阅读说明：本技术 脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法 (Serum-free medium for umbilical cord mesenchymal stem cells and preparation method thereof ) 是由 张印 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及干细胞培养技术领域,涉及一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法,包括DMEM低糖培养基,还包括人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠和银杏酸。本发明制备的培养基可显著提高脐带间充质干细胞的增殖数量和增殖率,并且脐带间充质干细胞不易分化产生表型改变,较好的保护脐带间充质干细胞,并且脐带间充质干细胞贴壁的效果佳,成本较低,易于工艺化生产。(The invention relates to the technical field of stem cell culture, and relates to a serum-free culture medium for umbilical cord mesenchymal stem cells and a preparation method thereof. The culture medium prepared by the invention can obviously improve the proliferation quantity and the proliferation rate of the umbilical cord mesenchymal stem cells, the umbilical cord mesenchymal stem cells are not easy to differentiate to generate phenotype change, the umbilical cord mesenchymal stem cells are well protected, the wall-adhering effect of the umbilical cord mesenchymal stem cells is good, the cost is low, and the process production is easy.)

脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其是涉及一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法。

背景技术

脐带间充质干细胞指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，应用人脐带血清为主体的培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，人脐带间充质干细胞的生长有赖于血清的存在，如胎牛血清或新生牛血清，在不添加血清的培养基中，绝大部分细胞(包括干细胞)均不能生长增殖或分化，血清能够提供多种许多细胞(包括干细胞)生长必须的营养物质，如胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等，还提供携带各种重要的低分子量物质的结合蛋白，如白蛋白携带维生素、脂肪以及激素等，转铁蛋白携带铁等。

血清是一种非常复杂的混合物，成分可能多达几百种，目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚，血清各批次之间的质量差别较大，受到生产商原料来源地的影响较大，要保证每批的一致性很困难，不利于实验室研究或产品生产的标准化，血清中可能含有一些未知的或未检测出的支原体、病毒等有害微生物，对细胞产生潜在的影响，并且血清中存在的一些抗体、补体及细菌毒素等物质，也对细胞的生长产生不利影响，甚至造成细胞的死亡。

但是干细胞的临床应用要求用无血清培养基培养，目前市场上的无血清培养基的培养效果远远不如血清培养基，中国专利申请CN105420182A公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、白血病抑制因子、胰蛋白酶、2-巯基乙醇、亚硒酸钠和纤连蛋白等，通过添加较高含量的纤连蛋白实现较好的贴壁性能，但是细胞的增殖速率较慢；中国专利申请CN102634482A公开了一种间充质干细胞的无血清完全培养基，由基础培养基和添加成分构成，所述的基础培养基为DMEM/F12，所述的添加成分由重组胰岛素、人血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、亚硒酸钠、硝酸铁和葡聚糖组成，不含有血清，避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷，但是培养出来的干细胞易于分化从而发生表型改变，还有些市场上市售的脐带间充质干细胞无血清培养基存在价格昂贵、贴壁性能不理想等缺点。

因此，亟需一种脐带间充质干细胞增殖速率快、不易分化、成本低和易于工业化的脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种脐带间充质干细胞无血清培养基，通过添加丹参素钠和银杏酸，可显著提高脐带间充质干细胞的增殖速率，并且脐带间充质干细胞不易分化产生表型改变，较好的保护脐带间充质干细胞，其中还添加了橄榄油增强贴壁的效果，成本较低，且易于工艺化生产。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种脐带间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠和银杏酸。

优选地，所述人血清白蛋白的浓度为1～5mg/mL，所述转铁蛋白的浓度为20～50mg/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为10～30ng/mL，所述转化生长因子的浓度为20～40ng/mL，所述胰岛素的浓度为15～25μg/mL，所述橄榄油的浓度为1～5mg/mL，所述丹参素钠的浓度为10～30μg/mL和银杏酸的浓度为5～15μg/mL。

优选地，所述人血清白蛋白的浓度为1～4mg/mL，所述转铁蛋白的浓度为20～40mg/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为15～30ng/mL，所述转化生长因子的浓度为20～35ng/mL，所述胰岛素的浓度为15～20μg/mL，所述橄榄油的浓度为1～3mg/mL，所述丹参素钠的浓度为15～30μg/mL和银杏酸的浓度为5～10μg/mL。

更优选地，所述人血清白蛋白的浓度为3.5mg/mL，所述转铁蛋白的浓度为25mg/mL，所述表皮细胞生长因子的浓度为26ng/mL，所述转化生长因子的浓度为30ng/mL，所述胰岛素的浓度为18μg/mL，所述橄榄油的浓度为2mg/mL，所述丹参素钠的浓度为24μg/mL和银杏酸的浓度为8μg/mL。

优选地，所述胰岛素为人胰岛素，所述转化生长因子为转化生长因子-β1。

优选地，脐带间充质干细胞无血清培养基还包括浓度为0.01～0.02μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和浓度为0.15～0.25mg/mL的胰蛋白酶。

本发明的目的第二提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

优选地，所述滤膜的孔径为0.1～0.5μm。

优选地，所述脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为6.5～7.8。

本发明还提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基在脐带间充质干细胞培养中的用途。

本发明以DMEM低糖培养基为基础，在添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素等营养成分的同时添加一定量的丹参素钠和银杏酸，可以显著提高脐带间充质干细胞的增殖率，同时保持脐带间充质干细胞的表型形状不发生分化，提高了脐带间充质干细胞的质量，在培养过程中发现，在培养中添加少量的橄榄油可帮助细胞贴壁，从而使得脐带间充质干细胞的增殖效果更佳，成脂和成骨诱导分化潜能佳。

其中，DMEM低糖培养基提供糖类、L-谷氨酰胺和无机盐等基础物质，为脐带间充质干细胞提供能量来源，人血清白蛋白可以替代小牛血清是脐带间充质干细胞生长的营养来源，可以提供合适的培养基渗透压，满足细胞生长的渗透压平衡，转铁蛋白为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁，起到铁传递的作用，表皮细胞生长因子和转化生长因子起到脐带间充质干细胞生存维持和增殖刺激的作用，胰岛素可提高脐带间充质干细胞的合成代谢能力，刺激细胞的生长繁殖。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

1.本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基，组分清晰，排除了动物来源的病原体污染，重现性和可控性与血清培养基效果更佳，成本较低，适于工业化生产；

2.本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基，添加了丹参素钠和银杏酸，可以显著提高脐带间充质干细胞的增殖速率，同时保持脐带间充质干细胞的表型形状不发生分化，提高了脐带间充质干细胞的质量，维持了脐带间充质干细胞的多向分化潜能；

3.本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清培养基，在培养中添加少量的橄榄油可帮助细胞贴壁，从而使得脐带间充质干细胞的增殖效果更佳，成脂和成骨诱导分化潜能佳。

具体实施方式

以下对本发明作进一步详细说明。

本发明中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。DMEM低糖培养基来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

实施例1、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

脐带间充质干细胞无血清培养基的组分包括：质量浓度为10g/L的DMEM低糖培养基、质量浓度为1mg/mL的人血清白蛋白、质量浓度为20mg/mL的转铁蛋白、质量浓度为10ng/mL的表皮细胞生长因子、质量浓度为20ng/mL的转化生长因子-β1、质量浓度为15μg/mL的人胰岛素、质量浓度为1mg/mL的橄榄油、质量浓度为10μg/mL的丹参素钠、质量浓度为5μg/mL的银杏酸、质量浓度为0.01μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和质量浓度为0.15mg/mL的胰蛋白酶。

脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述的DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，搅拌速度为1000r/min，搅拌时间为20min，经0.1μm的滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为6.5。

实施例2、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

脐带间充质干细胞无血清培养基的组分包括：质量浓度为12g/L的DMEM低糖培养基、质量浓度为3mg/mL的人血清白蛋白、质量浓度为30mg/mL的转铁蛋白、质量浓度为15ng/mL的表皮细胞生长因子、质量浓度为30ng/mL的转化生长因子-β1、质量浓度为20μg/mL的人胰岛素、质量浓度为3mg/mL的橄榄油、质量浓度为15μg/mL的丹参素钠、质量浓度为10μg/mL的银杏酸、质量浓度为0.01μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和质量浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶。

脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述的DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，搅拌速度为1100r/min，搅拌时间为25min，经0.3μm的滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为7.0。

实施例3、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

脐带间充质干细胞无血清培养基的组分包括：质量浓度为13g/L的DMEM低糖培养基、质量浓度为4mg/mL的人血清白蛋白、质量浓度为40mg/mL的转铁蛋白、质量浓度为20ng/mL的表皮细胞生长因子、质量浓度为35ng/mL的转化生长因子-β1、质量浓度为20μg/mL的人胰岛素、质量浓度为4mg/mL的橄榄油、质量浓度为20μg/mL的丹参素钠、质量浓度为12μg/mL的银杏酸、质量浓度为0.01μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和质量浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶。

脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述的DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，搅拌速度为1100r/min，搅拌时间为30min，经0.4μm的滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为7.2。

实施例4、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

脐带间充质干细胞无血清培养基的组分包括：质量浓度为15g/L的DMEM低糖培养基、质量浓度为5mg/mL的人血清白蛋白、质量浓度为50mg/mL的转铁蛋白、质量浓度为30ng/mL的表皮细胞生长因子、质量浓度为40ng/mL的转化生长因子-β1、质量浓度为25μg/mL的人胰岛素、质量浓度为5mg/mL的橄榄油、质量浓度为30μg/mL的丹参素钠、质量浓度为15μg/mL的银杏酸、质量浓度为0.02μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和质量浓度为0.25mg/mL的胰蛋白酶。

脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述的DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，搅拌速度为1200r/min，搅拌时间为30min，经0.5μm的滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为7.8。

实施例5、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

脐带间充质干细胞无血清培养基的组分包括：质量浓度为12g/L的DMEM低糖培养基、质量浓度为3.5mg/mL的人血清白蛋白、质量浓度为25mg/mL的转铁蛋白、质量浓度为26ng/mL的表皮细胞生长因子、质量浓度为30ng/mL的转化生长因子-β1、质量浓度为18μg/mL的人胰岛素、质量浓度为2mg/mL的橄榄油、质量浓度为24μg/mL的丹参素钠、质量浓度为8μg/mL的银杏酸、质量浓度为0.01μmol/mL的L-抗坏血酸-2磷酸和质量浓度为0.2mg/mL的胰蛋白酶。

脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

S1.取上述的DMEM低糖培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素、橄榄油、丹参素钠、银杏酸、L-抗坏血酸-2磷酸和胰蛋白酶搅拌均匀，搅拌速度为1200r/min，搅拌时间为20min，经0.15μm的滤膜过滤除菌，得到脐带间充质干细胞无血清培养基。

脐带间充质干细胞无血清培养基的pH值为6.6。

对比例1、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

与实施例5相似，区别仅在于，不添加丹参素钠和银杏酸，其余步骤、参数与实施例5相同。

对比例2、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

与实施例5相似，区别仅在于，不添加丹参素钠，其余步骤、参数与实施例5相同。

对比例3、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

与实施例5相似，区别仅在于，不添加银杏酸，其余步骤、参数与实施例5相同。

对比例4、本发明的脐带间充质干细胞无血清培养基

与实施例5相似，区别仅在于，不添加橄榄油，其余步骤、参数与实施例5相同。

试验例一、脐带间充质干细胞的细胞增殖检测

将第3代脐带间充质干细胞以5000个/ml的密度接种于6孔板中，每孔接种2ml，设置实施例1～5组及对比例1～4组，分别加入实施例1～5组及对比例1～4制备的脐带间充质干细胞无血清培养基，设置阳性对照组(商业化的有血清培养基，MEM+10％胎牛血清)，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，长到85％汇合度后，按照8000个/ml的密度进行细胞传代，传代和最终收获时，用0.25％的胰酶消化1-2min，之后将间充质干细胞吹打下来并用各应对培养基终止消化，将得到的间充质干细胞以200g的速度离心5min，得到的充间质细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬和混匀，将得到的细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪进行细胞计数，每组测3次，结果取平均值见表1。

表1

根据表1的数据可知，采用实施例1～5制备的脐带间充质干细胞无血清培养基进行脐带间充质干细胞的培养，其细胞扩增效果较强，并且间充质干细胞的直径小于其他对比例和阳性对照组，说明，本发明得到的培养基能够大规模生产优质无分化的间充质干细胞，对比例1制备的脐带间充质干细胞无血清培养基(未添加丹参素钠和银杏酸)经过7天培养后得到的脐带间充质干细胞数量较少，间充质干细胞的直径较大，本发明实施例1～5培养得到的脐带间充质干细胞数量超过对比例1得到的脐带间充质干细胞数量2倍，对比例2或对比例3制备的脐带间充质干细胞无血清培养基(只添加丹参素钠或银杏酸)，得到的脐带间充质干细胞数量较少，间充质干细胞的直径较小，对比例4未添加橄榄油，其脐带间充质干细胞数量也交少，可能是因为橄榄油影响了细胞的贴壁效果，从而影响了脐带间充质干细胞的增殖效果。

试验例二、脐带间充质干细胞表面标志鉴定

取实施例5制备的脐带间充质干细胞无血清培养基培养的脐带间充质干细胞，取原代、第4、8和第12代的脐带间充质干细胞用0.25％的胰酶消化1-2分钟后移入2ml离心管，800rmp离心5分钟，去除上清；每管加入2ml PBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；加入1ml的PBS重悬细胞，计数，再加入PBS调整细胞数为1×10⁶个/ml；将细胞悬液分成多管，每管500μl，选其中一管作为流式对照组；按组分别加入带有FITC标记的CD29、CD44、CD73、CD166等流式抗体，4℃避光孵育30分钟，800rmp离心5分钟去除上清；加入1mlPBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；加入500μl PBS重悬细胞；上流式细胞仪检测样品。

表2脐带间充质干细胞的膜表面阳性生物学特征

表3脐带间充质干细胞干细胞的膜表面阴性生物学特征

阴性标志物	原代	第4代	第8代	第12代
					CD33	0.3	0.4	0.5	0.4
CD34	1.5	0.8	0.7	0.7
					CD38	0.6	0.5	0.7	0.5
CD31	1.3	0.8	0.7	0.6
					CD41	0.7	0.8	0.5	0.6

根据表2和表3，使用本发明制备的脐带间充质干细胞无血清培养基，原代到12代的脐带间充质干细胞的有关阳性标志物如CD29、CD44、CD166、CD73等能保持高表达不变，同时也能维持原有的阴性标志如CD34、CD33、CD31、和CD41等。表明本发明制备的脐带间充质干细胞无血清培养基和上述的培养条件能够在促进干细胞扩增的同时，防止和减少间充质干细胞的分化和表形改变等问题。

试验例三、脐带间充质干细胞的贴壁检测

取未经包被的24孔板，设置实施例1～5组及对比例1～4组，分别加入实施例1～5组及对比例1～4制备的脐带间充质干细胞无血清培养基，设置阳性对照组(商业化的有血清培养基，MEM+10％胎牛血清)，每组3个复孔，每孔接种1×10⁵个第3代脐带间充质干细胞，放置于细胞培养箱中孵育2h，弃去培养基，使用PBS冲洗去除未贴壁细胞，进行消化并收集计数，见表4。

表4

根据表4的数据可知，本发明提供的脐带间充质干细胞无血清培养基能够显著增强脐带间充质干细胞的贴壁，比阳性对照组的细胞贴壁数多，对比例1制备的无血清培养基未添加丹参素钠和银杏酸，其对脐带间充质干细胞的贴壁现象有些影响，脐带间充质干细胞数量略少，对比例2或对比例3制备的无血清培养基只添加了丹参素钠和银杏酸中的一种，脐带间充质干细胞贴壁数量也较少，但是比对比例1的脐带间充质干细胞贴壁数量要多一些，贴壁效果一般，对比例4未添加橄榄油，其脐带间充质干细胞贴壁数量最少，贴壁效果最差，说明橄榄油对脐带间充质干细胞的贴壁影响较大，当橄榄油成分不存在时，同时添加了丹参素钠和银杏酸，也不能提高脐带间充质干细胞的贴壁效果，当橄榄油成分存在时，即使不添加丹参素钠和银杏酸或者只含有其中的一种成分，可增强脐带间充质干细胞的贴壁数量，贴壁效果较佳。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。