具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项（个）”，或，“a，b和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a，b，c，a-b（即a和b），a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是µg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

术语“DMEM/F12”为“Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12”的缩写，是DMEM 和 Ham's F-12的 1:1 混合物，是一种广泛使用的基础培养基。

本申请实施例第一方面提供一种脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加物；其中，基础培养基包括DMEM/F12培养基；添加物包括转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物。

本申请实施例第一方面提供的脂肪间充质干细胞的无血清培养基，不含血清，包括DMEM/F12基础培养基和添加剂，该添加剂同时包含有转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物。其中，DMEM/F12基础培养基通过与转铁蛋白配合，为脂肪间充质干细胞提供足够的营养物质，促进细胞生长。重组人胰岛素能够促进脂肪间充质干细胞的增殖，提升干细胞体外培养扩增速率。纤连蛋白对促进脂肪间充质干细胞贴壁、增殖和伸展，以及修复损伤细胞具有重要作用。成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物能够相互协同促进干细胞的增殖，提升体外培养扩增速度。而芦荟提取物具有杀菌、抑菌、提供营养和修复细胞等作用，能提高无血清培养基的抗病原微生物作用，提高脂肪间充质干细胞的存活率。本申请实施例无血清培养基用于培养脂肪间充质干细胞，通过各组分的协同配合作用，不但能促进脂肪干细胞的生长和增殖，而且能够降低细胞损伤，提高细胞的存活率，从而提高脂肪干细胞体外扩增能力。另外，本申请实施例培养基不含血清，且添加了党参、黄芪、芦荟等植物制剂，无异源性污染，不存在引起排斥反应的潜在安全隐患，培养基性能稳定，质量可靠，符合临床应用的安全性要求。

在一些实施例中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加物由转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物组成。本申请实施例无血清培养基，仅含有DMEM/F12培养基和转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物，不含其他组分，通过这些组分的协同配合作用即可有效提高脂肪间充质干细胞的体外生长和增殖能力，降低干细胞的损伤，提高细胞存活率。尤其是培养基中黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物，通过这三种添加剂的协同配合作用可有效提高脂肪间充质干细胞的增殖和存活率。具体的，黄芪甲苷可刺激脂肪间充质干细胞分泌细胞生长因子，不仅可使脂肪间充质干细胞的生长增殖速度得到进一步的提高，同时在维持干细胞多分化潜能与自我更新能力的情况下延缓细胞衰老。党参提取物，一方面可增强细胞的新陈代谢，协同黄芪甲苷促进神经干细胞快速大量增殖，另一方面可提高无血清培养基的抗病原微生物作用，还能使神经干细胞在增殖的过程中进行缓慢修复，维持细胞活性。芦荟提取物，不但可以提高脂肪间充质干细胞的存活率，而且具有杀菌、抑菌、提供营养和修复细胞等作用，能提高无血清培养基的抗病原微生物作用。

在一些实施例中，无血清培养基中，转铁蛋白的浓度为8~22μg/mL，重组人胰岛素的浓度为10~25μg/mL，成纤维细胞生长因子的浓度为10~30ng/mL，纤连蛋白的浓度为50~80μg/mL，黄芪甲苷的浓度为8~15mg/mL，党参提取物的浓度为2~10mg/mL，芦荟提取物的浓度为5~15mg/mL。本申请实施例无血清培养基中，各添加剂的上述浓度范围使得各组分之间有更好的协同配合作用，通过这些浓度范围的组分的协同配合作用，可更好的提高脂肪间充质干细胞的体外生长和增殖能力，降低干细胞的损伤，提高细胞存活率。如转铁蛋白主要维持细胞内的铁平衡，对于细胞而言，并不是铁越多越好，而应当是在适当的时间获得适量的铁。如果转铁蛋白添加量过高，细胞内的铁过多，也跟细胞外环境一样，铁会诱导产生破坏力极强的羟基自由基；而如果转铁蛋白添加量过低，细胞内铁过少，则不足以维持细胞的生长和增殖。重组人胰岛素是用来调控大部分细胞生长和分化的关键因子，若是培养基中重组人胰岛素浓度过浓度过高，则会出现细胞代谢异常，抑制细胞的生长分化，可能会出现形态异常和生长速率紊乱的现象；而若是培养基中重组人胰岛素浓度过低，就会阻碍细胞的生长分化，使细胞生长缓慢。若细胞成纤维细胞生长因子的浓度过高，则会出现细胞增殖减弱，促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走，甚至抑制现象；若成纤维细胞生长因子的浓度过低，则不能够促进新细胞形成，不能修复损害的细胞，不能使细胞正常贴壁生长造成细胞生长缓慢。纤连蛋白是一种主要的细胞粘附分子，在细胞纤维基质中发挥结构和粘附性作用，若纤连蛋白如果浓度过高，则会细胞可能会出现形态异常和生长速率紊乱的现象；若纤连蛋白浓度过低，则会降低细胞贴壁率，降低细胞代谢水平，延长细胞生长时间或者是停止生长。黄芪甲苷具有作为促生长剂的作用，若黄芪甲苷浓度过高，则不利于细胞的代谢，影响细胞的迁移和存活，同时对细胞的分化有抑制作用；若黄芪甲苷浓度过低，则不能起到对细胞营养保健的作用，也就限制了正常细胞的生长，阻碍细胞的增殖。党参提取物有促进细胞增殖和细胞凋亡作用，并且提高细胞活性有抗缺氧作用，若党参提取物浓度过高，则会导致细胞增殖代谢异常；若党参提取物浓度过低，则会降低细胞高度的自我更新能力和分化潜力。芦荟提取物具有保健、抗衰老、杀菌，消炎作用，可以防止细胞老化，拥有75种元素细胞所需物质几乎完全吻合；若芦荟提取物浓度过高，在一定程度上增殖代谢紊乱，出现异常生长情况；若芦荟提取物浓度低，则细胞增殖活性和胶原蛋白合成降低。

在一些优选实施例中，无血清培养基中，转铁蛋白的浓度为10~20μg/mL，重组人胰岛素的浓度为12~22μg/mL，成纤维细胞生长因子的浓度为12~25ng/mL，纤连蛋白的浓度为55~75μg/mL，黄芪甲苷的浓度为10~13mg/mL，党参提取物的浓度为5~10mg/mL，芦荟提取物的浓度为10~15mg/mL。本申请实施例无血培养基中，上述浓度范围的添加剂组分使得各组分之间有更好的协同配合作用。

在一些具体实施例中，无血清培养基中，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，重组人胰岛素的浓度为20μg/mL，成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/mL，纤连蛋白的浓度为70μg/mL，黄芪甲苷的浓度为12mg/mL，党参提取物的浓度为10mg/mL，芦荟提取物的浓度为12mg/mL。本申请实施例无血清培养基中，各添加剂组分在该浓度条件下对脂肪间充质干细胞表现出最佳的体外生长和增殖能力，以及最佳的细胞存活率。

本申请脂肪间充质干细胞的无血清培养基可通过以下实施例方法制得。

本申请实施例第二方面提供一种脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S10. 分别获取转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物；

S20. 将转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物与DMEM/F12培养基进行混合处理，得到脂肪间充质干细胞的无血清培养基。

本申请实施例第二方面提供的脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，分别获取转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物培养基添加剂后，与DMEM/F12基础培养基进行混合处理，便可得到脂肪间充质干细胞的无血清培养基。制备工艺简单，效率高，适用于商业化大规模生成和应用。且制备的脂肪间充质干细胞的无血清培养基，通过DMEM/F12基础培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物等各组分的协同配合作用，不但能促进脂肪干细胞的生长和增殖，而且能够降低细胞损伤，提高细胞的存活率，从而提高脂肪干细胞体外扩增能力。

在一些实施例中，本申请实施例制备的脂肪间充质干细胞的无血清培养基为液体培养基，仅包含DMEM/F12培养基和转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物添加剂。

在另一些实施例中，脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法还包括步骤：在包含有DMEM/F12培养基和转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物等添加剂的无血清培养基中，添加琼脂或明胶等成分，使无血清培养基成为固体培养基。

在一些实施例中，上述步骤S10中，获取党参提取物的步骤包括：

S11. 取党参药材，采用水煮沸党参药材，收集滤液，重复1~3次，合并滤液，得到提取物；

S12. 采用乙醇溶液对提取物进行沉淀处理，对上清液进行分离纯化，得到党参提取物。

本申请实施例通过对党参药材用水煮沸1~3次，将党参药材中活性物质提取到滤液中，然后采用乙醇提取滤液中的用于无血清培养基中的活性物质，通过对乙醇沉淀处理的上清液进行分离纯化，即得到党参提取物。

本申请实施例通过对党参提取条件进行优化，通过设置合理的提取步骤以及添加合适用量的水和乙醇，党参提取物的提取率更高，操作简单、成本低，为今后更进一步系统的研究与开发党参提取物打下来良好的基础。

在一些实施例中，上述步骤S11中，煮沸党参药材的步骤中，党参药材与水的体积比为1：（6~8），煮沸党参药材的水用量充分确保了对党参中活性物质的提取。

在一些实施例中，上述步骤S12中，沉淀处理的步骤包括：采用与提取物等体积且浓度不低于90%的乙醇溶液对提取物进行沉淀处理；乙醇溶液的该浓度及体积配比，充分确保了乙醇对滤液中活性成分的提取效果。

在一些实施例中，上述步骤S12中，对上清液进行分离纯化的步骤包括：加热回收上清液中乙醇，充分去除上清液中乙醇溶剂后，重新溶解回收物，并调节pH值为7.0~7.4，该pH条件更有利于对脂肪间充质干细胞的培养、生长、增殖，提高干细胞存活率，并进行过滤去除杂质成分，避免杂质成成分对脂肪间充质干细胞增殖的影响，备用。

在一些具体实施例中，采用与提取物等体积且浓度95%的乙醇溶液对提取物进行沉淀处理，加热回收上清液中乙醇，充分去除上清液中乙醇溶剂后，重新溶解回收物，配成浓度1kg/L的药液，并调节pH值为7.0~7.4，滤膜过滤，-20℃保存备用。

在一些实施例中，获取黄芪甲苷的步骤包括：

S13. 取黄芪药材，采用温度为50~60℃的水浸泡黄芪药材，重复1~3次，收集滤液；

S14. 向收集到的滤液中添加碳酸钠溶液，在温度为50~70℃的条件下热处理后，添加第二乙醇分离得到醇提取物，干燥得到黄芪甲苷。

本申请实施例采用温水浸泡黄芪药材，提取黄芪药材中的活性物质，然后向滤液中添加碳酸钠溶液后在50~70℃条件下热处理，纯化滤液中活性物质，再用乙醇分离提取，得到黄芪甲苷。本申请实施例黄芪甲苷的提取方法，避免了温度过高、时间过长，导致黄芪甲苷等活性物质损失或者失活的风险。通过设置合理的提取步骤以及添加合适用量的水、碳酸钠溶碳酸钠溶、乙醇，提取工艺不仅操作过程简便，有机溶剂用量少，而且工艺比较稳定，提取率高。

在一些实施例中，上诉步骤S13中，浸泡黄芪药材的步骤中，黄芪药材与水的体积比为1：（4~5倍），浸泡时间为1~3小时，确保充分提取黄芪药材中黄芪甲苷等活性物质。

在一些实施例中，上诉步骤S14中，碳酸钠溶液的质量百分浓度为5~8%。在一些实施例中，碳酸钠溶液的添加量为滤液体积的1~3倍。

在一些实施例中，热处理的时间为6~8小时。

在一些实施例中，第二乙醇的浓度不低于80%，第二乙醇与热处理后的产物的体积比为1：（1.5~3）。

本申请上述实施例的提取条件有效确保了对滤液中黄芪甲苷等活性物质的充分分离纯化。

在一些具体实施例中，获取黄芪甲苷的步骤包括：取粉碎烘干后的黄芪，加入药材重量的4~5倍的温水（50℃~60℃）浸泡过滤，得到第一次水提取物，重复3次，收集滤液。向收集到的滤液中加入2倍体积的5％~8％碳酸钠溶液，60℃左右加热6~8小时，得加热后的溶液；向加热后的溶液中加入乙醇，得到醇提取物；乙醇溶液的浓度不低于80%，乙醇溶液与提取物的体积比为1：2。将得到的醇提取物干燥，得到黄芪甲苷提取物。

本申请实施例通过对黄芪粉用温水浸泡3次，保证活性成分充分溶解到水中，提高水提的效果。碳酸钠溶液中碳酸钠的质量分数为5％-8％，碳酸钠溶液与滤液的体积比为2:1，从而进一步提高黄芪甲苷提取物的含量，加热的时间为6-8小时，加热的温度为60℃。从而避免温度过高、时间过长，导致黄芪甲苷等活性物质损失。向加热后的溶液中加入乙醇，得到醇提取物，然后进行干燥即得到黄芪甲苷提取物。通过设置合理的提取步骤以及添加合适用量的水、碳酸钠溶碳酸钠溶乙醇，提取工艺不仅操作过程简便，有机溶剂用量少，而且工艺比较稳定，提取率高。

在一些实施例中，获取芦荟提取物的步骤包括：

S15. 获取新鲜的芦荟叶，去除芦荟叶的表皮后，进行破碎处理，得到破碎后的芦荟；

S16. 对破碎后的芦荟进行蒸汽处理后，冲洗得到混合液，过滤得到芦荟提取物。

本申请实施例芦荟提取物的提取方法，通过破碎、蒸汽处理、冲洗等步骤，对芦荟叶中多糖等水溶性活性成分有效提取，在保证提取率的前提下有效缩短提取时间，节省用水，不使用有机溶剂，环保又高效。所得芦荟取液具有良好的保湿性能，并具有一定的抗氧化活性以及促细胞增殖活性。

在一些实施例中，上述步骤S16中，蒸汽处理的条件包括：在温度为100~120℃，蒸汽量为破碎后的芦荟的重量的15~30%的条件下处理10~30分钟。进一步提高芦荟提取物的得率以及芦荟提取物的含量，同时也起到杀菌消毒作用。

在一些实施例中，上述步骤S16中，冲洗采用喷淋的方式，水用量为破碎后的芦荟的重量的70~80%，确保对芦荟胶液充分提取和杀菌。

在一些实施例中，上述步骤S16中，过滤的处理步骤包括：对混合液采用不低于300目的筛网过滤后，采用孔径不大于0.22μm的滤膜对滤液进行过滤，除去芦荟果肉，得到芦荟提取物。

在一些具体实施例中，获取芦荟提取物的步骤包括：取多年生芦荟叶，处理后去皮切成小块，边长不超过1.0cm。将切好的芦荟放入密闭容器中，通入110℃蒸气处理20分钟，其中蒸气量为芦荟丁重量的20％。蒸气处理结束后，采用喷淋的方式水洗芦荟丁得到混合液，其中水用量为芦荟丁重量的75％。地混合液经300目的筛网过滤，收集后的滤液经0.22μm滤膜过滤，滤液即为芦荟提取物。

本申请实施例通过对芦荟叶去皮切小块，是为了之后提高为芦荟提取物效果。将切好的芦荟放入密闭容器中，通入110℃蒸气处理20分钟，其中蒸气量为芦荟丁重量的20％，是为了而进一步提高芦荟提取物的得率以及芦荟提取物的含量，同时也起到杀菌消毒作用。110℃蒸气处理20分钟，从而避免温度过高、时间过长，导致黄芦荟提取物活性物质大量损失。蒸气处理结束后，采用喷淋的方式水洗芦荟丁得到混合液，其中水用量为芦荟丁重量的75％这样保混合液不过于粘稠，方便筛网过滤，收集后的滤液经0.22μm滤膜过滤，滤液即为芦荟提取物。

本申请实施例第三方面提供一种无血清培养基在脂肪间充质干细胞培养中的应用。

本申请实施例第三方面提供的无血清培养基在脂肪间充质干细胞培养中的应用，该无血清培养基同时包含有DMEM/F12基础培养基和转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物等添加剂，通过各组分的协同配合作用，不但能促进脂肪干细胞的生长和增殖，而且能够降低细胞损伤，提高细胞的存活率，从而提高脂肪干细胞体外扩增能力。

为使本申请上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本申请实施例脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

以下实施例和对比例中采用的各组分的具体来源如下：

DMEM/F12培养基，采购于Thermo Fisher公司。

胎牛血清，采购于杭州江滨生物技术公司。

转铁蛋白，采购于sigma公司。

重组人胰岛素，采购于采购于sigma公司。

成纤维细胞生长因子，采购于sigma公司。

纤连蛋白，采购于sigma公司。

人脂肪间充质干细胞，采购于深圳保信亚太公司提供。

明胶，采购于sigma公司。

0.25%胰酶-EDTA，采购于sigma公司。

四甲基偶氮唑盐MTT，采购于sigma公司。

人间充质干细胞培养基，采购于武汉普诺赛生命科技公司。

以下实施例中党参提取物的制备步骤包括：

水煮醇沉法制备：取党参药材，分别采用8倍和6倍体积水依次煮沸党参药材，过滤并浓缩滤液，合并2次滤液。用95%乙醇等体积沉淀1次，取上清，加热回收乙醇至尽，配成浓度1kg/L的药液，调PH7.0，滤膜过滤，-20℃保存备用。实验时稀释至所需浓度。

以下实施例中黄芪甲苷的制备步骤包括：

获取黄芪甲苷的步骤包括：

取粉碎烘干后的黄芪，加入药材重量的4~5倍的温水（50℃~60℃）浸泡过滤，得到第一次水提取物，重复3次，收集滤液。向收集到的滤液中加入2倍体积的5％~8％碳酸钠溶液，60℃左右加热6~8小时，得加热后的溶液；向加热后的溶液中加入乙醇，乙醇溶液的浓度不低于80%，乙醇溶液与提取物的体积比为1：2，得到醇提取物，醇提取物干燥，得到黄芪甲苷。配成浓度1kg/L的药液，滤膜过滤，-20℃保存备用，实验时稀释至所需浓度。

以下实施例中芦荟提取物的制备步骤包括：

取多年生芦荟叶，处理后去皮切成小块，边长不超过1.0cm。将切好的芦荟放入密闭容器中，通入110℃蒸气处理20分钟，其中蒸气量为芦荟丁重量的20％。蒸气处理结束后，采用喷淋的方式水洗芦荟丁得到混合液，其中水用量为芦荟丁重量的75％。混合液经300目的筛网过滤，收集后的滤液经0.22μm滤膜过滤，滤液即为芦荟提取物。配成浓度1kg/L的药液，-20℃保存备用，实验时稀释至所需浓度。

实施例1

一种脂肪间充质干细胞有/无血清培养基，包括DMEM/F12培养基，终浓度为8μg/mL的转铁蛋白，10μg/mL的重组人胰岛素，10ng/mL的成纤维细胞生长因子，50μg/mL的纤连蛋白，黄芪甲苷的浓度分别为6mg/l、12mg/l、24mg/l、48mg/l和96mg/l。

实施例2

一种脂肪间充质干细胞有/无血清培养基，包括DMEM/F12培养基，终浓度为15μg/mL的转铁蛋白，20μg/mL的重组人胰岛素，20ng/mL的成纤维细胞生长因子，70μg/mL的纤连蛋白，党参提取物的浓度分别为5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l和60mg/l 。

实施例3

一种脂肪间充质干细胞有/无血清培养基，包括DMEM/F12培养基，终浓度为22μg/mL的转铁蛋白，25μg/mL的重组人胰岛素，30ng/mL的成纤维细胞生长因子，80μg/mL的纤连蛋白，芦荟提取物的浓度分别为4mg/l、8mg/l、12mg/l、16mg/l和20mg/l 。

实施例4

一种脂肪间充质干细胞有/无血清培养基，包括DMEM/F12培养基，终浓度为22μg/mL的转铁蛋白，25μg/mL的重组人胰岛素，30ng/mL的成纤维细胞生长因子，80μg/mL的纤连蛋白，12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物、12mg/l的芦荟提取物。

对比例1

一种脂肪间充质干细胞有/无血清培养基，包括DMEM/F12培养基，终浓度为8μg/mL的转铁蛋白，10μg/mL的重组人胰岛素，10ng/mL的成纤维细胞生长因子，50μg/mL的纤连蛋白。

进一步的，为了验证本申请实施例的进步性，对实施例1~4和对比例1提供的有/无血清培养基分别进行了如下性能测试：

1、分别采用实施例1~4和对比例1提供的有/无血清培养基，培养脂肪间充质干细胞，培养方法包括以下步骤：

①将质量浓度0.2％的明胶溶液，加入到待包被的培养皿中，37℃孵育1小时或者2-8℃孵育过夜，得到预包被明胶的培养皿。在孵育过程中避免基质干掉，使用时弃掉基质接种细胞即可。

②按照接种密度为1.0×10⁴/cm²个活细胞/cm²将脂肪间充质干细胞接种于预包被明胶的培养皿中，分别加入实施例1~4或者对比例1提供的无血清培养基，放入培养箱(37℃，5％CO₂)中进行培养，24小时后弃去原培养基，更换新鲜培养基，之后每24h更换培养基一次。

③显微镜下观察，待细胞长到80％融合度后，采用浓度为0.25％的胰酶-EDTA溶液消化，按1:3比例传代。

2、黄芪甲苷对人脂肪间充质干细胞生长增殖能力对比试验

以实施例1脂肪间充质干细胞有/无血清培养基为受试培养基，同时以对比例1的有/无血清的间充质干细胞培养基对照培养基，通过MTT法检测不同培养基对脂肪间充质干细胞增殖的影响，步骤如下：

①复苏P1代脂肪间充质干细胞，细胞分6组接种至96孔板中，每组2孔，此时细胞为P2代。6组细胞分别使用实施例1和对比例1培养基进行培养与传代。当细胞传至P3代时，胰酶消化、收集6组细胞，每组收集1孔，分别接种至96孔板中。

②细胞接种到96孔板时，每孔1000个，每组接种5孔，共接种6块96孔板，各组依然用培养基实施例1和对比例1培养基分别进行培养，用MTT法在第1、3、5、7、9天检测细胞存活和增殖能力。

③在每孔内加入5mg/ml的MTT试剂50μl，继续培养4h，弃去MTT试剂，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min，用酶联免疫检测仪法测定吸光度A值(490nm)，每个样品均重复测量6次，取平均值。

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基中的增殖情况如下表1和图1所示：

从表1及图1中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（黄芪甲苷浓度分别为6mg/l、12mg/l、24mg/l、48mg/l、96mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞有血清培养基条件下，B组即添加12mg/l的黄芪甲苷表现出良好的细胞增殖能力，说明在有血清培养基中添加12mg/l的黄芪甲苷能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表1：MTT法检测有血清培养基中不同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在无血清的培养基中的增殖情况如下表2和图2所示：

从表2及图2中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（黄芪甲苷浓度分别为6mg/l、12mg/l、24mg/l、48mg/l、96mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下，B组即添加12mg/l黄芪甲苷的培养基表现出良好的细胞增殖能力，说明在无血清培养基中添加12mg/l的黄芪甲苷能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表2：MTT法检测无血清培养基中不同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基和无血清的培养基中的增殖情况如下表3和图3所示：

从表3及图3中的数据可以看出，比较CON组1（有血清）、对比CON组2（无血清）、A组（12mg/l的黄芪甲苷有血清）和B组（12mg/l的黄芪甲苷有血清）发现，在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下B组即添加12mg/l的黄芪甲苷表现的增殖能力最强。

表3：MTT法检测不同培养基中相同同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

3、党参提取物对人脂肪间充质干细胞生长增殖能力对比试验

以实施例2脂肪间充质干细胞有/无血清培养基为受试培养基，同时以对比例1的有/无血清的间充质干细胞培养基对照培养基，通过MTT法检测不同培养基对脂肪间充质干细胞增殖的影响，步骤如下：

①复苏P1代脂肪间充质干细胞，细胞分6组接种至96孔板中，每组2孔，此时细胞为P2代。6组细胞分别使用实施例2和对比例1培养基进行培养与传代。当细胞传至P3代时，胰酶消化、收集6组细胞，每组收集1孔，分别接种至96孔板中。

②细胞接种到96孔板时，每孔1000个，每组接种5孔，共接种6块96孔板，各组依然用培养基实施例2和对比例1培养基分别进行培养，用MTT法在第1、3、5、7、9天检测细胞存活和增殖能力。

③在每孔内加入5mg/ml的MTT试剂50μl，继续培养4h，弃去MTT试剂，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min，用酶联免疫检测仪法测定吸光度A值(490nm)，每个样品均重复测量6次，取平均值。

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基中的增殖情况如下表4和图4所示：

从表4及图4中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（党参提取物浓度分别为5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞有血清培养基条件下，B组即添加10mg/l的党参提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在有血清培养基中添加10mg/l的党参提取物能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表4：MTT法检测有血清培养基中不同浓度的党参提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在无血清的培养基中的增殖情况如下表5和图5所示：

从表5及图5中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（党参提取物浓度分别为5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下B组即添加10mg/l的党参提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在无血清培养基中添加10mg/l的党参提取物能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表5：MTT法检测无血清培养基中不同浓度的党参提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基和无血清的培养基中的增殖情况如下表6和图6所示：

从表6及图6中的数据可以看出，比较CON组1（有血清）、对比CON组2（无血清）、A组（10mg/l的党参提取物有血清）和B组（10mg/l的党参提取物无血清）发现，在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下B组即添加10mg/l的党参提取物表现的增殖能力最强。

表6：MTT法检测不同培养基中相同同浓度的党参提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

4、芦荟提取物对人脂肪间充质干细胞生长增殖能力对比试验

以实施例3脂肪间充质干细胞有/无血清培养基为受试培养基，同时以对比例1的有/无血清的间充质干细胞培养基对照培养基，通过MTT法检测不同培养基对脂肪间充质干细胞增殖的影响，步骤如下：

①复苏P1代脂肪间充质干细胞，细胞分6组接种至96孔板中，每组2孔，此时细胞为P2代。6组细胞分别使用实施例3和对比例1培养基进行培养与传代。当细胞传至P3代时，胰酶消化、收集6组细胞，每组收集1孔，分别接种至96孔板中。

②细胞接种到96孔板时，每孔1000个，每组接种5孔，共接种6块96孔板，各组依然用培养基实施例3和对比例1培养基分别进行培养，用MTT法在第1、3、5、7、9天检测细胞存活和增殖能力。

③在每孔内加入5mg/ml的MTT试剂50μl，继续培养4h，弃去MTT试剂，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min，用酶联免疫检测仪法测定吸光度A值(490nm)，每个样品均重复测量6次，取平均值。

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基中的增殖情况如下表7和图7所示：

从表7及图7中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（芦荟提取物浓度分别为4mg/l、8mg/l、12mg/l、16mg/l、20mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞有血清培养基条件下C组即添加12mg/l的芦荟提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在有血清培养基中添加12mg/l的芦荟提取物能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表7：MTT法检测有血清培养基中不同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在无血清的培养基中的增殖情况如下表8和图8所示：

从表8及图8中的数据可以看出，比较CON组和A-E组（芦荟提取物浓度分别为4mg/l、8mg/l、12mg/l、16mg/l、20mg/l）可见：在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下C组即添加12mg/l的芦荟提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在无血清培养基中添加12mg/l的芦荟提取物能够提高脂肪间充质干细胞增殖活性。

表8：MTT法检测无血清培养基中不同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基和无血清的培养基中的增殖情况如下表9和图9所示：

从表9及图9中的数据可以看出，对比CON1组（有血清）、对比CON2组（无血清）、A组（12mg/l的芦荟提取物有血清）和B组（12mg/l的芦荟提取物无血清）发现在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下添加12mg/l的芦荟提取物表现的增殖能力最强。

表9：MTT法检测不同培养基中相同同浓度的黄芪甲苷对人脂肪来源干细胞的增殖能力

5、12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物、12mg/l的芦荟提取物及这三种混合物对人脂肪间充质干细胞生长增殖能力对比试验

以实施例4脂肪间充质干细胞有/无血清培养基为受试培养基，同时以对比例1的有/无血清的间充质干细胞培养基对照培养基，通过MTT法检测不同培养基对脂肪间充质干细胞增殖的影响，步骤如下：

①复苏P1代脂肪间充质干细胞，细胞分6组接种至96孔板中，每组2孔，此时细胞为P2代。6组细胞分别使用实施例4和对比例1培养基进行培养与传代。当细胞传至P3代时，胰酶消化、收集6组细胞，每组收集1孔，分别接种至96孔板中。

②细胞接种到96孔板时，每孔1000个，每组接种5孔，共接种6块96孔板，各组依然用培养基实施例4和对比例1培养基分别进行培养，用MTT法在第1、3、5、7、9天检测细胞存活和增殖能力。

③在每孔内加入5mg/ml的MTT试剂50μl，继续培养4h，弃去MTT试剂，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡5min，用酶联免疫检测仪法测定吸光度A值(490nm)，每个样品均重复测量6次，取平均值。

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基中的增殖情况如下表10和图10所示：

从表10及图10中的数据可以看出，比较CON组、A组（12mg/l黄芪甲苷）、B组（10mg/l党参提取物）、C组（12mg/l的芦荟提取物）和D组（分别为12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物和12mg/l的芦荟提取物的混合物）可见：在脂肪间充质干细胞有血清培养基条件下，D组即添加三种混合物提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在有血清培养基中添加12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物、12mg/l的芦荟提取物三者的混合物要比添加其中任意一种的提取物细胞增殖能力强。

表10：MTT法检测有血清培养基中最佳浓度的黄芪甲苷、党参提取物、芦荟提取物及其3种混合提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在无血清的培养基中的增殖情况如下表11和图11所示：

从表11及图11中的数据可以看出，比较CON组、A组（12mg/l黄芪甲苷）、B组（10mg/l党参提取物）、C组（12mg/l的芦荟提取物）和D组（分别为12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物和12mg/l的芦荟提取物的混合物）可见：在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下D组即添加三种混合物提取物表现出良好的细胞增殖能力，说明在无血清培养基中添加12mg/l黄芪甲苷、10mg/l党参提取物、12mg/l的芦荟提取物三者的混合物要比添加其中任意一种的提取物细胞增殖能力强。

表11：MTT法检测无血清培养基中最佳浓度的黄芪甲苷、党参提取物、芦荟提取物及其3种混合提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

脂肪间充质干细胞在有血清的培养基和无血清的培养基中的增殖情况如下表12和图12所示：

从表12及图12中的数据可以看出，对比CON1组（有血清）、对比CON2组（无血清）、A组（三者混合物有血清）和B组（三者混合物无血清）发现在脂肪间充质干细胞无血清培养基条件下添加三者混合物有血清增殖能力最强。

表12：MTT法检测不同培养基中相同同浓度的3种混合提取物对人脂肪来源干细胞的增殖能力

综上，本申请实施例提供的脂肪间充质干细胞无血清培养基，由于同时包含有DMEM/F12培养基、转铁蛋白、重组人胰岛素、成纤维细胞生长因子、纤连蛋白、黄芪甲苷、党参提取物和芦荟提取物等组分，有效提高了对脂肪间充质干细胞的培养增殖能力，提高了干细胞的存货效率。并且，当无血清培养基中添加物的终浓度分别为：转铁蛋白8-22μg/mL，重组人胰岛素10-25μg/mL，成纤维细胞生长因子10-30ng/mL，纤连蛋白50-80μg/mL，黄芪甲苷12mg/mL，党参提取物10mg/mL，芦荟提取物12mg/mL时，无血清培养基对脂肪间充质干细胞表现出最佳的增殖能力。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。