清洗，将脐带提取出来，用蒸馏水清洗脐带，并用消过毒的海绵擦拭；
步骤B：酶解，取出脐带进行粉碎处理，并使用浓度为1％胶原酶进行酶解，时间为7小时；
步骤C：过滤，向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水，使用筛网进行初步过滤，然后倒入差速分离机中进一步过滤；
步骤D：原代培养，将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养，釆用克隆悬浮法，制备新型培养液进行体外扩增培养直至第三代；
步骤E：传代培养，更换无血清培养基，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇；
步骤F：诱导分化，将第三代的细胞提取出来，并利用平板划线法将其接种到分化培养基上进行培养；
步骤G：冷冻保存，将制备的细胞进行冷冻低温保存。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤A中，选取的脐带在酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏，冷藏持续时间为2～6个月。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤D中，干细胞在体外扩增培养过程中采用克隆悬浮法，即每个培养板上每个孔加入等量的细胞悬液，带神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，神经干细胞克隆后传代培养大小为200卩m，其培养液为DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF无血清培养基，原代培养细胞达到85%融合时,采用0. 25%胰蛋白酶在37°C的环境下消化30min。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤C中，利用台式离心机和生物安全柜恒温磁力搅拌机分离细胞，且离心时方法为lOOOrpm，5min，且在分离时加入多聚赖氨酸。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤F中，在分化过程中采用多能干细胞分化基础培养基和添加剂混合，其中每10mL添加剂与500mL分化基础培养基彻底混匀即为人多能干细胞分化培养基（AC-1001002），人多能干细胞分化培养基可在2-8℃稳定储存2-3周。
本发明的有益效果是：该来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法设计合理：
1、选取的脐带在酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏，冷藏持续时间为2～6个月，提高干细胞的分离效率，使干细胞加热和冷藏过程中温度变化更加平和，避免细胞提取过程中的温度改变使细胞失活，降低细胞的提取率的问题；
2、干细胞在体外扩增培养过程中采用克隆悬浮法，即每个培养板上每个孔加入等量的细胞悬液，带神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，神经干细胞克隆后传代培养大小为200卩m，其培养液为DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF无血清培养基，原代培养细胞达到85%融合时,采用0. 25%胰蛋白酶在37°C的环境下消化30min，能够避免分选后细胞的活力受到影响，且简化培养流程，降低培养成本；
3、利用台式离心机和生物安全柜恒温磁力搅拌机分离细胞，且离心时方法为lOOOrpm，5min，且在分离时加入多聚赖氨酸，能够提高间充质干细胞的分离速度，多聚赖氨酸确保其在分离过程中保证纯度，且促进分离后的贴壁生长；
4、在分化过程中采用多能干细胞分化基础培养基和添加剂混合，其中每10mL添加剂与500mL分化基础培养基彻底混匀即为人多能干细胞分化培养基（AC-1001002），人多能干细胞分化培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，方便干细胞进行完全的分化，且不影响细胞的表达，保证细胞活性，并减少对接收者的健康影响。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，包括以下步骤：
步骤A：清洗，将脐带提取出来，用蒸馏水清洗脐带，并用消过毒的海绵擦拭；
步骤B：酶解，取出脐带进行粉碎处理，并使用浓度为1％胶原酶进行酶解，时间为7小时；
步骤C：过滤，向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水，使用筛网进行初步过滤，然后倒入差速分离机中进一步过滤；
步骤D：原代培养，将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养，釆用克隆悬浮法，制备新型培养液进行体外扩增培养直至第三代；
步骤E：传代培养，更换无血清培养基，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇；
步骤F：诱导分化，将第三代的细胞提取出来，并利用平板划线法将其接种到分化培养基上进行培养；
步骤G：冷冻保存，将制备的细胞进行冷冻低温保存。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤A中，选取的脐带在酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏，冷藏持续时间为2～6个月，提高干细胞的分离效率，使干细胞加热和冷藏过程中温度变化更加平和，避免细胞提取过程中的温度改变使细胞失活，降低细胞的提取率的问题。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤D中，干细胞在体外扩增培养过程中采用克隆悬浮法，即每个培养板上每个孔加入等量的细胞悬液，带神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，神经干细胞克隆后传代培养大小为200卩m，其培养液为DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF无血清培养基，原代培养细胞达到85%融合时,采用0. 25%胰蛋白酶在37°C的环境下消化30min，能够避免分选后细胞的活力受到影响，且简化培养流程，降低培养成本。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤C中，利用台式离心机和生物安全柜恒温磁力搅拌机分离细胞，且离心时方法为lOOOrpm，5min，且在分离时加入多聚赖氨酸，能够提高间充质干细胞的分离速度，多聚赖氨酸确保其在分离过程中保证纯度，且促进分离后的贴壁生长。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤F中，在分化过程中采用多能干细胞分化基础培养基和添加剂混合，其中每10mL添加剂与500mL分化基础培养基彻底混匀即为人多能干细胞分化培养基（AC-1001002），人多能干细胞分化培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，方便干细胞进行完全的分化，且不影响细胞的表达，保证细胞活性，并减少对接收者的健康影响。
工作原理：在使用该来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法时，首先获取脐带组织，并进行清洗酶解，以获得脐带细胞，然后对所获得的脐带细胞进行原代培养，以能够在体外扩增培养直至第三代，并进行传代培养，直至产生细胞簇，最后进行诱导分化，以制备间充质干细胞，
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。