阅读说明：本技术 水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用 (Application of salicylic acid or proline in high-temperature cultivation of lentinus edodes ) 是由 赵媛 高淑敏 谭玉辉 段晓明 徐鸿雁 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及食用菌培育技术领域,具体来说是水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用,本发明的用于香菇高温栽培的耐高温培养基由马铃薯培养基、浓度为10-50mg/L的水杨酸或浓度为10-50mg/L的脯氨酸组成,调节pH至7.2-7.4,本发明还公开了耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法,本发明通过水杨酸或者脯氨酸来替代现有技术的外源物质,不仅增强了香菇的耐高温性能,而且水杨酸或者脯氨酸均廉价易得,从而有效降低了香菇菌种菌落培育的成本。(The invention relates to the technical field of edible mushroom cultivation, in particular to application of salicylic acid or proline in high-temperature cultivation of mushrooms, wherein a high-temperature-resistant culture medium for high-temperature cultivation of mushrooms comprises a potato culture medium, salicylic acid with the concentration of 10-50 mg/L or proline with the concentration of 10-50 mg/L, and the pH is adjusted to 7.2-7.4.)

水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用

技术领域

本发明涉及食用菌培育技术领域，具体来说是水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用。

背景技术

温度是影响香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler生长发育的重要环境因素之一，热胁迫常引起香菇菌丝凋亡和菌棒腐烂，降低香菇菌丝对杂菌的抗性，造成重大的经济损失；另外，高温易引发菇体畸形、继发性不出菇等，成为局部严重减产甚至绝收的主要问题；因此耐高温性成为食用菌抗逆性评价的首选指标。高温胁迫下，生物体细胞中通常会积累大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)物质，进而对生物的生长发育、产量及产品品质产生不良影响。近年来真菌在热胁迫下的应激反应受到广泛关注，糙皮侧耳Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm.、双孢蘑菇Agaricus bisporus(Lange)Sing.、白灵菇P.nebrodensis(Inzengae)Quèl.、灵芝Ganoderma lingzhi Sheng H.Wu et al.等真菌热胁迫下的应激反应与耐热机制研究已取得一定进展，这些物种的细胞内在遭受外界高温胁迫后都存在ROS积累的现象，ROS在细胞内的大量积累通常会对细胞造成多种损伤，对生物膜系统的损伤是其中一种，硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量通常用以衡量胁迫条件下质膜受氧化损伤的程度。生物体内的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)，在生物体抵抗氧化胁迫、清除ROS方面具有重要作用。

生物体在长期进化过程中，通过合成渗透调节物质或诱导抗氧化酶基因表达等方式，增强生物体的高温耐受性，进而减轻高温逆境对生物体的伤害。已有研究表明外施水杨酸可以提高植物对高温的忍耐性，但这种效果因水杨酸的处理浓度而异。纪秀娥等的研究表明低浓度的对所试3株平菇菌丝生长具有明显促进作用，浓度较高时则呈现抑制作用。刘凤民等的研究表明水杨酸通过提高SOD活性、调节渗透压平衡来降低高温胁迫对植物细胞膜结构和功能的损伤、减少叶绿素降解、保护蛋白质分子正常的生理功能，从而提高蓝莓的耐热性；杨晖等人的研究表明在香菇液体培养的过程中添加较高浓度的水杨酸，能诱导产生更多胞外酶，从而缓解镉对香菇菌丝的毒害。脯氨酸(Pro)是一种小分子的渗透物质，是水溶性最大的氨基酸，在各种胁迫条件下，在真细菌、原生动物、海洋无脊椎动物和植物体中都会发生Pro的积累，已有报道，植物在盐、干旱、高低温、重金属、病菌侵入、厌氧、营养不足、大气污染和UV福射条件下都会发生Pro的积累。

现有技术中通过添加外源物质来缓解香菇的高温胁迫，目前主要添加的外源物质有IAA、NAA、2,4-D、γ－氨基丁酸(GABA)和海藻糖，但是这些外源物质价格较高且生产应用成本大，因此增加了香菇种植中的成本。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供了水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用，本发明通过水杨酸或者脯氨酸来替代现有技术的外源物质，不仅增强了香菇的耐高温性能，而且水杨酸或者脯氨酸均廉价易得，从而有效降低了香菇菌种菌落培育的成本。

为解决上述技术问题，本发明第一个目的是提供水杨酸或脯氨酸在香菇高温栽培中的应用。

本发明第二个目的是提供了一种用于香菇高温栽培的耐高温培养基，所述培养基由马铃薯培养基、浓度为10-50mg/L的水杨酸或浓度为10-50mg/L的脯氨酸组成，调节pH至7.2-7.4。

优选的，所述培养基由马铃薯培养基、浓度为25-50mg/L的水杨酸或浓度为10-25mg/L的脯氨酸组成，调节pH至7.2-7.4。

优选的，所述培养基由马铃薯培养基、浓度为25mg/L的水杨酸或浓度为10mg/L的脯氨酸组成，调节pH至7.2-7.4。

基于上述耐高温培养基，本发明还提供了该培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

将香菇菌种菌落接种到马铃薯培养基平板上进行活化处理，得到活化菌种；

(2)最适浓度测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种至添加不同浓度水杨酸或脯氨酸的马铃薯培养基平板上，在25℃下培养，采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

其中，所述水杨酸或者脯氨酸的浓度分别为10-50mg/L；

(3)高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种至添加了不同浓度水杨酸或脯氨酸的马铃薯固体培养基上，于30℃下持续高温培养，观察菌丝的生长状况并采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

其中，所述水杨酸或者脯氨酸的浓度分别为10-50mg/L；

(4)交叉高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种至添加了不同浓度水杨酸或脯氨酸的马铃薯培养基上，在25℃避光培养5-7d后置于40℃避光处理24h进行高温胁迫；高温胁迫后再放回到25℃避光培养，并采用十字交叉法测量菌丝生长的速率；

其中，所述水杨酸或者脯氨酸的浓度分别为10-50mg/L。

优选的，所述步骤(1)的活化处理方法为：将香菇菌种菌落接种到马铃薯培养基平板上，菌丝面朝上，在25℃下避光培养5d。

本发明还提供了一种香菇高温栽培方法，包括使用上述耐高温培养基。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明在前期研究中发现，外源添加水杨酸能够提高香菇菌丝的耐高温能力，水杨酸(Salicylicacid，SA)是植物体内产生的一种简单酚类化合物，被认为是一种植物内源信号分子和新的植物激素，真菌细胞内有和高等植物相似的代谢途径；脯氨酸作为外源物质在缓解温度逆境等非生物胁迫对生物体造成的伤害方面具有重要的应用价值，目前有关脯氨酸的抗逆境胁迫研究主要是针对植物作为主要的研究对象，而在食用菌抗逆境胁迫方面研究甚少。本研究以香菇为材料，通过比较外源添加水杨酸或者外源添加脯氨酸在处理前后的菌丝生物量、生物体内的抗氧化酶活性等，研究热胁迫下外源添加水杨酸或脯氨酸对香菇菌丝耐热能力、生物量及氧化-抗氧化系统的影响，为建立香菇耐高温栽培技术体系提供技术支撑。

2、研究表明，添加25mg/L水杨酸的马铃薯培养基，香菇的生物量是对比例1(空白对照组)的1.5倍；添加水杨酸后菌丝体内SOD活性的增幅达到热处理前的3.12倍，大于对比例1(空白对照组)的1.76倍；添加水杨酸后菌丝体内CAT活性的增幅达到热处理前的2.01倍，为25℃处理的1.82倍；处理后的POD活性比同等条件下的对比例1(空白对照组)高。

当水杨酸的浓度均达到25mg/L的条件下，在最适浓度测试25℃培养后，培养5d后菌落直径达7.22mm；高温胁迫测试30℃培养后，菌丝体生长速度是对比例1(空白对照组)生长速率的10.1倍，在交叉高温胁迫测试后，菌丝体生长速度是对比例1(空白对照组)生长速率的4.6倍，在添加水杨酸的马铃薯培养基中，25mg/L水杨酸为最佳培养浓度。

研究表面，添加10mg/L脯氨酸的马铃薯培养基，香菇的生物量是对比例1(空白对照组)的0.6倍；添加脯氨酸后菌丝体内SOD活性的增幅达到热处理前的1.94倍；添加脯氨酸后菌丝体内CAT活性的增幅达到热处理前的1.21倍，处理后的POD活性比同等条件下的对比例1(空白对照组)高。

当脯氨酸的浓度均达到10mg/L的条件下，在最适浓度测试25℃培养后，培养5d后菌落直径达5.29mm；高温胁迫测试30℃培养后，菌丝体生长速度是对比例1(空白对照组)生长速率的3.3倍，在交叉高温胁迫测试后，菌丝体生长速度是对比例1(空白对照组)生长速率的1.2倍，在添加脯氨酸的马铃薯培养基中，10mg/L脯氨酸为最佳培养浓度。

附图说明

图1为本发明实施例1-实施例3及对比例1在25℃培养5d，添加不同浓度水杨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

图2为本发明实施例1-实施例3及对比例1在30℃培养16d，添加不同浓度水杨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

图3为本发明实施例1-实施例3及对比例1在25℃避光培养5-7d后置于40℃避光培养24h；再放回到25℃避光培养6d，添加不同浓度水杨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

其中，图1-图3中的ck均为马铃薯培养基，10均为含10mg/L水杨酸的马铃薯培养基，25均为含25mg/L水杨酸的马铃薯培养基，50均为含50mg/L水杨酸的马铃薯培养基；

图4为本发明为本发明实施例4-实施例6及对比例1在25℃培养5d，添加不同浓度脯氨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

图5为本发明实施例4-实施例6及对比例1在30℃培养16d，添加不同浓度脯氨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

图6为本发明实施例4-实施例6及对比例1在25℃避光培养5-7d后置于40℃避光培养24h；再放回到25℃避光培养6d，添加不同浓度脯氨酸培养基培养香菇菌丝体生长差异情况；

其中，图4-图6中的ck均为马铃薯培养基，10均为含10mg/L脯氨酸的马铃薯培养基，25均为含25mg/L脯氨酸的马铃薯培养基，50均为含50mg/L脯氨酸的马铃薯培养基。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，用以较佳的实施例及附图1-6配合详细的说明。

本发明使用的香菇菌种336093均是由北京北纳创联生物技术研究院购得；

水杨酸(Salicylicacid，SA)是植物体内产生的一种简单酚类化合物，被认为是一种植物内源信号分子和新的植物激素，能够提高香菇的耐高温性能；脯氨酸(Pro)是一种小分子的渗透物质，是水溶性最大的氨基酸，脯氨酸作为外源物质在缓解温度逆境等非生物胁迫对生物体造成的伤害方面具有重要的应用价值，以下通过实施例1-实施例6的测试方法来对水杨酸和脯氨酸的浓度进行选择和研究，其中实施例1-实施例6及对比例1使用的马铃薯培养基均由以下原料组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL。

实施例1

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

用5mm打孔器在供试菌株菌落边缘处打孔，接种到马铃薯培养基平板中央，菌丝面朝上，在最适生长温度25℃恒温避光培养5d活化备用；

(2)外源水杨酸最适浓度测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种从菌落边缘取1个接种块(直径5mm)，转接至已铺玻璃纸并添加10mg/L水杨酸的马铃薯培养基平板(直径90mm)中央，在25℃下培养，采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(3)高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了10mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基上，直接在30℃下持续高温培养，观察菌丝的生长状况并采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(4)交叉高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了10mg/L水杨酸的马铃薯培养基上，在25℃避光培养5d后置于40℃避光处理24h；高温胁迫后再放回到25℃避光培养，观察菌丝是否能恢复生长，并采用十字交叉法测量菌丝生长的速率。

实施例2

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

用5mm打孔器在供试菌株菌落边缘处打孔，接种到马铃薯培养基平板中央，菌丝面朝上，在最适生长温度25℃恒温避光培养5d活化备用；

(2)外源水杨酸最适浓度测试

将步骤(1)得到的活化菌种从菌落边缘取1个接种块(直径5mm)，转接至已铺玻璃纸并添加浓度为25mg/L水杨酸的马铃薯培养基平板(直径90mm)中央，在25℃下培养，采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(3)高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了25mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基上，于30℃下持续高温培养，观察菌丝的生长状况并采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(4)交叉高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了浓度为25mg/L水杨酸的马铃薯培养基上，在25℃避光培养6d后置于40℃避光处理24h；高温胁迫后再放回到25℃避光培养，观察菌丝是否能恢复生长，并采用十字交叉法测量菌丝生长的速率。

实施例3

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

用5mm打孔器在供试菌株菌落边缘处打孔，接种到马铃薯培养基平板中央，菌丝面朝上，在最适生长温度25℃恒温避光培养5d活化备用；

(2)外源水杨酸最适浓度测试

将步骤(1)得到的活化菌种从菌落边缘取1个接种块(直径5mm)，转接至已铺玻璃纸并添加浓度为50mg/L的水杨酸马铃薯培养基平板(直径90mm)中央，在25℃下培养，采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(3)高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了不同浓度为50mg/L水杨酸脯氨酸的马铃薯固体培养基上，直接在30℃下持续高温培养，观察菌丝的生长状况并采用十字交叉法测量菌丝生长的速度；

(4)交叉高温胁迫测试

将步骤(1)得到的活化菌种接种于添加了浓度为50mg/L水杨酸的马铃薯培养基上，在25℃避光培养7d后置于40℃避光处理24h；高温胁迫后再放回到25℃避光培养，观察菌丝是否能恢复生长，并采用十字交叉法测量菌丝生长的速率。

实施例4

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

与实施例1的操作步骤相同，不同之处仅在于，将添加了10mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基替换为添加了10mg/L脯氨酸的马铃薯固体培养基。

实施例5

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

与实施例2的操作步骤相同，不同之处仅在于，将添加了25mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基替换为添加了25mg/L脯氨酸的马铃薯固体培养基。

实施例6

一种通过耐高温培养基在增强香菇耐高温性能的测试方法，包括如下步骤：

与实施例3的操作步骤相同，不同之处仅在于，将添加了50mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基替换为添加了50mg/L脯氨酸的马铃薯固体培养基。

对比例1

与实施例2的操作步骤相同，不同之处仅在于，将添加了25mg/L水杨酸的马铃薯固体培养基替换为马铃薯固体培养基。

下面对香菇菌丝体的液体培养与相关指标进行测定，具体测定了菌丝体生物量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力及过氧化物酶(POD)活力，测定方法及测定结果如下所示：

测定方法：

(1)菌丝体生物量的测定

将配制好的马铃薯液体培养基分别装入250mL的三角瓶内，每瓶装液量为150mL，灭菌、冷却至室温备用；将培养液分成3组，仅为马铃薯培养基为空白对照组(对比例1)，添加外源物质为处理组，处理组分为2组，其中一组在马铃薯培养基内添加25mg/L的水杨酸，另一组在马铃薯培养基内添加10mg/L的脯氨酸，每瓶接种两个直径为5mm的菌丝块，每个处理重复5次，接种后于25℃静置培养25d，过滤培养液收获菌丝体，再用蒸馏水冲洗2–3次，将菌丝体在60℃烘箱中烘干至恒重，用电子分析天平称重获得菌丝体生物量的数据；

在液体马铃薯培养基中添加浓度为25mg/L的水杨酸，研究了添加外源水杨酸对香菇生物量的影响，外源添加水杨酸显著提高了香菇生物量，添加水杨酸的生物量是对照组的1.5倍；

在液体马铃薯培养基中添加浓度为10mg/L的脯氨酸，研究了添加外源脯氨酸对香菇生物量的影响，外源添加脯氨酸提高了香菇生物量，添加脯氨酸的生物量是对照组的0.6倍。

(2)粗酶液的制备

以马铃薯固体培养基为对照(对比例1)，添加25mg/L的水杨酸(实施例2)或10mg/L脯氨酸(实施例4)为处理组，用5mm打孔器在活化好的供试菌株菌落边缘处打孔，将菌丝块接种于加铺玻璃纸的马铃薯固体培养基平板中央，每个处理接种30个平板，25℃避光培养，培养14d后，每个处理各取15皿分别置于40℃和25℃环境中处理24h，然后刮取各处理的菌丝体，于-80℃超低温冰箱保存。取各处理菌丝0.5g，与2.5mL、50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)充分混匀，经液氮研磨，12000×g低温(4℃)离心15min后，取上清液进行抗氧化酶活性测量。

①超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用氮蓝四唑(NBT)法。3mL的反应体系含有50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.8，含0.1mmol/L的EDTA)，75μmol/L的NBT，13mmol/L甲硫氨酸(Met)，2μmol/L核黄素以及酶液；对照管中加入50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.8，含0.1mmol/L的EDTA)。混匀后用双层黑色硬纸套遮光，与其他反应液同时置于光照培养箱内(25℃)显色反应20min，反应结束后用黑布罩遮盖试管终止反应。以暗中对照管作空白(调零)，于560nm下测定吸光度值；以抑制NBT光还原反应50％所需的酶量为一个酶活性单位；

经高温处理，对照组和处理组的SOD活性在热激后都显著增加，添加水杨酸后菌丝体内SOD活性的增幅达到热处理前的3.12倍，大于对照的1.76。添加脯氨酸后菌丝体内SOD活性的增幅为1.94。

②过氧化氢酶(CAT)活力测定

1mL的反应液中含50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，200mmol/L的H₂O₂和酶液，对照管中加入50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)。从加入H₂O₂开始计时反应2min，于240nm下测定吸光度值，根据H₂O₂的消耗量计算CAT活力。H₂O₂的消光系数为40mM^-1cm^-1；

经高温处理，对照组和处理组的CAT活性在热激后都显著增加，对照组增加了2.01倍，添加水杨酸的CAT活性，为25℃处理的1.82倍。添加脯氨酸的增幅1.21倍。

③过氧化物酶(POD)活力测定

3mL的反应液中含10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，0.2％愈创木酚和0.04mL酶液，再加入3mmol/L的H₂O₂并室温反应5min，于470nm处测定吸光度值。根据愈创木酚脱氢产物(GDHP)的生成量计算POD的活力，其消光系数为26.6mM^-1cm^-1；

处理后的POD活性比同等条件下的对照组高；

由上述结果可知，高温胁迫改变了SOD、CAT、POD活性，添加外源水杨酸或脯氨酸处理的336093菌株酶活性变化幅度存在差异。

三、实验结果

1、外源水杨酸或脯氨酸最适浓度筛选测试

如图1及图4所示，香菇336093经实施例1-实施例6的不同浓度水杨酸或不同浓度脯氨酸处理后，菌丝体生长速度表现出差异；336093菌丝生长情况以实施例2的25mg/L水杨酸处理浓度最好，培养5d后菌落直径达7.22mm，显著大于对比例1处理的4.32mm；另外，在实施例1的10mg/L的水杨酸以及在实施例3的50mg/L的水杨酸条件下，处理的菌落直径也大于对比例1的空白处理，但与对比例1相比，实施例3的50mg/L的水杨酸条件下差异更加显著，实施例1的10mg/L的水杨酸条件下差异不显著。如图4所示，实施例4-实施例6在添加不同浓度的脯氨酸条件下，菌丝生长速度都比对照组(对比例1)快；当实施例6的脯氨酸的浓度为50mg/L时，与对比例1相比菌丝生长速度无显著性差异，实施例4及实施例5脯氨酸的浓度分别为10mg/L和25mg/L时的长速相对较快(图4)，其中添加浓度为10mg/L脯氨酸的马铃薯培养基为培养浓度最好，培养5d后菌落直径达5.29mm。

2、高温生长处理

如图2及图5所示，香菇336093经不同浓度水杨酸或不同浓度脯氨酸处理后，在30℃培养后，添加外源水杨酸的实施例1-实施例3的样品，菌丝体生长速度显著大于对比例例1中未添加外源水杨酸及脯氨酸的对照组，其中实施例2的添加浓度为25mg/L水杨酸的马铃薯培养基处理浓度最好，是对照组生长速率的10.1倍。如图5所示，添加外源脯氨酸的实验组，菌丝体生长速度显著大于未添加的对照组(对比例1)，其中10mg/L处理浓度最好，是对照组生长速率的3.3倍。

3、高温胁迫处理

如图3及图6所示，将香菇供试菌株接种于添加了不同浓度水杨酸或脯氨酸的马铃薯培养基上，在25℃避光培养6d后置于40℃避光处理24h，高温胁迫后再放回到25℃避光培养，由图3及图6看出，实施例1-实施例6对香菇菌种菌落进行处理后都产生高温抑制圈，由图3看出，实施例2在25℃避光培养5d后恢复生长，对比例1在25℃避光培养8d后恢复生长，其中实施例2的25mg/L水杨酸处理浓度最好，是对照组生长速率的4.6倍。如图6所示，脯氨酸处理组25℃避光培养6d后恢复生长，对照组25℃避光培养8d后恢复生长，其中10mg/L脯氨酸处理浓度最好，是对照组生长速率的1.2倍。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。