阅读说明：本技术 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基 (Culture medium for promoting in-vitro proliferation and differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells ) 是由 朱阳晨 赵玲 于 2020-05-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基。本发明发现,L-组氨酸衍生物5具有体外促进hUC-MSCs增值的作用,并可以诱导其成骨分化。因此,L-组氨酸衍生物5可以用于体外制备hUC-MSCs种子细胞并促进其成骨分化,具有制备成促进hUC-MSCs体外增殖并诱导其成骨分化的培养基的前景。(The invention discloses a culture medium for promoting in-vitro proliferation and differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells. The invention discovers that the L-histidine derivative 5 has the function of promoting the proliferation of the hUC-MSCs in vitro and can induce the osteogenic differentiation of the hUC-MSCs. Therefore, the L-histidine derivative 5 can be used for preparing hUC-MSCs seed cells in vitro and promoting osteogenic differentiation of the hUC-MSCs seed cells, and has the prospect of preparing a culture medium for promoting the hUC-MSCs to proliferate in vitro and inducing the osteogenic differentiation of the hUC-MSCs.)

一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及脐带间充质干细胞体外增殖和诱导分化，具体涉及一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基。

背景技术

干细胞工程指在体外对干细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成形等。其科学价值在于其诱人的应用前景，用细胞技术治疗疾病将是未来医学的发展方向。目前，干细胞工程研究的主要内容是ES细胞分离培养、定向诱导分化、基因操作、胚胎工程、核移植等，其目的是深入研究多能干细胞的分化机制，建立体外三维立体培养条件，构建不同的组织器官，开发可在体内应用的新型生物材料。

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一类具有多向分化能力和自我更新能力的间充质干细胞。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于hUC-MSCs的提取。而且，研究发现hUC-MSCs的体外扩增和多向分化能力比其他组织来源的间充质干细胞更强，非常适合用作干细胞工程中的种子细胞。

干细胞研究和应用首先需要解决的问题就是如何快速在体外获得大量干细胞种子细胞；其次需要解决的问题是如果诱导种子细胞向目标细胞分化。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中存在的不足，提供一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并促进其分化的培养基。

本发明技术方案如下：

如下化学结构的L-组氨酸衍生物在促进脐带间充质干细胞体外增殖并诱导其成骨分化方面的应用。

一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并诱导其成骨分化的培养基，该培养基中含有如下化学结构的L-组氨酸衍生物。

有益技术效果：

本发明发现，L-组氨酸衍生物5具有体外促进hUC-MSCs增值的作用，并可以诱导其成骨分化。因此，L-组氨酸衍生物5可以用于体外制备hUC-MSCs种子细胞并促进其成骨分化，具有制备成促进hUC-MSCs体外增殖并诱导其成骨分化的培养基的前景。

附图说明

图1为L-组氨酸衍生物5的化学结构式；

图2为hUC-MSCs的表型流式鉴定图；

图3为不同浓度L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的促增殖率；

图4为茜素红染色结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。

一、试验材料

DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

谷胺酰胺和双抗购自南京森贝伽生物科技有限公司。

PBS缓冲液按照配方配制后于4℃保存，24h内使用完。

Ⅳ型胶原酶和胰酶购自上海懋康生物科技有限公司，按照说明书使用。

L-组氨酸衍生物5的化学结构式如图1所示，纯度不低于98％。

二、试验方法

1、hUC-MSCs的提取培养和鉴定

使用的hUC-MSCs与专利2020104333269、2020104333714中相同，制备和鉴定方法为：

取正常足月剖腹产新生儿脐带约12cm(脐带采集后4℃保存于含1％双抗的PBS缓冲液中，6h内提取干细胞培养)，用含1％双抗的PBS缓冲液冲洗去除脐动静脉及脐带外膜，剪成约1mm³大小的组织块，置于37℃恒温震荡仪内，先后加入Ⅳ型胶原酶、胰酶分别消化60min和30min提取细胞，再用含20％FBS、25mmol/L谷胺酰胺和1％双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.0×10⁶/mL接种于细胞培养瓶内，培养4d后更换培养基，之后2～3d换液1次，待细胞80％融合时传代。取第5代细胞进行实验。

取第5代hUC-MSCs，胰酶消化，充分吹打均匀，制备成单细胞悬液，加入CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE和CD105-FITC。室温避光孵育30min，多聚甲醛固定后，流式细胞仪进行检测。

2、hUC-MSCs体外增殖

2.1分组

低浓度药物组：使用含10μM L-组氨酸衍生物5(DMSO助溶)、20％FBS、25mmol/L谷胺酰胺和1％双抗的DMEM/F12培养基培养；

高浓度药物组：使用含20μM L-组氨酸衍生物5(DMSO助溶)、20％FBS、25mmol/L谷胺酰胺和1％双抗的DMEM/F12培养基培养；

对照组：使用含20％FBS、25mmol/L谷胺酰胺和1％双抗的DMEM/F12培养基培养，培养基中添加与低、高浓度药物组等体积的DMSO溶媒。

2.2MTT法测定细胞增殖活力

取第5代hUC-MSCs，胰酶消化，充分吹打均匀，制备成单细胞悬液，以每孔4×10⁴个的浓度接种于96孔板，于5％CO₂、37℃培养箱中培养；24h后，按照上述分组更换对应的培养基，继续培养48h后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃上清，每孔加入150μLDMSO，摇床低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪490nm波长下测定各孔吸光度值(OD)，根据公式计算L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的促增殖率：

促增殖率(％)＝(药物组OD490值-对照组OD490值)÷对照组OD490值×100％。

各组5个复孔，试验平行操作3份。

3、茜素红染色测定hUC-MSCs成骨分化

取第5代hUC-MSCs，胰酶消化，充分吹打均匀，制备成单细胞悬液，以每孔5×10⁴个/mL的浓度接种于24孔板，于5％CO₂、37℃培养箱中培养；24h后，按照上述分组中的对照组和高浓度药物组(简称药物组)更换培养基继续培养，每3d换液1次。18d后，采用茜素红染色观察培养板内矿化结节形成情况。

4、数据分析

在SPSS 17.0中，数据以均值±SD表示，并进行t检验，P＜0.05说明差异有统计意义。

三、试验结果

1、hUC-MSCs的提取培养和鉴定结果

hUC-MSCs的表型鉴定流式结果如表1和图2所示，CD34-PE和CD45-PE阴性表达，CD73-PE、CD90-PE和CD105-FITC阳性表达，符合hUC-MSCs的表型特征。

表1 hUC-MSCs的表型鉴定结果

	表达率
		CD34-PE	0.35％
CD45-PE	0.47％
		CD73-PE	95.2％
CD90-PE	96.8％
		CD105-FITC	98.5％

2、L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的促增殖率

L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的促增殖率如表2和图3所示，可见L-组氨酸衍生物5具有促进hUC-MSCs体外增殖的作用，且具有剂量效应。

表2 L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的促增殖率

	促增殖率
		L-组氨酸衍生物5(10μM)	(118.2±6.9)％
L-组氨酸衍生物5(20μM)	(205.5±8.4)％

3、L-组氨酸衍生物5对hUC-MSCs的成骨诱导作用

茜素红染色结果如图4所示，对照组未见明显骨矿化结节，药物组可见明显的骨矿化结节。茜素红染色法是一种通过测定骨矿化结节程度反映成骨分化程度的方法，骨矿化结节数量越多，说明成骨分化程度越高。

上述试验结果说明，L-组氨酸衍生物5具有体外促进hUC-MSCs增值的作用，并可以诱导其成骨分化。因此，L-组氨酸衍生物5可以用于体外制备hUC-MSCs种子细胞并促进其成骨分化，具有制备成促进hUC-MSCs体外增殖并诱导其成骨分化的培养基的前景。