一种脂肪间充质干细胞库的构建方法
阅读说明：本技术 一种脂肪间充质干细胞库的构建方法 (Construction method of adipose-derived mesenchymal stem cell bank ) 是由 刘建丽 李明 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脂肪间充质干细胞库的构建方法,包括以下步骤：(1)对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案；(2)取离体的脂肪组织经消化、分离得到脂肪间充质干细胞；(3)将步骤(2)分离得到脂肪间充质干细胞接种在纯化培养基上,培养至细胞汇合度达到80-85%时消化,离心,向细胞中加入纯化培养基重悬,记为P0代细胞；(4)将P0代细胞采用上述纯化培养基进行传代培养,取传代培养得到的P3代细胞进行冻存,构建脂肪间充质干细胞库；本发明还具体限定了纯化培养基的组成。本发明提供的细胞库的构建方法可以充分满足脂肪间充质干细胞的科研和临床应用。(The invention discloses a method for constructing an adipose-derived mesenchymal stem cell bank, which comprises the following steps of: (1) establishing a registration file for the selected qualified in vitro fat sample donor; (2) taking isolated adipose tissues, digesting and separating to obtain adipose mesenchymal stem cells; (3) inoculating the adipose-derived mesenchymal stem cells separated in the step (2) on a purification culture medium, culturing until the cell confluence reaches 80-85%, digesting, centrifuging, adding the purification culture medium into the cells for heavy suspension, and marking as P0 generation cells; (4) subculturing the P0 generation cells by adopting the purified culture medium, freezing and storing the P3 generation cells obtained by subculturing to construct an adipose-derived mesenchymal stem cell bank; the invention also specifically defines the composition of the purification medium. The construction method of the cell bank provided by the invention can fully meet the scientific research and clinical application of the adipose-derived mesenchymal stem cells.)
技术领域
本发明涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据发育阶段的不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织，但在细胞分化调节和伦理上局限性限制了其临床应用。间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。
脂肪间充质干细胞是从脂肪组织获得的一类有多向分化潜能的间充质干细胞，其在特定诱导条件下可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。和骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞更具有稳定性和不易衰老性，是组织工程中不可多得的优质种子细胞；脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，并且取材过程对机体损伤小。脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞相比，具有更低的免疫源性，移植的时候不会被机体当作外来物而排斥，适宜自体移植、安全性能高，脂肪间充质干细胞库的建立逐渐成为近年来新的研究热点之一。
现有的脂肪间充质干细胞库的建立过程繁琐，在细胞获取过程中加入的胎牛血清等外源性血清影响细胞库中脂肪间充质干细胞的质量，因此极大的限制了脂肪间充质干细胞的临床应用。随着各个领域对干细胞需求量的增加，有必要对脂肪间充质干细胞库的建立过程进行改进，提高脂肪间充质干细胞库的建立效率，促进脂肪间充质干细胞在各个领域的广泛应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，有效提高细胞库中细胞的纯度和活性，为脂肪间充质干细胞的临床应用提供保障。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：
（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案；
（2）取离体的脂肪组织经消化、分离得到脂肪间充质干细胞；
（3）将步骤（2）分离得到脂肪间充质干细胞接种在纯化培养基上，培养至细胞汇合度达到80-85%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，记为P0代细胞；
（4）将P0代细胞采用上述纯化培养基按照1：2-3的比例进行传代培养，取传代培养得到的P3代细胞进行冻存，构建脂肪间充质干细胞库；
所述纯化培养基的组成为：基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：谷胱甘肽、D-柠檬烯、雷诺嗪、刀豆蛋白A、维生素C、亚硒酸钠、L-精氨酸。
进一步地，所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽20-25μg/mL、D-柠檬烯8.5-11.5ng/mL、雷诺嗪5.8-7.2ng/mL、刀豆蛋白A 6.5-8.9ng/mL、维生素C 1-5μg/mL、亚硒酸钠2.5-4.5ng/mL、L-精氨酸5-10μg/mL。
进一步地，所述添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽23μg/mL、D-柠檬烯10ng/mL、雷诺嗪6.5ng/mL、刀豆蛋白A 7.4ng/mL、维生素C2.5μg/mL、亚硒酸钠3ng/mL、L-精氨酸8μg/mL。
进一步地，步骤（2）将脂肪样本离心后取上层的脂肪组织，用PBS清洗后再次离心，向离心后的脂肪组织中加入1%Ⅱ型胶原酶震荡消化30min，消化完成后加入PBS稀释后离心，沉淀即为脂肪间充质干细胞。
进一步地，所述步骤（3）中分离得到的脂肪间充质干细胞在纯化培养基中的密度为1-5×106个/mL，细胞在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每2天更换一次培养基。
进一步地，步骤（3）中P0代细胞在纯化培养基中重悬后的密度为1-5×105个/mL。
进一步地，步骤（4）中取培养至融合度70-80%的P3代细胞用0.25%胰酶消化后加入PBS稀释，取部分细胞进行计数，测定细胞活率，检测细胞增殖活性、纯度及多向分化能力，将剩余细胞离心后分离上清液和细胞分离，向离心后的细胞中加入冻存液进行重悬，细胞密度为1-8×107个/mL，将冻存液分装在2mL的冻存管中，每管1mL，标记冻存日期及细胞信息档案后在液氮中进行冷冻保存。
进一步地，所述冻存液为向纯化培养基中添加1-5%的DMSO制备得到。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，在细胞库的构建过程中，为保证细胞库中细胞的质量，本发明采用的纯化培养基中添加雷诺嗪、D-柠檬烯、刀豆蛋白A等成分，一方面，雷诺嗪可有效的筛选出脂肪间充质干细胞，提高脂肪间充质干细胞的纯度，无需经过多次传代扩增即能收获大量纯度较高的脂肪间充质干细胞；另一方面，添加的D-柠檬烯和刀豆蛋白A一起协同作用提高脂肪间充质干细胞的活性，经培养可获得大量有较高增殖活性和分化潜能的脂肪间充质干细胞，并且整个过程无需添加动物血清，充分保证了脂肪间充质干细胞库中的细胞质量。
本发明的纯化培养基仅需添加1-5%含量的DMSO即可作为冻存液使用，降低了冻存液中DMSO的用量，有效的保证冻存效率。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：
（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案，年龄在20-35岁之间，包括排除有既往病史、家族遗传史、传染病史以及其他健康异常情况，并对以下项目进行体检：梅毒螺旋抗体、乙肝表面抗原、丙型肝炎抗体、转氨酶、艾滋病抗体，检查合格者方可作为脂肪组织的供体；
（2）取离体的脂肪组织分装在50mL的离心管中，1500r/min离心10min，取上层的脂肪组织，加入等体积的 PBS清洗后在1000r/min离心10min，向离心后的脂肪组织中加入1%Ⅱ型胶原酶在37℃震荡消化30min，消化完成后加入PBS稀释后再次在1000r/min离心10min，沉淀即为脂肪间充质干细胞；
（3）将步骤（1）分离得到脂肪间充质干细胞以3×106个/mL的密度接种在T75培养瓶的纯化培养基上，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每2天更换一次培养基，培养至细胞汇合度达到80%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，重悬后的密度为2×105个/mL，记为P0代细胞，
（4）将上述P0代细胞采用上述纯化培养基按照1：2的比例进行传代培养，取培养至融合度75%的P3代细胞用0.25%胰酶消化后加入PBS稀释，取部分细胞进行计数，测定细胞活率，检测细胞的增殖能力及多向分化能力，剩余细胞离心将上清液和细胞分离，向离心后的细胞中加入冻存液进行重悬，冻存液为向纯化培养基中添加3%的DMSO制备得到，冻存液中细胞密度为5×107个/mL，将冻存液分装在2mL的冻存管中，每管1mL，在液氮中进行冷冻保存构建脂肪间充质干细胞库，标记冻存日期及细胞信息档案，便于检索查询；
所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽23μg/mL、D-柠檬烯10ng/mL、雷诺嗪6.5ng/mL、刀豆蛋白A 7.4ng/mL、维生素C2.5μg/mL、亚硒酸钠3ng/mL、L-精氨酸8μg/mL。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：
（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案，年龄在20-35岁之间，包括排除有既往病史、家族遗传史、传染病史以及其他健康异常情况，并对以下项目进行体检：梅毒螺旋抗体、乙肝表面抗原、丙型肝炎抗体、转氨酶、艾滋病抗体，检查合格者方可作为脂肪组织的供体；
（2）取离体的脂肪组织分装在50mL的离心管中，1500r/min离心10min，取上层的脂肪组织，加入等体积的 PBS清洗后在1000r/min离心10min，向离心后的脂肪组织中加入1%Ⅱ型胶原酶在37℃震荡消化30min，消化完成后加入PBS稀释后再次在1000r/min离心10min，沉淀即为脂肪间充质干细胞；
（3）将步骤（1）分离得到脂肪间充质干细胞以1×106个/mL的密度接种在T75培养瓶的纯化培养基上，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每2天更换一次培养基，培养至细胞汇合度达到85%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，重悬后的密度为1×105个/mL，记为P0代细胞，
（4）将上述P0代细胞采用上述纯化培养基按照1：3的比例进行传代培养，取培养至融合度70%的P3代细胞用0.25%胰酶消化后加入PBS稀释，取部分细胞进行计数，测定细胞活率，检测细胞的增殖能力及多向分化能力，剩余细胞离心将上清液和细胞分离，向离心后的细胞中加入冻存液进行重悬，冻存液为向纯化培养基中添加3%的DMSO制备得到，冻存液中细胞密度为1×107个/mL，将冻存液分装在2mL的冻存管中，每管1mL，在液氮中进行冷冻保存构建脂肪间充质干细胞库，标记冻存日期及细胞信息档案，便于检索查询；
所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽20μg/mL、D-柠檬烯8.5ng/mL、雷诺嗪5.8ng/mL、刀豆蛋白A 6.5ng/mL、维生素C1μg/mL、亚硒酸钠2.5ng/mL、L-精氨酸5μg/mL。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：
（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案，年龄在20-35岁之间，包括排除有既往病史、家族遗传史、传染病史以及其他健康异常情况，并对以下项目进行体检：梅毒螺旋抗体、乙肝表面抗原、丙型肝炎抗体、转氨酶、艾滋病抗体，检查合格者方可作为脂肪组织的供体；
（2）取离体的脂肪组织分装在50mL的离心管中，1500r/min离心10min，取上层的脂肪组织，加入等体积的 PBS清洗后在1000r/min离心10min，向离心后的脂肪组织中加入1%Ⅱ型胶原酶在37℃震荡消化30min，消化完成后加入PBS稀释后再次在1000r/min离心10min，沉淀即为脂肪间充质干细胞；
（3）将步骤（1）分离得到脂肪间充质干细胞以5×106个/mL的密度接种在T75培养瓶的纯化培养基上，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每2天更换一次培养基，培养至细胞汇合度达到80%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，重悬后的密度为5×105个/mL，记为P0代细胞，
（4）将上述P0代细胞采用上述纯化培养基按照1： 3的比例进行传代培养，取培养至融合度80%的P3代细胞用0.25%胰酶消化后加入PBS稀释，取部分细胞进行计数，测定细胞活率，检测细胞的增殖能力及多向分化能力，剩余细胞离心将上清液和细胞分离，向离心后的细胞中加入冻存液进行重悬，冻存液为向纯化培养基中添加5%的DMSO制备得到，冻存液中细胞密度为8×107个/mL，将冻存液分装在2mL的冻存管中，每管1mL，在液氮中进行冷冻保存构建脂肪间充质干细胞库，标记冻存日期及细胞信息档案，便于检索查询；
所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽25μg/mL、D-柠檬烯11.5ng/mL、雷诺嗪7.2ng/mL、刀豆蛋白A8.9ng/mL、维生素C5μg/mL、亚硒酸钠4.5ng/mL、L-精氨酸10μg/mL。
对比例1
对比例1提供脂肪间充质干细胞库的构建方法，和实施例1的区别为省去纯化培养基中的雷诺嗪，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供脂肪间充质干细胞库的构建方法，和实施例1的区别为省去纯化培养基中的D-柠檬烯，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供脂肪间充质干细胞库的构建方法，和实施例1的区别为省去纯化培养基中的刀豆蛋白A，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供脂肪间充质干细胞库的构建方法，和实施例1的区别为省去纯化培养基中的雷诺嗪、D-柠檬烯和刀豆蛋白A，其余均和实施例1相同。
试验例
细胞活率检测：取冻存前的P3代脂肪间充质干细胞，采用台盼蓝染色法统计细胞的活率，结果如表1所示。
表1
组别
存活率
实施例1
99.28%
对比例1
97.46%
对比例2
84.97%
对比例3
86.72%
对比例4
79.83%
由表1可以看出，实施例1中细胞的存活率高于对比例1至4，复符合细胞库对细胞活性的要求，对比例1至4中分别调整了纯化培养基的组成，细胞活性有不同程度的下降。
细胞纯度检测：取收集的P3代细胞流式检测结果如表2所示。
表2
检测指标阳性率
CD105
CD90
CD73
CD59
CD44
CD13
CD34
CD14
实施例1
99.89%
99.94%
99.82%
99.95%
99.76%
99.87%
0.32%
0.18%
对比例1
98.05%
97.69%
98.21%
97.96%
97.64%
98.09%
2.04%
2.11%
对比例2
99.85%
99.92%
99.87%
99.91%
99.79%
99.83%
0.33%
0.17%
对比例3
99.80%
99.91%
99.93%
99.88%
99.81%
99.72%
0.35%
0.21%
对比例4
97.86%
97.73%
98.19%
97.92%
97.71%
98.11%
2.05%
2.09%
由表2可以看出：实施例1和对比例2、对比例3中细胞纯度较高，细胞表面阳性抗原表达率均高于99%，阴性抗原表达率均低于1%。对比例1和对比例4中细胞纯度和实施例1相比有一定程度的降低，这是因为对比例1和对比例4中省去了雷诺嗪，该成分的添加可以提高脂肪间充质干细胞的纯度。
细胞增殖能力检测：取实施例1，对比例1至4中收获的P3代脂肪间充质干细胞分解加入纯化培养基，吹打成细胞悬液，调整细胞悬液的密度为1×105个/mL，分别接种于12孔板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养连续培养7天，各取3孔用台盼兰染色进行细胞计数，取平均值，结果如表3所示。
表3
组别
细胞数量（×10<sup>5</sup>个）
实施例1
26.24
对比例1
22.51
对比例2
17.48
对比例3
19.65
对比例4
15.49
由表4可以看出经过相同的培养过程后，实施例1中的收获细胞数量最多，说明实施例1中的脂肪间充质干细胞的增殖活性最好。
脂肪间充质干细胞成骨能力检测：将实施例1，对比例1至4中收获的P3代细胞接种在12孔板中的成骨诱导培养基中（DMEM/F12培养基＋10%FBS+地塞米松80nM+胰岛素2nM+磷酸甘油10mM），细胞密度为1×105个/mL，在37℃，5%CO2的培养箱中诱导培养，培养过程中每3天进行全量换液，培养14天后弃去培养基，PBS清洗后，用4%的多聚甲醛在4℃固定过夜，弃去多聚甲醛，再用PBS清洗2次，用0.5%的茜素红染色10min，弃去染色液，水洗3遍，用显微镜观察染色情况，统计钙化面积百分比，结果如表4所示。
表4
组别
钙化面积
实施例1
42.17%
对比例1
38.41%
对比例2
30.77%
对比例3
32.59%
对比例4
28.84%
由表4可以看出实施例1的中的脂肪间充质干细胞的成骨能力较好，对比例1至4中的细胞和实施例1相比成骨能力均有不同程度的下降。
综上可知，本发明细胞库中的脂肪间充质干细胞活性好、纯度高，增殖能力强，并且具有分化潜能，可以充分满足脂肪间充质干细胞的各项科研和临床应用。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。