一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法
阅读说明：本技术 一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法 (Circulating detection system and method for detecting pig red blood cell immunoadhesion function ) 是由 尹伟 侯震 范阔海 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 李宏全 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法,该系统包括：流动小室、垫圈、流动相储液瓶、蠕动泵、硅胶软管以及设置有载玻片的细胞培养皿,所述垫圈垫于所述载玻片边缘上,所述流动小室盖于垫圈上；再以硅胶软管将流动小室、流动相储液瓶、蠕动泵依次相连,构成循环检测系统；所述流动相储液瓶内注入免疫粘附致敏GFP-E.coli的猪红细胞悬液。本发明提供的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法,构建了一套循环检测体系,可用于流动相流速、剪切力以及最大保持时间等工作参数的检测和分析。(The invention discloses a circulating detection system and a method for detecting the immunoadhesion function of pig red blood cells, wherein the system comprises the following components: the device comprises a small flow chamber, a gasket, a mobile phase liquid storage bottle, a peristaltic pump, a silica gel hose and a cell culture dish provided with a glass slide, wherein the gasket is padded on the edge of the glass slide, and the small flow chamber covers the gasket; then the mobile chamber, the mobile phase liquid storage bottle and the peristaltic pump are sequentially connected through a silica gel hose to form a circulation detection system; injecting an immunoadhesion sensitized GFP-E.coli porcine red blood cell suspension into the mobile phase liquid storage bottle. The invention provides a circulating detection system and a method for detecting the immunoadhesion function of pig red blood cells, which construct a set of circulating detection system and can be used for detecting and analyzing working parameters such as flow velocity of a mobile phase, shearing force, maximum retention time and the like.)
技术领域
本发明涉及猪红细胞免疫粘附功能检测技术领域，特别是涉及一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法。
背景技术
人和多种动物的红细胞与白细胞一样，具有重要的免疫功能，其基础是红细胞表面具有C3b受体，红细胞可通过表面的C3b受体发挥清除免疫复合物、促进吞噬、提呈抗原及激活补体等多种作用，因此，建立检测红细胞免疫功能的方法成为本领域的关键技术。目前，在猪红细胞免疫粘附功能检测方面还缺乏一套系统的检测体系及工作参数的建立方法，亟需相关技术人员进行探索。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法，构建了一套循环检测体系，可用于流动相流速、剪切力以及最大保持时间等工作参数的检测和分析。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统，包括流动小室、垫圈、流动相储液瓶、蠕动泵、硅胶软管以及设置有载玻片的细胞培养皿，所述垫圈垫于所述载玻片边缘上，所述流动小室盖于垫圈上；再以硅胶软管将流动小室、流动相储液瓶、蠕动泵依次相连，构成循环检测系统；所述流动相储液瓶内注入免疫粘附致敏GFP-E.coli的猪红细胞悬液。
进一步的，所述免疫粘附致敏GFP-E.coli的猪红细胞悬液的注入量为20mL。
本发明还提供了一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测方法，应用于上述的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统，包括以下步骤：
S1，启动蠕动泵，使流动相储液瓶中的猪红细胞悬液流动并充满整个循环检测系统；
S2，设定蠕动泵转速，记录一段时间内各转速下采用收集管收集到的悬液的体积；
S3，计算猪红细胞悬液在循环检测系统内的流动速度，重复检测n次，n≥3；
S4，计算循环检测系统中各转速下猪红细胞悬液流动的剪切力。
进一步的，所述步骤S3中，计算猪红细胞悬液在循环检测系统内的流动速度，采用如下公式：
其中，Q表示流动速度，单位为mL/s；Vn表示一段时间内各转速下收集到的悬液的体积，V0表示初始体积。
进一步的，所述步骤S4中，计算循环检测系统中各转速下猪红细胞悬液流动的剪切力，采用如下公式：
其中，τ为剪切力，单位为dynes/cm2；μ为介质粘度，为0.0076P；a为流动小室通道高度，为0.013cm；b为通道宽度为1.0cm；Q表示流动速度，单位为mL/s。
进一步的，所述一段时间设定为120s。
进一步的，所述方法还包括确定流动相最大保持时间，具体包括：
在猪红细胞悬液流动并充满整个循环检测系统后，设定蠕动泵转速；
每隔一段时间，从流动相储液瓶中吸取0.2mL猪红细胞悬液样品，以流式细胞仪检测各时间点猪红细胞表面荧光强度，设置每管检测的猪红细胞数为105，每时间点的样品检测3次，计算各时间点平均荧光强度；
以单因素方差分析法，计算不同时间点的荧光强度之间差异。
根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：本发明提供的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法，依次连接流动小室、垫圈、流动相储液瓶、蠕动泵、硅胶软管以及设置有载玻片的细胞培养皿构成了一套循环检测体系，可用于流动相流速及剪切力的确定以及流动相最大保持时间的确定，为检测猪红细胞免疫粘附功能提供可靠的工作参数，便于技术人员操作和开展后续的研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例不同时间点，猪红细胞表面荧光强度变化示意图；
图2为本发明实施例不同时间点下，猪红细胞表面荧光强度的代表性流式图；
图3为本发明检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法，构建了一套循环检测体系，可用于流动相流速、剪切力以及最大保持时间等工作参数的检测和分析。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例提供的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统，包括流动小室、垫圈、流动相储液瓶、蠕动泵、硅胶软管以及设置有载玻片的细胞培养皿，所述垫圈垫于所述载玻片边缘上，所述流动小室盖于垫圈上；再以硅胶软管将流动小室、流动相储液瓶、蠕动泵依次相连，构成循环检测系统；所述流动相储液瓶内注入20mL免疫粘附致敏GFP-E.coli的猪红细胞悬液。
如图3所示，本发明还提供了一种检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测方法，应用于上述的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统，包括以下步骤：
S1，启动蠕动泵，使流动相储液瓶中的猪红细胞悬液流动并充满整个循环检测系统；
S2，设定蠕动泵转速，记录120s内各转速下采用收集管收集到的悬液的体积；
S3，计算猪红细胞悬液在循环检测系统内的流动速度，重复检测3次；
S4，计算循环检测系统中各转速下猪红细胞悬液流动的剪切力。
其中，所述步骤S3中，计算猪红细胞悬液在循环检测系统内的流动速度，采用如下公式：
其中，Q表示流动速度，单位为mL/s；Vn表示一段时间内各转速下收集到的悬液的体积，V0表示初始体积。
所述步骤S4中，计算循环检测系统中各转速下猪红细胞悬液流动的剪切力，采用如下公式：
其中，τ为剪切力，单位为dynes/cm2；μ为介质粘度，为0.0076P；a为流动小室通道高度，为0.013cm；b为通道宽度为1.0cm；Q表示流动速度，单位为mL/s。
流动相的速度及流动剪切力的计算结果如表1所示，可见蠕动泵不同的转速下，流动相在循环体系中的流速不同。有研究认为，天然状态下静脉血流的剪切力为1-6dynes/cm2，试验条件下低于4dynes/cm2的剪切力是属于低剪切力，可能导致流动相流动状态不稳定[65，66]。因此，在本试验中，设置蠕动泵转速为4rpm，剪切力为5.3dynes/cm2来进行后续的试验。
表1流动相流速、剪切力计算结果
所述方法还包括确定流动相最大保持时间，具体包括：
在猪红细胞悬液流动并充满整个循环检测系统后，设定蠕动泵转速；
每隔一段时间，从流动相储液瓶中吸取0.2mL猪红细胞悬液样品，以流式细胞仪检测各时间点猪红细胞表面荧光强度，设置每管检测的猪红细胞数为105，每时间点的样品检测3次，计算各时间点平均荧光强度；
以单因素方差分析法，计算不同时间点的荧光强度之间差异。
具体地，在本发明实施例中，取20mL猪红细胞粘附致敏GFP-E.coli悬液注入储液瓶中，以无菌硅胶管连接储液瓶、蠕动泵及无PAMs的流动小室，设定蠕动泵转速为4rpm，启动蠕动泵，待悬液充满整个循环体系后，开始计时试验。分别计时后0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min时，从储液瓶中吸取0.2mL样品悬液，以流式细胞仪检测各时间点猪红细胞表面荧光强度，设置每管检测的猪红细胞数为105，每时间点的样品检测3次，计算各时间点平均荧光强度。
试验数据用Mean±SD表示，应用GraphPad Prism 5软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way analysis of variance)，比较各时间点荧光强度的变化。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。
经流式细胞仪检测，循环中0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min各时间点猪红细胞平均荧光强度依次为16.83±0.043、17.03±0.23、17.13±0.02、16.83±0.02、16.63±0.07、16.47±0.06、16.2±0.27、16.43±0.084、16.5±0.010、16.5±0.05、16.67±0.010、16.7±0.10、16.6±0.20(表2所示)。以单因素方差分析(如图1所示)，发现不同时间点的荧光强度之间差异不显著(P＞0.05)，可见猪红细胞悬液在循环体系中循环流动的过程中，0min到60min个时间段猪红细胞的荧光强度没有变化，表示在60min的循环时间内，猪红细胞粘附的GFP-E.coli没有损失，可以用于满足本试验的需要，图2列出了代表性流式图。
表2各时间点猪红细胞表面荧光强度检测值
本发明提供的检测猪红细胞免疫粘附功能的循环检测系统及方法，依次连接流动小室、垫圈、流动相储液瓶、蠕动泵、硅胶软管以及设置有载玻片的细胞培养皿构成了一套循环检测体系，可用于流动相流速及剪切力的确定以及流动相最大保持时间的确定，为检测猪红细胞免疫粘附功能提供可靠的工作参数，便于技术人员操作和开展后续的研究。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。