阅读说明：本技术 一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法 (Method for purifying arabidopsis thaliana resistant metabolite Arabidopsis thaliana ) 是由 俞陆军 张雪飞 戴阳朔 周颖 肖仕 于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法。本发明应用高效液相色谱与质谱联用技术对拟南芥抗性代谢物Arabidopsides的乙醇浸出液进行抗性代谢物Arabidopsides检测,再应用硅胶柱分离系统进行分离,即可得到所述抗性代谢物Arabidopsides。本发明应用硅胶柱分离系统、高效液相色谱与质谱联用技术结合的方法,最大限度的成功纯化得到了包括Arabidopside A、Arabidopside B和Arabidopside D在内的至少3种类型的Arabidopsides。该方法高效提取纯化得到了多种抗性代谢物Arabidopsides,且该方法简单易行、成本低,对植物在防御病虫害的改善与进步方面具有重要指导意义。(The invention discloses a method for purifying an arabidopsis thaliana anti-resistance metabolite Arabidopsis thaliana. The invention applies the high performance liquid chromatography and mass spectrometry combined technology to detect the arabidopsis resistant metabolite arabidopsis, namely arabidopsis resistant metabolites, in an ethanol leaching solution, and then applies a silica gel column separation system to separate, so as to obtain the arabidopsis resistant metabolite arabidopsis. The invention applies a method of combining a silica gel column separation system, a high performance liquid chromatography and a mass spectrum technology to successfully purify to the utmost extent to obtain at least 3 types of Arabidopsis including Arabidopsis A, Arabidopsis B and Arabidopsis D. The method has the advantages of high efficiency extraction and purification to obtain various resistant metabolites, simplicity, easy operation, low cost, and important guiding significance for improvement and progress of plant in defense against plant diseases and insect pests.)

一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法

技术领域

本发明属于植物代谢物技术领域。更具体地，涉及一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法。

背景技术

糖脂修饰复合物ARs(Arabidopsides)是一类新型响应植物逆境的信号分子。12-氧-植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid，OPDA)和去甲基-含氧植物二烯酸(Demethylation-12-oxo-phytodienoic acid，dn-OPDA)是合成茉莉酸类物质(JAs)的重要前体，两者作为重要的信号分子在植物生长发育和响应逆境应答中起重要作用。在拟南芥中，已鉴定出多种含有OPDA和dn-OPDA的单半乳糖甘油糖酯(MGDG)和双半乳糖甘油糖酯(DGDG)的Arabidopsides。根据含有OPDA或dn-OPDA的数量和组合的差异，目前已发现的抗性代谢物Arabidopsides分为以下7种类型：OPDA-dnOPDA MGDG(AR-A)、OPDA-OPDAMGDG(AR-B)、OPDA-dnOPDA DGDG(AR-C)、OPDA-OPDA DGDG(AR-D)；OPDA-OPDA-OPDA MGDG(AR-E)、dnOPDA-OPDA-OPDA MGDG(AR-G)。研究表明，拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的积累能够被低氧胁迫、机械损伤和过敏性反应所诱导，同时，外源施加AR-A能够促进叶片的衰老。另外，AR-E包含至少9种同源物，在植物衰老以及响应外界逆境过程中起着重要的调控作用。

因此，抗性代谢物Arabidopsides可作为响应植物逆境的信号分子，为茉莉酸(JA)信号通路提供新的研究对象，为多种激素网络调节的功能研究提供理论基础；同时，基于抗性代谢物Arabidopsides可引发防御基因起到保护植物体的作用的理论研究，抗性代谢物Arabidopsides的制备为植物在防御病虫害的改善与进步方面提供实践基础。

现有技术中提及的植物代谢物的提取纯化方法中，大部分通过萃取和色谱分离进行分离、提纯，从而提高样品待测物质的含量，运用放射免疫法、紫外或荧光的方法检测植物代谢物。但以上方法大多程序繁琐、耗时多、耗材量大、成本高昂。现有专利CN107870218A公开了一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，应用高效液相色谱和质谱联用技术检测水稻中的抗性代谢物Arabidopsides，最终检测到了抗性代谢物Arabidopsides的AR-B和AR-F类型，并对其进行了定性和定量。但是，该专利仅阐述了抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，不能直接提取纯化植物中的该类物质应用于实验或生产。因此，进一步研究抗性代谢物Arabidopsides的提取纯化方法，在对于病虫害的防御方面具有重要的指导意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有植物代谢物难以纯化、成本高昂的缺陷和不足，提供一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法。本发明基于可检测的基础，应用硅胶柱分离系统进行分离，对冲洗硅胶柱的冲洗液的组分配比进行优化，最大限度的从拟南芥中提取纯化得到了包含了Arabidopside A、Arabidopside B和Arabidopside D至少3种类型的抗性代谢物Arabidopside，为应用抗性代谢物Arabidopsides在病虫害上的防御提供了依据和方法。

本发明的目的是提供一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法，应用高效液相色谱与质谱联用技术对拟南芥抗性代谢物Arabidopsides的乙醇浸出液进行抗性代谢物Arabidopsides检测，再应用硅胶柱分离系统进行分离，即可得到所述抗性代谢物Arabidopsides；

其中，所述抗性代谢物Arabidopsides为Arabidopsides A、Arabidopsides B或Arabidopsides D中的任意一种或几种。

优选地，所述拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法，包括以下步骤：

S1.将含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液中的乙醇蒸干，得乙醇浸出物；

S2.将步骤S1得到的乙醇浸出物用甲醇溶解后，加入硅胶柱中，用冲洗液冲洗硅胶柱，得溶解液；

S3.取步骤S2得到的部分溶解液，吹干，溶解，得到混合溶液，运用高效液相色谱与质谱联用技术对抗性代谢物Arabidopsides进行检测；

S4.根据步骤S3的检测结果，取冲洗液溶解的干物质，用甲醇溶解，以OPDA为标准品，分离，收集不同区域的物质；

S5.用含有甲醇和二氯甲烷的溶液溶解步骤S4得到的物质，过滤，吹干，重复步骤S3；

S6.根据检测结果，进行制备液相分离，组分收集，重复步骤S3，确定Arabidopsides的位置和性质，即可得到所述抗性代谢物Arabidopsides。

优选地，步骤S3所述高效液相色谱与质谱联用技术中所用的流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述甲醇、乙腈的体积比为1：1，所述挥发性酸的体积分数为0.1％。

优选地，流动相B为挥发性酸和水的混合溶液，所述挥发性酸的体积分数为0.1％。

更优选地，所述挥发性酸为甲酸或乙酸。

优选地，所述冲洗液为体积比为乙酸乙酯：甲醇＝5：1的混合溶液或体积比为乙酸乙酯：甲醇＝3：1的混合溶液。

更优选地，所述冲洗液为体积比为乙酸乙酯：甲醇＝3：1的混合溶液。

优选地，步骤S4所述分离的方法为薄层层析法。

优选地，步骤S4所述含有甲醇和二氯甲烷的溶液中，甲醇和二氯甲烷的体积比为1：1。

优选地，步骤S3所述混合溶液中氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300：665：35。

优选地，步骤S1所述含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液的提取方法，包括以下步骤：

(1)取拟南芥植株，洗净，35℃～40℃烘干；

(2)在步骤(1)烘干后的样品中加入无水乙醇，封闭环境下静置22～26h，得乙醇浸出液；

(3)过滤步骤(2)得到的乙醇浸出液，收集滤液，重复步骤(2)，收集滤液，即为含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液。

优选地，步骤(1)所述拟南芥为经过损伤诱导处理后的拟南芥。

优选地，步骤(1)中，37℃烘干。

优选地，步骤(2)中，封闭环境下静置24h。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法，本发明应用硅胶柱分离系统、高效液相色谱与质谱联用技术结合的方法，最大限度的成功提取纯化得到了包括Arabidopside A、Arabidopside B和Arabidopside D在内的至少3种类型的抗性代谢物Arabidopsides。该方法简单易行、成本低，具有广泛的推广应用前景，对植物在防御病虫害的改善与进步方面具有重要指导意义。

附图说明

图1是不同体积比的冲洗液对拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的大规模纯化结果图；其中，EA代表乙酸乙酯，EA：MeOH＝5：1代表硅胶柱中冲洗液乙酸乙酯与甲醇的体积比(v/v)为5：1，EA：MeOH＝3：1是指硅胶柱中冲洗液乙酸乙酯与甲醇体积比(v/v)为3：1，MeOH代表甲醇。

图2是褐飞虱取食后水稻体内抗性代谢物Arabidopsides的含量测定结果图；其中，DJ代表水稻品种；oslox2代表在水稻品种DJ的背景下进行了基因lox2的功能缺失突变；oscoil a/b代表在水稻品种DJ的背景下进行了基因coil a和coil b的功能缺失突变。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法

本实施例选用如下材料及试剂进行制备：

一、材料及试剂

材料：拟南芥；

流动相：A：甲醇：乙腈＝1：1，加体积分数为0.1％甲酸；

B：超纯水+0.1％甲酸；

高效液相与质谱联用系统：岛津20A UFLC高效液相仪；AB SCIEX5600⁺质谱系统；

色谱柱：PhenomenexKinetex C18 150x 2.1mm 2.6μL。

二、含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液的制备

所述含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液的提取方法，包括以下步骤：

(1)取400g四周龄的拟南芥植株，洗净，置于37℃烘箱中烘干；

(2)将上述烘干后的样品放在三角瓶中，加入无水乙醇浸没样品，封住瓶口，静置24h，得乙醇浸出液；

(3)用两层滤布过滤上述乙醇浸出液，将滤液收集于干净的三角瓶中，继续向植物样品中加入无水乙醇浸没样品，封住瓶口，静置24h，得乙醇浸出液；

(4)重复步骤(3)，将两次过滤得到的乙醇浸出液混合，即可得到所述含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液；

其中，步骤(1)所述拟南芥为经过损伤诱导处理后的拟南芥。

三、拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化

所述拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法，包括以下步骤：

S1.在50℃的水浴中，用旋转蒸发仪将含有抗性代谢物Arabidopsides的拟南芥乙醇浸出液中的乙醇蒸干，得乙醇浸出物；

S2.将步骤S1得到的乙醇浸出物用甲醇溶解后，加入硅胶柱中，用4种含有不同体积比的乙酸乙酯和甲醇的冲洗液分别冲洗硅胶柱，收集经不同冲洗液溶解得到的溶解液，一部分溶解液用氮气吹干，备用；

其中，4种含有不同体积比的乙酸乙酯和甲醇的冲洗液分别为：甲醇、乙酸乙酯、体积比为乙酸乙酯：甲醇＝5：1的混合溶液、体积比为乙酸乙酯：甲醇＝3：1的混合溶液；

S3.取步骤S2得到的另一部分溶解液，用氮气吹干后，用甲醇溶解，得到氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300：665：35的混合溶液，总体积为1.8mL，置于棕色瓶中，运用高效液相色谱与质谱联用技术对抗性代谢物Arabidopsides进行检测；

S4.根据步骤S3检测结果，取体积比为乙酸乙酯：甲醇＝3：1的混合溶液溶解的干物质，用甲醇溶解，以OPDA为标准品，通过薄层层析法在TLC板中分离，用溴甲酚绿显色剂显色，根据TLC板上的颜色为深绿、浅绿、浅黄色、无显色和标准品OPDA的位置划分区域，收集不同区域的物质；

S5.用甲醇和二氯甲烷的体积比为1：1的溶液溶解TLC板上刮下的物质，过滤后用氮气吹干，继续用步骤S3的方法进行制样检测；

S6.根据检测结果，得到Arabidopsides不同组分在TLC板中的分布情况，将此样品通过制备液相分离，依据Arabidopsides的紫外吸收波峰宽度和保留时间两个要素进行组分收集，重复步骤S3的方法进行制样检测，确定Arabidopsides的位置和性质，对应收集，即可得到所述抗性代谢物Arabidopsides。

其中，在制备液相中通过乙腈洗脱时，洗脱过程30min，根据保留时间分为6个时间段，每5min收集一次样品，重复步骤S3的方法进行制样检测，检测发现Arabidopsides均在15～20min出现大面积吸收峰。据此，在制备液相分离中，设置峰面积阈值，大量收集此时间段下出现吸收峰的样品，用氮气吹干。

步骤S3中，运用高效液相色谱与质谱联用技术对抗性代谢物Arabidopsides进行检测的条件为：

色谱柱：PhenomenexKinetex C18 150x 2.1mm 2.6μL。

液相条件：

流动相：A：甲醇：乙腈＝1：1，加0.1％甲酸；

B：超纯水+0.1％甲酸

流速：300μL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

液相梯度条件如下：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			10	20	80
25	0	100
			30	0	100
30	50	50
			40	终止

质谱的参数设置为：雾化气：55psi；辅助气：55psi；气帘气：35psi；离子源温度：30℃；电喷雾电压：4500v，制备离子对(Arabidopsides/OPDA/dnOPDA)为：Arabidopside A：773.5/291.1/263.1；Arabidopside B：801.5/291.1/263.1；Arabidopside C：935.5/291.1/263.1；Arabidopside D：963.5/291.1/263.1；Arabidopside E：1047.5/291.1/263.1；Arabidopside F：759.5/291.1/263.1；Arabidopside G：1075.5/291.1/263.1。

经验证，本实施拟南芥中抗性代谢物Arabidopsides的纯化方法中，运用硅胶柱分离系统、高效液相色谱与质谱联用技术结合的方法，可成功分离纯化得到不同类型的抗性代谢物Arabidopsides。

不同体积比的冲洗液对拟南芥中Arabidopsides的大规模纯化结果如图1所示，可以看出，乙酸乙酯：甲醇＝5：1的冲洗液可溶解大量的Arabidopside D，以及少量的Arabidopside C；乙酸乙酯：甲醇＝3：1的冲洗液可溶解大量的Arabidopside A、Arabidopside B和少量的Arabidopside G。

因此，本发明的方法可有效地在拟南芥中提取纯化得到包括Arabidopside A、Arabidopside B和Arabidopside D在内的至少3种类型的抗性代谢物Arabidopsides。

实施例2褐飞虱取食后水稻体内抗性代谢物Arabidopsides的含量测定

一、材料及试剂

材料：水稻DJ，oslox2，oscoil a/b；

流动相：A：甲醇：乙腈＝1：1，加体积分数为0.1％甲酸；

B：超纯水+0.1％甲酸；

高效液相与质谱联用系统：岛津20A UFLC高效液相仪；AB SCIEX 5600⁺质谱系统；

色谱柱：PhenomenexKinetex C18 150x 2.1mm 2.6μL。

二、褐飞虱取食的植物材料收集及其中Arabidopsides的含量测定

所述褐飞虱取食的植物材料收集及其中Arabidopsides的含量测定的方法，包括以下步骤：

(1)将水稻DJ，oslox2，oscoil a/b同时培育至四叶期，各选10株长势一致的植株；处理组：DJ，oslox2，oscoil a/b各取其中5株，在每株植株茎上接10头4龄期褐飞虱若虫，12小时后取植物茎作为样品；对照组：DJ，oslox2，oscoil a/b各取5株，不接褐飞虱，12小时后取植物茎作为样品；

(2)将新鲜的水稻植株样品进行称重，加入2.5倍体积的预冷后的甲醇(含0.025％BHT)混匀；加入1.25倍体积的氯仿，在4℃摇床上摇30分钟；

(3)过滤，保留溶液，加入1.25倍体积的氯仿和380mM KCL溶液，混匀；收集有机相，加入氯仿抽提一次，再收集有机相；用氮气吹干溶液；

(4)用氯仿振荡溶解，经口径为0.22微米的尼龙膜过滤，收集过滤后的溶液，取其中一部分，使得最终氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300：665：35的混合溶液，总体积为1.2mL，置于棕色瓶中，运用高效液相色谱与质谱联用技术对抗性代谢物Arabidopsides进行检测。

2、实验结果

褐飞虱取食后水稻体内抗性代谢物Arabidopsides的含量测定结果如图2所示，可以看出，在褐飞虱取食水稻后，水稻体内抗性代谢物Arabidopsides的含量显著提高；说明抗性代谢物Arabidopsides中Arabidopside B和Arabidopside D在水稻的褐飞虱防御中起到重要作用。同时，在水稻品种DJ为背景的JA合成突变体oslox2和JA信号缺失突变体oscoil a/b中，Arabidopside B和Arabidopside D的含量明显低于野生型，说明抗性代谢物Arabidopsides的合成依赖于JA信号通路。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。