阅读说明：本技术 一种利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法 (Method for synthesizing D-psicose by whole-cell transformation ) 是由 朱理平 高晓冬 李子杰 温俊婷 冯林雪 陈洲 陈科材 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法,所述方法中整个反应体系包括底物D-果糖,重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体、ATP以及金属离子,所述反应体系经过催化反应后再加热,经过降温后加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应得到D-阿洛酮糖。利用该方法可提高D-阿洛酮糖的产率。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a method for synthesizing D-psicose by whole cell transformation. The method can improve the yield of D-psicose.)

一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)是一种稀有己酮糖，与D-果糖互为同分异构体。由于D-阿洛酮糖在医疗、保健等方面具有显著功效，在2011年被正式列入GRAS(公认安全，GenerallyRecognized as Safe)食品。随着稀有糖研究的不断推进，D-阿洛酮糖因其独特的功能特性受到了广泛的关注。在食品应用方面，其甜度约为蔗糖的70％，但能量较低，具有低吸收、低卡路里等特性，可作为蔗糖的食用性替代品。此外，D-阿洛酮糖具有抑制肥胖，降血糖，降血脂等功能，非常适用于糖尿病患者和肥胖人群的食用，因此在医疗、保健方面具有显著功效。

目前，D-阿洛酮糖主要合成方法有化学合成和生物合成法，其中化学合成法为关环转换(ring-closing metathesis，RCM)合成法，首先通过RCM法合成α,β-六元不饱和内酯,然后经过一系列还原、酰基化等反应，再进一步修饰合成稀有糖。但此法步骤过于繁琐，副产物多，产率低。Northrup等提出了利用选择性醇醛缩合两步法来合成糖。此法看似操作简单，但是难以得到高对映选择性的中间体，产物得率低。生物合成方法主要是利用异构酶来催化多种糖类之间的相互转化。相较于化学合成，生物合成法的优势更为突出：底物廉价、副产物少、立体选择性高、反应条件温和，利于目的产物的纯化，更适合工业化生产。但是异构酶催化的反应多为可逆过程(异构酶转化率一般只有30％左右)，产物得率较低，同时反应结束后往往会得到多种糖的混合物，且理化性质极为相似，产物难以完全区分开。因此，如何提高反应的转化率依然是一个重大挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，利用该方法可提高D-阿洛酮糖的产率。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，所述方法中整个反应体系包括底物D-果糖，重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体、ATP以及金属离子，所述反应体系经过催化反应后再加热，经过降温后加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应得到D-阿洛酮糖。

作为一种改进的技术方案，催化反应时整个反应体系的pH为7-10，反应温度为20-60℃，反应时间2-6h，所述金属离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或Ca²⁺；催化反应后再加热的温度控制在80-100℃，降温后的温度控制在20-37℃。

作为一种优选的技术方案，催化反应时整个反应体系的pH为8.5，反应温度为37℃，所述金属离子为Mg²⁺。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌为同时表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌的构建方法为：将来源于大肠杆菌BL21的L-鼠李树胶糖激酶基因rhaB(kegg编号为B21_03739)连接到pCDFDuet-1质粒上，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB；将梭状芽孢杆菌H10(Clostridium cellulolyticum H10)来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe连接到pET28a质粒上，得到重组质粒pET28a-dpe；再将pCDFDuet-rhaB和pET28a-dpe共同转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌；或用单质粒pCDFDuet-1同时插入rhaB和dpe基因，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe，再将重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为0.1-1.0mM IPTG，16-37℃诱导5-20h，收集得到湿菌体。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌为同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶的重组大肠杆菌；采用该重组大肠杆菌时整个反应体系中还包括多聚磷酸钠。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌的构建方法为：将来源于大肠杆菌BL21的L-鼠李树胶糖激酶基因rhaB和来源于大肠杆菌MG1655的多聚磷酸盐激酶基因ppk1(kegg编号为b2501)连接到pCDFDuet-1质粒上，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-ppk；将梭状芽孢杆菌H10(Clostridium cellulolyticumH10)来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe(GeneBank编号ACL75304)连接到pET28a质粒上，得到重组质粒pET28a-dpe；再将pET28a-dpe和pCDFDuet-rhaB-ppk重组质粒共转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

作为一种改进的技术方案，所述重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD600为0.6-1.0时，加入终浓度为0.1-1.0mM IPTG，16-37℃诱导5-20h，收集得到湿菌体。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

(1)本发明直接采用全细胞作为催化剂不需要对酶进行纯化，减少了ATP的消耗量，降低了生产成本，有利于工业化生产；相对于现有技术中采用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶单酶转化大大提高了D-阿洛酮糖的转化率。

(2)本发明以D-果糖为底物，加入ATP、金属离子以及重组大肠杆菌(可同时表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶或者可同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶)经过诱导后的湿菌体，经过催化反应后再加热，加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应，通过该工艺可以大大提高D-阿洛酮糖的转化率；当重组大肠杆菌(可同时表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶)时，D-阿洛酮糖的转化率的可达到83％以上，最高可达到93％；当重组大肠杆菌(可同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶)时，D-阿洛酮糖的转化率的可达到82％以上，最高可达到94％，而且还降低了对ATP的消耗。

附图说明

附图1为实施例1条件下反应产物的HPLC图；

附图2为实施例8条件下反应产物的HPLC图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，以D-果糖为底物(果糖的浓度为10g/L)，加入ATP(加入量为50mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为20g/L)，调pH至8.5，控制反应温度为37℃，经过6h的催化反应(其中上述整个反应体系为1L),反应结束后再将反应体系加热至100℃，调pH至5.0左右，加酸性磷酸酶(AP)30℃摇床过夜，以脱去磷酸基团，再用NaOH调pH至7.0，100℃加热以终止反应，高速离心10min收集上清，即得到D-阿洛酮糖。

其中重组大肠杆菌为同时表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组大肠杆菌；(本发明中也可以选择枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌来表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；)

湿菌体的制备：

1)重组质粒pET28a-dpe的构建：以来源于梭状芽孢杆菌H10(Clostridiumcellulolyticum H10)的dpe基因片段(GeneBank编号ACL75304)为模板，以dpe-F1：GCGCGGATCCATGAAGCACGGTATCTATTA(BamH I)为上游引物，以dpe-R1：GCGCAAGCTTTTAGGAGTGTTTGTGACATTCTA(Hind III)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和Hind III分别对质粒pET28a和扩增的dpe基因片段在37℃进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后的dpe基因片段与质粒pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-dpe；

2)重组质粒pCDFDuet-rhaB的构建：以大肠杆菌BL21为模板，以rhaB-F：GCGCGGAT CCAATGACCTTTCGCAATTGTGTC(BamH I)为上游引物，以rhaB-R：GCGCAAGCTTTCATGCGCAAAGCTCCTTTGT(Hind III)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和Hind III分别对质粒pCDFDuet-1和扩增的rhaB基因片段在37℃进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后的rhaB基因片段与质粒pCDFDuet-1进行连接，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB；

3)重组质粒pET28a-dpe和重组质粒pCDFDuet-rhaB的转化：将pET28a-dpe和pCDFDuet-rhaB共同转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌；

其中制备重组大肠杆菌时也可以采用单质粒pCDFDuet-1同时插入rhaB和dpe基因，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe，再将重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe的构建过程如下：首先构建重组质粒pCDFDuet-rhaB，方法如上所述；在重组质粒pCDFDuet-rhaB的基础上在插入dpe基因得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe，具体构建方法如下：

以dpe基因片段为模板，设计上游引物dpe-F2：GCGCGGTACCATGAAGCACGGTATCTATTA(KpnI),下游引物dpe-R2：GCGCCTCGAGTTAGGAGTGTTTGTGACATTCTA(Xho I)，进行扩增，用限制性内切酶KpnI和Xho I分别对质粒pCDFDuet-rhaB和扩增的dpe进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后的dpe基因片段与质粒pCDFDuet-rhaB进行连接，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-dpe。

4)重组蛋白RhaB和DPE的诱导表达：将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为0.1-1.0mM IPTG，16-37℃诱导5-20h，收集得到湿菌体。

本发明反应体系的整个反应过程：

注：DPE:D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；RhaB：L-鼠李树胶糖激酶。

通过高效液相色谱(HPLC)检测底物D-果糖的消耗和产物D-阿洛酮糖的产生，并计算转化率。

HPLC检测条件如下：色谱分析柱WaterSugarPak1(300mm×6.5mm)，流动相为500mg/L EDTA钙盐，流速为0.5mL/min，柱温80℃，示差(RI)检测器。其中D-果糖标准品的保留时间为11.6min，D-阿洛酮糖标准品的保留时间为16.2min(图1)。

实施例2

催化反应时整个反应体系的反应温度为30℃，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例3

催化反应时整个反应体系的pH为7.0，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例4

催化反应时整个反应体系的pH为10.0，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例5

催化反应时整个反应体系的反应温度为50℃，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例6

整个反应体系中底物D-果糖(果糖的浓度为50g/L)，加入ATP(加入量为250mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为30g/L)，其余操作均与实施例操作相同。

实施例7

整个反应体系中底物D-果糖(果糖的浓度为100g/L)，加入ATP(加入量为500mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为50g/L)，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例8

一种利用全细胞转化合成D-阿洛酮糖的方法，以D-果糖为底物(果糖的浓度为10g/L)，加入ATP(加入量为10mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)、6mM多聚磷酸钠以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为20g/L)，调pH至8.5，控制反应温度为37℃，经过6h的催化反应(其中上述整个反应体系为1L),反应结束后再将反应体系加热至100℃，调pH至5.0左右，加酸性磷酸酶(AP)30℃摇床过夜，以脱去磷酸基团，再用NaOH调pH至7.0，100℃加热以终止反应，高速离心10min收集上清，即得到D-阿洛酮糖。

其中重组大肠杆菌为同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶的重组大肠杆菌；(本发明中也可以选择枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌来表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶)

湿菌体的制备：

1)重组质粒pET28a-dpe的构建参照实施例1。

2)重组质粒pCDFDuet-rhaB-pkk的构建：在实施例1构建的重组质粒pCDFDuet-rhaB的基础上插入pkk基因得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-pkk。

以大肠杆菌MG1655为模板，以ppk-F1：GCGCCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA(Nde I)为上游引物，以ppk-R1：GCGCCTCGAGTTATTCAGGTTGTTCGAGTG(Xho I)为下游引物，进行扩增，用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对质粒pCDFDuet-rhaB和扩增的ppk基因进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后的ppk基因片段与质粒pCDFDuet-rhaB进行连接，得到重组质粒pCDFDuet-rhaB-pkk。

3)重组质粒pCDFDuet-rhaB-pkk和重组质粒pET28a-dpe的转化：将pCDFDuet-rhaB-pkk和pET28a-dpe共同转化到大肠杆菌Roseta(DE3)中，得到重组大肠杆菌；

4)重组蛋白RhaB和DPE的诱导表达：将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为0.1-1.0mM IPTG，16-37℃诱导5-20h，收集得到湿菌体。

本发明整个反应的流程：

注：DPE:D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；RhaB：L-鼠李树胶糖激酶；PPK：多聚磷酸盐激酶；(Pi)n:多聚磷酸盐。

通过高效液相色谱(HPLC)检测底物D-果糖的消耗和产物D-阿洛酮糖的产生，并计算转化率。

HPLC检测条件如下：色谱分析柱WaterSugarPak1(300mm×6.5mm)，流动相为500mg/L EDTA钙盐，流速为0.5mL/min，柱温80℃，示差(RI)检测器。其中D-果糖标准品的保留时间为11.6min，D-阿洛酮糖标准品的保留时间为16.2min(图2)。

实施例9

催化反应时整个反应体系的反应温度为30℃，其余操作均与实施例8相同。

实施例10

催化反应时整个反应体系的pH为7.0，其余操作均与实施例8相同。

实施例11

催化反应时整个反应体系的pH为10.0，其余操作均与实施例8相同。

实施例12

催化反应时整个反应体系的反应温度为50℃，其余操作均与实施例8相同。

实施例13

整个反应体系中底物D-果糖(果糖的浓度为50g/L)，加入ATP(加入量为50mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为30g/L)，其余操作均与实施例8操作相同。

实施例14

整个反应体系中底物D-果糖(果糖的浓度为100g/L)，加入ATP(加入量为100mM)、金属离子(5mM的Mg²⁺)以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体(湿菌体的浓度为50g/L)，其余操作均与实施例8操作相同。

为了更好的证明利用本发明的方法可以提高D-阿洛酮糖的转化率，本发明同时做了9个对比例，其中对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5分别以实施例1为参照进行对比，对比例6、对比例7、对比例8、对比例9分别以实施例8为参照进行对比。

对比例1

现有技术中常规的操作方法即采用D-果糖为底物，DPE单一酶来制备D-阿洛酮糖。

对比例2

与实施例1操作不同的是，反应体系的温度控制在18℃，其余操作均与实施例1相同。

对比例3

与实施例1操作不同的是，反应体系的温度控制在65℃，其余操作均与实施例1相同。

对比例4

与实施例1操作不同的是，反应体系的pH控制在4.5，其余操作均与实施例1相同。

对比例5

与实施例1操作不同的是，反应体系的pH控制在12，其余操作均与实施例1相同。

对比例6

与实施例8操作不同的是，反应体系的温度控制在18℃，其余操作均与实施例8相同。

对比例7

与实施例8操作不同的是，反应体系的温度控制在65℃，其余操作均与实施例8相同。

对比例8

与实施例8操作不同的是，反应体系的pH控制在4.5，其余操作均与实施例8相同。

对比例9

与实施例8操作不同的是，反应体系的pH控制在12，其余操作均与实施例8相同。

本发明实施例1-7以及对比例1-5中D-阿洛酮糖的转化率分别见下表1。本发明实施例8-14以及对比例6-9中D-阿洛酮糖的转化率分别见下表2。

表1

表2

通过表1和表2数据可以发现，本发明以D-果糖为底物，加入ATP、金属离子以及重组大肠杆菌(可同时表达L-鼠李树胶糖激酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶或者可同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶)经过诱导后的湿菌体，经过催化反应后再加热，经过降温后加入酸性磷酸酶经过脱磷酸反应，该工艺与现有技术(对比例1中的工艺相比较)可以大大提高D-阿洛酮糖的转化率；此外将表1中的实施例1-7与表2中的实施例8-14对比可以发现，选择重组大肠杆菌(可同时表达L-鼠李树胶糖激酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和多聚磷酸盐激酶)经过诱导后的湿菌体，在D-阿洛酮糖的转化率相近的条件下，可以降低对ATP的消耗，节约了成本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。