一种生物合成木糖的方法

文档序号：1884839 发布日期：2021-11-26 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 一种生物合成木糖的方法 (Method for biosynthesis of xylose ) 是由江会锋逯晓云刘玉万初斋林崔博卢丽娜于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种生物合成L-木糖方法,其利用醛缩酶如D-果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)将底物甲醛和羟基乙醛转化为L-木糖,或者可利用羟基乙醛缩合酶(GALS)、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶如苯甲酰甲酸脱羧酶(BFD)以及醛缩酶如D-果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)突变体的组合将底物甲醛“一锅法”转化为L-木糖。本发明的生物合成方法具有转化率高、生产工艺简单、绿化友好、易于规模化生产等优点。(The present invention provides a process for the biosynthesis of L-xylose by converting the substrates formaldehyde and glycolaldehyde into L-xylose using an aldolase such as D-fructose-6-phosphate aldolase (FSA), or by converting the substrate formaldehyde into L-xylose "one-pot" using a combination of a glycolaldehyde condensing enzyme (GALS), a mutant thereof or an enzyme having the function of catalyzing the synthesis of glycolaldehyde from formaldehyde, such as benzoylformate decarboxylase (BFD), and an aldolase such as a D-fructose-6-phosphate aldolase (FSA) mutant. The biosynthesis method of the invention has the advantages of high conversion rate, simple production process, greening friendliness, easy large-scale production and the like.)

一种生物合成木糖的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物合成L-木糖的方法。

背景技术

稀有糖虽然在自然界中含量少，但因其潜在的生物活性和低毒性使其在膳食、保健、医药等领域发挥着重要作用。稀有糖通常有天然糖的甜度，却不能或很少能被机体代谢，因而可作为蔗糖等高热量糖的替代物，例如，戊糖类物质木糖醇，甜度相当于蔗糖的90％，热量为蔗糖的60％，可作为糖尿病人的辅助治疗剂，并具有降血糖、防龋齿、改善肝功能、减肥、缓泻、调节肠道功能等生理活性。此外，稀有糖可以抑制活性氧产生，例如，日本香川大学何森健等人发现，D-阿洛糖具有抑制活性氧产生的性质。他们通过实验证实，D-阿洛糖可以保护内脏缺血障碍。特别地，稀有L-戊糖(如L-木糖，L-核糖等)不仅可以用作合成具有不同生物活性的化合物的前体，同时其本身也具有一些特殊的功效。例如，L-核糖具有抗肿瘤活性，它可以提高肿瘤细胞的死亡率、减少肿瘤细胞的扩散和延缓恶性肿瘤的生长。

稀有糖的制备方法主要有化学合成法和生物转化法。化学法合成：主要利用催化加氢、加成反应、Mitsunobu反应、Ferrier重排和BF₃·Et₂O引发的过氧化反应等方法来合成稀有糖。Macmillan等人在2004年首次提出2步法合成稀有糖的概念。他们先以保护过的羟基乙醛为原料，在L-脯氨酸催化下温和地得到高对映选择性的Aldol产物(α-醇醛二聚物)，然后在路易斯酸、TiCl₄、MgBr₂等物质作用下作为受体和烯醇硅烷醚进行了Aldol缩合(醇醛缩合)，从而高收率且高对映选择性地合成系列己糖。然而，化学法合成稀有糖，需要多步的催化和保护反应，且反应条件苛刻、操作繁琐复杂，所以获得稀有糖的产率较低，副产物多，化学污染严重，通常还存在立体选择性不足的问题。生物转化法：近二十年来，日本香川大学的Izumori等人一直致力于稀有糖的生物制备，提出了一套完整的适用于所有稀有糖的生物制备策略——Izumoring方法，即利用D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose-3-epmierase，DTE)、多元醇脱氢酶(polyol dehydrogenase，PDH)、氧化还原酶、醛糖异构酶进行所有单糖(主要为四碳糖、五碳糖、六碳糖)及糖醇之间的相互转化而制备各种稀有糖。但由于酶活及特异性问题，一些稀有糖的转化率依然很低。

地球上的碳一资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能约10324万吨，天然气可采储量约185.7万亿立方米，原煤可采储量约8915.31亿吨。同时，酶催化剂由于具有活性高、化学选择性高等特点，越来越受到人们的青睐。因此，探索以甲醛为原料，以酶为催化剂合成稀有糖具有重要的意义。

发明内容

为克服现有技术中的问题，一方面，本发明提供了一种生物合成L-木糖的方法，包括以下步骤：第1步，甲醛和羟基乙醛在醛缩酶、其突变体或具有此催化功能的酶的作用下合成甘油醛；第2步，使甘油醛和羟基乙醛在醛缩酶、其突变体或具有此催化功能的酶的作用下合成L-木糖。

根据本发明的实施方案，其中所述醛缩酶或其突变体可以催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或可以催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖，可以为D-果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)和/或其突变体。

根据本发明的实施方案，其中第1步和第2步中使用的醛缩酶、其突变体或具有此催化功能的酶可以相同或不同。优选地，两个步骤中使用相同的酶或其突变体；更优选地，两个步骤均使用D-果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)和/或其突变体。

根据本发明的实施方案，其在第一步之前还包括以下步骤：第0步，底物甲醛在羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶的作用下合成羟基乙醛。

根据本发明的实施方案，其中所述羟基乙醛缩合酶或其突变体可以催化甲醛缩合为羟基乙醛，例如GALS和/或其突变体；所述具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶可以为苯甲酰甲酸脱羧酶(BFD)和/或其突变体。应理解，在本发明的上下文中，所提到的羟基乙醛缩合酶、其突变体和具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶均具有这种定义。

根据本发明的实施方案，其中所述醛缩酶或其突变体可以催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或可以催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖，可以为D-果糖-6-磷酸醛缩酶(FSA)和/或其突变体。应理解，在本发明的上下文中，所提到的醛缩酶、其突变体和具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖功能的酶均具有这种定义。

根据本发明的实施方案，其中所述BFD突变体的氨基酸序列包含在对应于SEQ IDNO.1的W86、N87、L109、L110、H281、Q282、A460中至少一个位点(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个位点)的氨基酸残基的突变，并且其中至少一个突变位点为W86或N87。优选地，所述BFD突变体的氨基酸序列包含如下的位点突变：W86/N87、W86/N87/L109/L110、W86/N87/L109/L110/A460或W86/N87/L109/L110/H281/Q282/A460。优选地，其中所述W86、N87、L109、L110、H281、Q282和A460的氨基酸残基的突变分别为W86R、N87T、L109G、L110E、H281V、Q282F和A460M。更优选地，所述BFD突变体的氨基酸序列包含如下的位点突变：W86R/N87T、W86R/N87T/L109G/L110E、W86R/N87T/L109G/L110E/A460M或W86R/N87T/L109G/L110E/H281V/Q282F/A460M。应理解，在本发明的上下文中，所提到的BFD突变体均具有这种定义。

根据本发明的实施方案，其中所述FSA突变体的氨基酸序列包含在对应于SEQ IDNO.5的A129和/或A165位点的氨基酸残基的突变。优选地，所述两个位点的突变可以分别是A129T和A165G。优选地，所述FSA突变体的氨基酸序列包含A129T/A165G的位点突变。应理解，在本发明的上下文中，所提到的FSA突变体均具有这种定义。

根据本发明的实施方案，其中所用的羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶以及醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶可以为纯化的酶或其突变体、酶裂解上清液或全细胞的形式。

根据本发明的实施方案，所述方法可以以“一锅法”方式进行，可在缓冲液体系中进行。所述缓冲液可为三乙醇胺缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液等。所述缓冲液的pH值可为6.5-8.5，例如7-8。

根据本发明的实施方案，所述底物甲醛在反应体系中的浓度可为0.5-30g/L，例如1-5g/L，1.5-3g/L，示例性地为2g/L、2.5g/L或3g/L；所述脱羧酶或其突变体在反应体系中的浓度可为0.1-10mg/mL，例如0.2-8mg/mL，0.3-5mg/mL，0.5-3mg/mL，示例性地为1mg/mL；所述醛缩酶或其突变体在反应体系中的浓度可为0.1-10mg/mL，例如0.2-8mg/mL，0.3-5mg/mL，0.5-5mg/mL，示例性地为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL。

根据本发明的实施方案，其中所用的羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶与醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的重量比没有特别限制，例如可以为1:(1-10)，例如1:(1-8)，1:(1-5)，示例性地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。

根据本发明的实施方案，所述“一锅法”反应可在10-50℃下进行，例如在20-40℃下进行，示例性地在25℃下或37℃进行。

根据本发明的实施方案，所述“一锅法”反应可进行1-72小时，例如18-48小时，示例性地进行24小时。

根据本发明的实施方案，所述“一锅法”反应可在震荡条件下进行。

另一方面，本发明还提供上述羟基乙醛合酶、其突变体、具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶或相关生物材料以及醛缩酶、其突变体、具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶或相关生物材料的组合用于生物合成L-木糖的应用。

再一方面，本发明还提供包含上述羟基乙醛合酶、其突变体、具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶或相关生物材料以及醛缩酶、其突变体、具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶或相关生物材料的组合物，以及所述组合物用于生物合成L-木糖的应用。在所述组合物中，羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶与醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的重量比没有特别限制，例如可以为1:(1-10)，例如1:(1-8)，1:(1-5)，示例性地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。

根据本发明的实施方案，上述羟基乙醛合酶、其突变体、具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶或相关生物材料以及醛缩酶、其突变体、具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶或相关生物材料的组合用于以甲醛为底物生物合成L-木糖。

根据本发明的实施方案，所述羟基乙醛缩合酶的相关生物材料为能够表达所述羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶的编码核酸分子，或者含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

根据本发明的实施方案，所述醛缩酶的相关生物材料为能够表达所述醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的编码核酸分子，或者含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

根据本发明的实施方案，所述重组菌为将编码所述羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶或者醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的核酸分子导入宿主细胞中得到的重组菌；例如以重组载体的形式导入宿主细胞中。

其中，所述重组载体为携带编码所述羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶或者醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的核酸分子的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。

其中，所述宿主细胞可以为原核细胞如细菌，更具体如大肠杆菌，或者低等真核细胞如酵母细胞。

在本发明的上下文中，氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。

在本发明的上下文中，突变体根据它们在特定残基上的突变来描述，其位置通过与野生型酶序列比对或参考野生型酶酶序列来确定。在本发明的上下文中，还涉及在功能等同的残基上携带这些相同突变的任何变体。

在本文中，通过突变位点的位置编号和该位点的氨基酸种类来表达突变位点及其取代，例如W86R表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第86位置的色氨酸突变为精氨酸；N87T表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第87位置的天冬酰胺突变为苏氨酸。本发明当中，采用“/”表示突变位点的组合，例如“W86/N87”表示第86位的色氨酸和第87位的天冬酰胺均发生突变，包含两个突变位点，为双突变体。依次类推，“W86/N87/L109/L110”表示相应的四个位点同时发生突变，为四突变体。

有益效果

本发明利用醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶以甲醛和羟基乙醛为底物合成L-木糖，也可利用羟基乙醛缩合酶、其突变体或具有催化甲醛合成羟基乙醛功能的酶与醛缩酶、其突变体或具有催化甲醛和羟基乙醛合成甘油醛或催化羟基乙醛和甘油醛合成L-木糖的功能的酶的组合，以甲醛为底物合成L-木糖，提供了稀有糖合成的新途径和新思路。本发明的生物合成L-木糖的方法转化率高(可达65％)，且底物来源丰富，反应条件温和；具有生产工艺简单、绿化友好、易于规模化生产等优点。

附图说明

图1示出了pET-28a-BFD、pET-28a-GALS和pET-28a-FSA质粒图谱，其中1a为pET-28a-BFD的质粒图谱，1b为pET-28a-GALS、1c为pET-28a-FSA(A129T/A165G)的质粒图谱。

图2示出了HPLC检测L-木糖的图谱。

图3示出不同酶比例下L-木糖的转化率，其中FALD为底物甲醛。

图4示出了不同底物浓度情况下两种酶GALS和FLS催化甲醛生成羟基乙醛的产量，其中FLS为苯甲醛裂解酶(BAL)的突变体甲醛酶(Formolase)，FALD为底物甲醛。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的生物合成单糖的方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

实施例1BFD、GALS、FSA基因获得、载体构建

BFD(苯甲酰甲酸脱羧酶)基因种属来源为Pseudomonas putida，其氨基酸如SEQID NO.1所示，在不改变BFD氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。将该基因序列直接合成在pET-28a载体上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，重组质粒命名为pET-28a-BFD(如图1a)。此外，BFD的突变体也具有催化1甲醛合成2羟基乙醛的功能，BFD的突变体如中国发明专利申请CN201710096307.X(公开号CN106916794A)中所列。GALS为BFD的突变体，其催化甲醛合成羟基乙醛的活性显著高于BFD，被命名为羟基乙醛合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示。并且与现有技术中已知的具有催化甲醛合成羟基乙醛的酶FLS(苯甲醛裂解酶BAL的突变体甲醛酶(Formolase))(参见文献Siegel JB,Smith AL,Poust S,et al.Computationalprotein design enables a novel one-carbon assimilation pathway.Proc Natl AcadSci USA,2015,112(12):3704–3709，以及Poust S,Piety J,Bar-Even A,etal.Mechanistic analysis of an engineered enzyme that catalyzes the formosereaction.ChemBioChem,2015,16(13):1950–1954)相比，GALS可以专一性地催化甲醛生成乙醇醛，并且随着底物浓度的增加，虽然两种酶的催化效率都在增加，但是GALS的催化效果更为明显，其催化效率约是FLS的13倍(如图4所示)。因此，后续实施例中采用GALS进行。

FSA(D-Fructose-6-Phosphate Aldolase，D-果糖-6-磷酸醛缩酶)基因种属来源为E.coli，其氨基酸如SEQ ID NO.5所示，基因序列如SEQ ID NO.6所示。利用PCR从E.coli基因组上获得FSA基因，并构建至pET-28a载体上，位于酶切位点NdeI和XhoI之间，并将129位的丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)，同时将165位的丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，重组质粒命名为pET-28a–FSA(A129T/A165G)(如图1b)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，基因序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例2基因的表达

为了体外检测GALS、FSA(A129T/A165G)酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-GALS、pET-28a-FSA(A129T/A165G)分别转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM三乙醇胺缓冲液，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

实施例3蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃下，10000rpm离心45min；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，重复一次；

c：洗脱杂蛋白：用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM，100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白；

d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流川样品，制样，12％SDS-PAGE检测。

(3)换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400rpm)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复1次，得到GALS、FSA(A129T/A165G)蛋白。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/mL，即得到GALS、FSA(A129T/A165G)蛋白。

实施例4L-木糖的合成

1：甲醛；2：羟基乙醛；3：甘油醛；4：L-木糖；GALS：羟基乙醛合酶；FSA(A129T/A165G)：D-果糖-6-磷酸醛缩酶突变体。

(1)衍生试剂配制(1mL)：将21.1mg苄氧胺盐酸盐溶于660μL吡啶，加入300μL甲醇，40μL H₂O，混匀，4℃下保存。

(2)反应条件：2g/L甲醛，50mM三乙醇胺缓冲液，pH 7.4，1mg/mL GALS，1mg/mL FSA(A129T/A165G)，25℃震荡反应24h。取10μL样品，加入50μL衍生试剂，50℃下反应1h，加入140μL甲醇，过滤，HPLC检测。

HPLC检测条件：流动相：A：0.1％(v/v)三氟乙酸TFA；B：溶于80％CH₃CN的0.095％(v/v)TFA。洗脱梯度：16min内B流动相从20％-60％。柱子：X-Bridge TM C18,5μm,4.6×250mm。流速：1mL/min，检测波长：215nm，柱温箱温度：35℃，进样量：20μL。检测结果如图2所示。加了GALS和FSA(A129T/A165G)后，可以直接从甲醛合成木糖，在1g/L甲醛的条件下，转化率可达65％(图3)。

SEQ ID NO.1-6如下所示：

SEQ ID NO.1：BFD的氨基酸序列

MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNAWNSHSPLIVTAGQQTRAMIGVEALLTNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYHQYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGALRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK*

SEQ ID NO.2：BFD基因序列：

ATGGCTTCTGTTCACGGTACCACCTACGAACTGCTGCGTCGTCAGGGTATCGACACCGTTTTCGGTAACCCGGGTTCTAACGAACTGCCGTTCCTGAAAGACTTCCCGGAAGACTTCCGTTACATCCTGGCTCTGCAGGAAGCTTGCGTTGTTGGTATCGCTGACGGTTACGCTCAGGCTTCTCGTAAACCGGCTTTCATCAACCTGCACTCTGCTGCTGGTACCGGTAACGCTATGGGTGCTCTGTCTAACGCTTGGAACTCTCACTCTCCGCTGATCGTTACCGCTGGTCAGCAGACCCGTGCTATGATCGGTGTTGAAGCTCTGCTGACCAACGTTGACGCTGCTAACCTGCCGCGTCCGCTGGTTAAATGGTCTTACGAACCGGCTTCTGCTGCTGAAGTTCCGCACGCTATGTCTCGTGCTATCCACATGGCTTCTATGGCTCCGCAGGGTCCGGTTTACCTGTCTGTTCCGTACGACGACTGGGACAAAGACGCTGACCCGCAGTCTCACCACCTGTTCGACCGTCACGTTTCTTCTTCTGTTCGTCTGAACGACCAGGACCTGGACATCCTGGTTAAAGCTCTGAACTCTGCTTCTAACCCGGCTATCGTTCTGGGTCCGGACGTTGACGCTGCTAACGCTAACGCTGACTGCGTTATGCTGGCTGAACGTCTGAAAGCTCCGGTTTGGGTTGCTCCGTCTGCTCCGCGTTGCCCGTTCCCGACCCGTCACCCGTGCTTCCGTGGTCTGATGCCGGCTGGTATCGCTGCTATCTCTCAGCTGCTGGAAGGTCACGACGTTGTTCTGGTTATCGGTGCTCCGGTTTTCCGTTACCACCAGTACGACCCGGGTCAGTACCTGAAACCGGGTACCCGTCTGATCTCTGTTACCTGCGACCCGCTGGAAGCTGCTCGTGCTCCGATGGGTGACGCTATCGTTGCTGACATCGGTGCTATGGCTTCTGCTCTGGCTAACCTGGTTGAAGAATCTTCTCGTCAGCTGCCGACCGCTGCTCCGGAACCGGCTAAAGTTGACCAGGACGCTGGTCGTCTGCACCCGGAAACCGTTTTCGACACCCTGAACGACATGGCTCCGGAAAACGCTATCTACCTGAACGAATCTACCTCTACCACCGCTCAGATGTGGCAGCGTCTGAACATGCGTAACCCGGGTTCTTACTACTTCTGCGCTGCTGGTGGTCTGGGTTTCGCTCTGCCGGCTGCTATCGGTGTTCAGCTGGCTGAACCGGAACGTCAGGTTATCGCTGTTATCGGTGACGGTTCTGCTAACTACTCTATCTCTGCTCTGTGGACCGCTGCTCAGTACAACATCCCGACCATCTTCGTTATCATGAACAACGGTACCTACGGTGCTCTGCGTTGGTTCGCTGGTGTTCTGGAAGCTGAAAACGTTCCGGGTCTGGACGTTCCGGGTATCGACTTCCGTGCTCTGGCTAAAGGTTACGGTGTTCAGGCTCTGAAAGCTGACAACCTGGAACAGCTGAAAGGTTCTCTGCAGGAAGCTCTGTCTGCTAAAGGTCCGGTTCTGATCGAAGTTTCTACCGTTTCTCCGGTTAAATAA

SEQ ID NO.3：GALS的氨基酸序列：

MASVHGTTYELLRRQGIDTVFGNPGSNELPFLKDFPEDFRYILALQEACVVGIADGYAQASRKPAFINLHSAAGTGNAMGALSNARTSHSPLIVTAGQQTRAMIGVEAGETNVDAANLPRPLVKWSYEPASAAEVPHAMSRAIHMASMAPQGPVYLSVPYDDWDKDADPQSHHLFDRHVSSSVRLNDQDLDILVKALNSASNPAIVLGPDVDAANANADCVMLAERLKAPVWVAPSAPRCPFPTRHPCFRGLMPAGIAAISQLLEGHDVVLVIGAPVFRYVFYDPGQYLKPGTRLISVTCDPLEAARAPMGDAIVADIGAMASALANLVEESSRQLPTAAPEPAKVDQDAGRLHPETVFDTLNDMAPENAIYLNESTSTTAQMWQRLNMRNPGSYYFCAAGGLGFALPAAIGVQLAEPERQVIAVIGDGSANYSISALWTAAQYNIPTIFVIMNNGTYGMLRWFAGVLEAENVPGLDVPGIDFRALAKGYGVQALKADNLEQLKGSLQEALSAKGPVLIEVSTVSPVK*

SEQ ID NO.4：GALS的基因序列：

ATGGCTTCTGTTCACGGTACCACCTACGAACTGCTGCGTCGTCAGGGTATCGACACCGTTTTCGGTAACCCGGGTTCTAACGAACTGCCGTTCCTGAAAGACTTCCCGGAAGACTTCCGTTACATCCTGGCTCTGCAGGAAGCTTGCGTTGTTGGTATCGCTGACGGTTACGCTCAGGCTTCTCGTAAACCGGCTTTCATCAACCTGCACTCTGCTGCTGGTACCGGTAACGCTATGGGTGCTCTGTCTAACGCTCGTACCTCTCACTCTCCGCTGATCGTTACCGCTGGTCAGCAGACCCGTGCTATGATCGGTGTTGAAGCTGGTGAAACCAACGTTGACGCTGCTAACCTGCCGCGTCCGCTGGTTAAATGGTCTTACGAACCGGCTTCTGCTGCTGAAGTTCCGCACGCTATGTCTCGTGCTATCCACATGGCTTCTATGGCTCCGCAGGGTCCGGTTTACCTGTCTGTTCCGTACGACGACTGGGACAAAGACGCTGACCCGCAGTCTCACCACCTGTTCGACCGTCACGTTTCTTCTTCTGTTCGTCTGAACGACCAGGACCTGGACATCCTGGTTAAAGCTCTGAACTCTGCTTCTAACCCGGCTATCGTTCTGGGTCCGGACGTTGACGCTGCTAACGCTAACGCTGACTGCGTTATGCTGGCTGAACGTCTGAAAGCTCCGGTTTGGGTTGCTCCGTCTGCTCCGCGTTGCCCGTTCCCGACCCGTCACCCGTGCTTCCGTGGTCTGATGCCGGCTGGTATCGCTGCTATCTCTCAGCTGCTGGAAGGTCACGACGTTGTTCTGGTTATCGGTGCTCCGGTTTTCCGTTACGTTTTTTACGACCCGGGTCAGTACCTGAAACCGGGTACCCGTCTGATCTCTGTTACCTGCGACCCGCTGGAAGCTGCTCGTGCTCCGATGGGTGACGCTATCGTTGCTGACATCGGTGCTATGGCTTCTGCTCTGGCTAACCTGGTTGAAGAATCTTCTCGTCAGCTGCCGACCGCTGCTCCGGAACCGGCTAAAGTTGACCAGGACGCTGGTCGTCTGCACCCGGAAACCGTTTTCGACACCCTGAACGACATGGCTCCGGAAAACGCTATCTACCTGAACGAATCTACCTCTACCACCGCTCAGATGTGGCAGCGTCTGAACATGCGTAACCCGGGTTCTTACTACTTCTGCGCTGCTGGTGGTCTGGGTTTCGCTCTGCCGGCTGCTATCGGTGTTCAGCTGGCTGAACCGGAACGTCAGGTTATCGCTGTTATCGGTGACGGTTCTGCTAACTACTCTATCTCTGCTCTGTGGACCGCTGCTCAGTACAACATCCCGACCATCTTCGTTATCATGAACAACGGTACCTACGGTATGCTGCGTTGGTTCGCTGGTGTTCTGGAAGCTGAAAACGTTCCGGGTCTGGACGTTCCGGGTATCGACTTCCGTGCTCTGGCTAAAGGTTACGGTGTTCAGGCTCTGAAAGCTGACAACCTGGAACAGCTGAAAGGTTCTCTGCAGGAAGCTCTGTCTGCTAAAGGTCCGGTTCTGATCGAAGTTTCTACCGTTTCTCCGGTTAAATAA

SEQ ID NO.5：FSA的氨基酸序列：

MELYLDTANVAEVERLARIFPIAGVTTNPSIIAASKESIWEVLPRLQKAIGDEGILFAQTMSRDAQGMVKEAKHLRDAIPGIVVKIPVTSEGLAAIKMLKKEGITTLGTAVYSAAQGLLAALAGAKYVAPYVNRVDAQGGDGIRTVQELQALLEMHAPESMVLAASFKTPRQALDCLLAGCESITLPLDVAQQMLNTPAVESAIEKFEHDWNAAFDTTHL

SEQ ID NO.6：FSA的基因序列：

ATGGAACTGTATCTGGACACCGCTAACGTCGCAGAAGTCGAACGTCTGGCACGCATATTCCCGATTGCCGGGGTGACAACTAACCCGAGCATTATCGCTGCCAGCAAGGAGTCCATCTGGGAAGTGCTGCCGCGCCTTCAAAAAGCGATCGGTGATGAGGGCATTCTGTTTGCTCAGACCATGAGCCGCGACGCGCAGGGTATGGTGAAAGAAGCGAAACACCTGCGCGACGCTATTCCGGGCATTGTGGTGAAAATTCCGGTAACCTCTGAAGGTCTGGCAGCAATTAAAATGCTGAAGAAAGAAGGCATTACTACGCTGGGAACCGCAGTGTACAGCGCCGCGCAAGGATTACTGGCGGCGCTGGCTGGAGCCAAATACGTTGCTCCATACGTTAACCGCGTAGATGCCCAGGGCGGTGACGGCATTCGTACTGTACAGGAGTTGCAAGCGTTACTGGAAATGCATGCGCCAGAAAGCATGGTGCTGGCTGCCAGCTTTAAAACACCACGTCAGGCGCTGGATTGTTTGCTGGCTGGATGTGAATCCATCACACTGCCCTTAGATGTAGCGCAACAAATGCTTAACACCCCTGCGGTAGAGTCAGCTATAGAGAAGTTCGAGCACGACTGGAATGCCGCATTTGACACTACTCATCTCTAASEQ ID NO.7：FSA(A129T/A165G)的氨基酸序列：

MELYLDTSDVVAVKALSRIFPLAGVTTNPSIIAAGKKPLDVVLPQLHEAMGGQGRLFAQVMATTAEGMVNDALKLRSIIADIVVKVPVTAEGLAAIKMLKAEGIPTLGTAVYGAAQGLLSALAGAEYVAPYVNRIDAQGGSGIQTVTDLHQLLKMHAPQAKVLAASFKTPRQALDCLLAGCESITLPLDVAQQMISYPAVDAAVAKFEQDWQGAFGRTSI

SEQ ID NO.8：FSA(A129T/A165G)的基因序列

atggaactgtatctggatacttcagacgttgttgcggtgaaggcgctgtcacgtatttttccgctggcgggtgtgaccactaacccaagcattatcgccgcgggtaaaaaaccgctggatgttgtgcttccgcaacttcatgaagcgatgggcggtcaggggcgtctgtttgcccaggtaatggctaccactgccgaagggatggttaatgacgcgcttaagctgcgttctattattgcggatatcgtggtgaaagttccggtgaccgccgaggggctggcagctattaagatgttaaaagcggaagggattccgacgctgggaaccgcggtatatggcgcagcacaagggctgctgtcggcgctggcaggtgcggaatatgttgcgccttacgttaatcgtattgatgctcagggcggtagcggcattcagactgtgaccgacttacaccagttattgaaaatgcatgcgccgcaggcgaaagtgctggcagcgagtttcaaaaccccgcgtcaggcgctggactgcttactggcaggatgtgaatcaattactctgccactggatgtggcacaacagatgattagctatccggcggttgatgccgctgtggcgaagtttgagcaggactggcagggagcgtttggcagaacgtcgatt

以上对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生物合成木糖的方法

<130> CPCN20110550

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 528

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 1

Met Ala Ser Val His Gly Thr Thr Tyr Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly

1 5 10 15

Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Ser Asn Glu Leu Pro Phe Leu

20 25 30

Lys Asp Phe Pro Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Glu Ala

35 40 45

Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro

50 55 60

Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Asn Ala Trp Asn Ser His Ser Pro Leu Ile Val Thr Ala

85 90 95

Gly Gln Gln Thr Arg Ala Met Ile Gly Val Glu Ala Leu Leu Thr Asn

100 105 110

Val Asp Ala Ala Asn Leu Pro Arg Pro Leu Val Lys Trp Ser Tyr Glu

115 120 125

Pro Ala Ser Ala Ala Glu Val Pro His Ala Met Ser Arg Ala Ile His

130 135 140

Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr

145 150 155 160

Asp Asp Trp Asp Lys Asp Ala Asp Pro Gln Ser His His Leu Phe Asp

165 170 175

Arg His Val Ser Ser Ser Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Asp Ile

180 185 190

Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly

195 200 205

Pro Asp Val Asp Ala Ala Asn Ala Asn Ala Asp Cys Val Met Leu Ala

210 215 220

Glu Arg Leu Lys Ala Pro Val Trp Val Ala Pro Ser Ala Pro Arg Cys

225 230 235 240

Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly

245 250 255

Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Val Val Leu Val

260 265 270

Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr

275 280 285

Leu Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ile Ser Val Thr Cys Asp Pro Leu Glu

290 295 300

Ala Ala Arg Ala Pro Met Gly Asp Ala Ile Val Ala Asp Ile Gly Ala

305 310 315 320

Met Ala Ser Ala Leu Ala Asn Leu Val Glu Glu Ser Ser Arg Gln Leu

325 330 335

Pro Thr Ala Ala Pro Glu Pro Ala Lys Val Asp Gln Asp Ala Gly Arg

340 345 350

Leu His Pro Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Asp Met Ala Pro Glu

355 360 365

Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp

370 375 380

Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala

385 390 395 400

Gly Gly Leu Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ile Gly Val Gln Leu Ala

405 410 415

Glu Pro Glu Arg Gln Val Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ala Asn

420 425 430

Tyr Ser Ile Ser Ala Leu Trp Thr Ala Ala Gln Tyr Asn Ile Pro Thr

435 440 445

Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Ala Leu Arg Trp Phe

450 455 460

Ala Gly Val Leu Glu Ala Glu Asn Val Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly

465 470 475 480

Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Lys Gly Tyr Gly Val Gln Ala Leu Lys

485 490 495

Ala Asp Asn Leu Glu Gln Leu Lys Gly Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ser

500 505 510

Ala Lys Gly Pro Val Leu Ile Glu Val Ser Thr Val Ser Pro Val Lys

515 520 525

<210> 2

<211> 1587

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 2

atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60

ttcggtaacc cgggttctaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120

tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180

tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240

gctctgtcta acgcttggaa ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300

cgtgctatga tcggtgttga agctctgctg accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360

ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420

cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480

gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540

tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600

tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660

gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720

ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780

tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840

caccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900

gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960

atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020

ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080

accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140

gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200

ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260

caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320

gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtgct 1380

ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440

atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500

gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560

gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587

<210> 3