具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了一种针筒式重力柱、固相萃取系统、针筒式重力柱或固相萃取系统在固相萃取中的用途、利用固相萃取系统进行纯化的方法，下面将分别对其进行详细描述。

针筒式重力柱

在本发明的一个方面，本发明提出了一种针筒式重力柱。根据本发明的实施例，参见图1，该针筒式重力柱包括具有空腔的柱体，柱体的上端设置有进液口100，柱体的下端设置有出液口200。由此，液体可以由进液口进入空腔中，未被吸附的物质将从出液口流出。具体地，可以在进液口上加设保护盖，可以在出液口上加设保护帽，避免柱体和内部液体被污染或流出。

根据本发明的实施例，柱体的空腔内自下而上依次连接填充有第一过滤层300、填料层400、缓冲层500和第二过滤层600。第一过滤层起到支持填料的作用，避免在加压作用下填料由出液口流出。第二过滤层可以有效地避免在加压作用下填料胶面出现倾斜现象，缓冲层可以有效地避免在加压作用下填料被压干，从而提高目标物得率、纯度或获得量，尤其适用于蛋白质。

根据本发明的实施例，缓冲层是由缓冲溶液形成的，该缓冲溶液包括10～30体积％乙醇溶液。由此，可以有效地避免在加压作用下填料被压干，同时不干扰目标物，尤其是蛋白质在填料中发生吸附和解吸附。

根据本发明的实施例，填料层与缓冲层的高度比为1：(0.25～0.5)，由此，可以有效地提高目标物得率、纯度或获得量，尤其适用于蛋白质。若缓冲层的高度过大，容易导致填料层上方死体积过大，使得加入溶液后溶液浓度稀释，最终洗脱所得流出液中蛋白含量低，不利于后续操作，或者是后续还需要浓缩，增加工作量和成本。

根据本发明的实施例，第二过滤层的高度不大于填料层高度的50％。发明人经过大量实验得到上述较佳高度比，由此，可以有效地支撑填料层，避免出现倾斜。

根据本发明的实施例，填料层的体积为空腔体积的20～40％。由此，可以充分使目标物结合于填料上，提高纯化效率。

根据本发明的实施例，第一过滤层和第二过滤层是由过滤材料形成的，过滤材料选自多孔玻璃、多孔氧化物、多孔玻璃纤维和多孔高分子材料中的至少之一，优选聚丙烯化合物。由此，可以对待测样品起到一定的过滤和支撑作用，既可以避免填料层下落至出液口，也可以避免填料层胶面倾斜，同时，不会改变待测样品的特性，尤其是蛋白质。

根据本发明的实施例，过滤材料的孔径为15～30μm。由此，既可以使蛋白质通过，也可以避免因孔径过大而导致填料层胶面倾斜或者填料漏出。

根据本发明的实施例，填料选自亲和填料，更优选偶联proteinA蛋白的填料。蛋白A(Protein A)来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体及融合蛋白的Fc段特异性结合的结构域。所以约70-80％的抗体纯化使用偶联proteinA蛋白的亲和填料捕获蛋白。

亲和填料包括但不限于思拓凡的r-proteinA、Mabselect SuRe、Mabselect SuReLX、prismA；默克的Eshmumo A；东曹的TOYOPEARL AF-rprotienA-650F；赛默飞的MabCapture A；纳微的UniMab Pro、Nmab；博格隆的Diamond plus；漂莱特的PRAESTOJetted A50；赛分的Mabpurix A45、Mabpurix P45。

固相萃取系统

在本发明的另一方面，本发明提出了一种固相萃取系统。根据本发明的实施例，固相萃取系统包括：固相萃取仪和前面所述的针筒式重力柱。将固相萃取仪(参见图2)与针筒式重力柱相结合，通过从针筒式重力柱顶部注入溶液并正向加压，可以自动完成高通量平衡、洗涤、洗脱等操作，无需其他辅助仪器设备就可完成自动化纯化，达到高通量快速纯化的目的，尤其适用于蛋白质。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对针筒式重力柱所描述的特征和优点，同样适用于该固相萃取系统，在此不再赘述。

针筒式重力柱或固相萃取系统在固相萃取中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了针筒式重力柱或固相萃取系统在固相萃取中的用途。利用前面所述针筒式重力柱或含有其的固相萃取仪可以实现高通量自动化萃取，提高纯化效率，节省溶液使用量，目标物得率、纯度和获得量均较高，有助于实现规模化研发应用。

根据本发明的实施例，固相萃取的样品为蛋白质溶液。采用上述针筒式重力柱或固相萃取系统可以有效地纯化蛋白质，具有纯化效率高、蛋白得率高、纯度高、获得量高等优点。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对针筒式重力柱和固相萃取系统所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

利用固相萃取系统进行纯化的方法

在本发明的一个方面，本发明提出了一种利用固相萃取系统进行纯化的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述针筒式重力柱放置于固相萃取仪中的层析柱架上，向针筒式重力柱中依次加入平衡液、待测样品、平衡液、洗涤液、洗脱液，每加入一种液体后均进行加压处理，收集最后一次加压后流出的纯化样品。

参见图2和图3，层析柱架上含有多个孔洞，将针筒式重力柱放置于孔洞中，然后将层析柱架放置于固相萃取仪中的相应位置。接着，先向柱内加入平衡液以对柱子进行平衡，再加入待测样品，待测样品中的目标物将结合于填料上，然后依次用平衡液、洗涤液和洗脱液过柱，结合于填料上的目标物将被洗脱下来，流出，最终得到纯化样品。由此，可以实现高通量自动化萃取，提高纯化效率，节省溶液使用量，目标物得率、纯度和获得量均较高，有助于实现规模化研发应用。

根据本发明的实施例，待测样品为蛋白质溶液。具体地，所述蛋白质选自IgG蛋白、等电点为5.0～8.5的蛋白或分子量为140～155kDa的蛋白的至少之一。采用上述针筒式重力柱或固相萃取系统可以有效地纯化蛋白质，具有纯化效率高、蛋白得率高、纯度高、获得量高等优点。

根据本发明的实施例，加压处理的压力不高于1bar。由此，可以加快液体流动速度，提高萃取效率。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对针筒式重力柱和固相萃取系统所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

有益效果

与现有技术相比，利用本发明的针筒式重力柱、固相萃取系统或纯化方法可以更加便捷、快速、自动化，在高效的去除样品中其他杂质的同时，节省样品制备时间并能有效的减少溶剂的用量，尤其适用于抗体类、融合蛋白等蛋白质。在短时间内可以同时纯化多个样品(2ml填料，可以处理48个样品，每个样品可以制备不少于60mg蛋白满足后续分析检测样品的需求)，属于一种较大量制备、快速、高通量的蛋白纯化过程，适于规模化研发应用。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中涉及的％为SEC-HPLC、nRCE中测定的峰面积百分比。

实施例1

1、样品获得

构建表达载体，导入外源基因GLP-1-Fc融合基因，转入CHO(中国仓鼠卵巢细胞)表达获得的重组蛋白GLP-1-Fc(度拉糖肽)，具体步骤如下：经过细胞株复苏—传代扩增—生物反应器培养，收获细胞培养液，离心，使用除菌滤杯过滤获得含有重组蛋白的培养上清。

2、纯化

步骤1：将针筒式重力柱(空柱，最大体积为10mL)底部的出液口盖上保护帽，然后依次向内腔中加入聚丙烯材料以形成0.2cm第一过滤层、加入2mL思拓凡公司的MabSelectSuRe以形成1cm填料层、加入1mL 0.2体积％乙醇溶液以形成5cm缓冲层、加入聚丙烯材料以形成0.2cm第二过滤层。将装好的柱子放到层析柱架的孔洞中，然后将层析柱架放入固相萃取仪(Resolvex A 100)中的相应位置上。

步骤2：固相萃取仪的6个管路充满A-E六种溶液，将放入重力柱的层析柱架摆放到位；向针筒式重力柱中加入5ml平衡液(50mM Tris-HAc+150mM NaCl，pH 7.4)，然后加压，重复此步骤一次。然后加入8ml样品，加压；再加入5ml平衡液(50mM Tris-HAc+150mM NaCl，pH7.4)，然后加压；然后加入5ml洗涤液(20mM Na-citrate，pH5.5)，加压；再加入5ml洗脱液(20mM Na-citrate，pH3.5)，加压，收集纯化样品。每次加入相应溶液后通过自动固相萃取仪进行加压，操作压力控制在1bar以下。

纯化样品同时送检SEC、nrCE质量分析。

对比例1

1、样品获得

同实施例1。

2、纯化

步骤1：将针筒式重力柱(空柱，最大体积为10mL)底部的出液口盖上保护帽，然后依次向内腔中加入聚丙烯材料以形成0.2cm第一过滤层、加入2mL思拓凡公司的MabSelectSuRe以形成1cm填料层。将装好的柱子放到层析柱架的孔洞中，然后将层析柱架放入固相萃取仪中的相应位置上。

步骤2：手动向针筒式重力柱中加入10ml平衡液(50mM Tris-HAc+150mM NaCl，pH7.4)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方，重复此步骤一次。然后加入样品8ml，停留5min充分吸附，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；再加入10ml平衡液(50mMTris-HAc+150mM NaCl，pH 7.4)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；然后加入10ml洗涤液(20mM Na-citrate，pH5.5)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；再加入10ml洗脱液(20mM Na-citrate，pH3.5)，停留5min充分洗脱，收集纯化样品。

纯化样品同时送检SEC-HPLC、nrCE-SDS质量分析。

对比例2

按照实施例1的方法纯化样品，区别在于，步骤2如下：

手动向针筒式重力柱中加入10ml平衡液(50mM Tris-HAc+150mM NaCl，pH 7.4)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方，重复此步骤一次。然后加入样品8ml，停留5min充分吸附，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；再加入10ml平衡液(50mM Tris-HAc+150mM NaCl，pH 7.4)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；然后加入10ml洗涤液(20mM Na-citrate，pH5.5)，等待液体自动流出，柱内液位至过滤膜上方；再加入10ml洗脱液(20mM Na-citrate，pH3.5)，停留5min充分洗脱，收集纯化样品。

对比例3

按照实施例1的方法纯化样品，区别在于，步骤1中不填充0.2体积％乙醇溶液。

对比例4

按照实施例1的方法纯化样品，区别在于，步骤1中乙醇溶液的添加量为2mL，形成的缓冲液层的高度为10mm。

不同层析方式得到的蛋白回收率及目标蛋白主峰结果比较参见表1，实施例1、对比例1和对比例2的分析图谱参见图4～9。实施例1和对比例2消耗的溶液体积比较参见表2。

表1实验结果

表2溶液消耗统计

在填料上方无第二过滤层，则加入各步骤液体胶面倾斜严重(参见图10)，收率较低在60％左右；而填料上方紧贴第二过滤层，则加压过程导致填料中液体压干，使得后续蛋白溶液无法与填料吸附，实验失败；如果缓冲液达到1ml及以上，例如2ml(缓冲层高度为10mL)，这样会导致填料上方死体积过大，使得加入溶液后溶液浓度稀释无法正常获得样品；在填料上方增加0.5-1ml缓冲液(对应高度为2.5～5mm)可以在正压操作时留有缓冲，防止填料压干实验失败，并且最大程度提高蛋白收率和纯度；结合自动固相萃取仪的使用，可进一步提高蛋白纯化收率纯度，而且可以节约溶液使用量50％，节约成本，因此缓冲液的体积、高度的优化以及第二过滤层添加，尤其适合针筒式重力柱结合自动固相萃取仪使用。

通过以上结果显示采用本发明纯化方法得到的蛋白纯度、得率明显优于常规的仅有一层过滤层和填料层的手动针筒过滤器(实施例1)。本发明提供了一种高通量的方法，提高了蛋白纯化效率，节省溶液使用量，且蛋白的得率和纯度及获得的蛋白量完全能够满足纯化要求，在提高纯化效率的前提下依然确保蛋白的纯度和收得率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。