阅读说明：本技术 一种放射性细胞损伤模型的构建方法 (Method for constructing radioactive cell damage model ) 是由 赵路 田磊 贾骏麒 宗春琳 张哲儒 靳丹 郭凯 景莉 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种放射性细胞损伤模型的构建方法,其包括从幼年SD大鼠的股骨和胫骨的骨髓中提取骨髓间充质干细胞,培养传至第3代；对第3代骨髓间充质干细胞进行鉴定；利用钴60放射源的γ射线照射骨髓间充质干细胞,照射剂量梯度设置为2、4、6、8Gy,γ射线剂量率控制在2.538Gy/min,对升降源过程中的边界效应进行积分计算,使骨髓间充质干细胞实际所受的累积照射剂量达到设定剂量；根据骨髓间充质干细胞增殖能力、凋亡程度,结合活细胞筛选检测,选定特定γ射线照射剂量照射的骨髓间充质干细胞作为所述放射性细胞损伤模型。本发明为以后研究生物体电离辐射损伤效应、辐射防护以及相关疾病提供了一个具有较高可靠性和可重复性的细胞模型。(The invention discloses a method for constructing a radioactive cell injury model, which comprises the steps of extracting bone marrow mesenchymal stem cells from bone marrow of thighbone and tibia of a young SD rat, and culturing until the 3 rd generation; identifying the 3 rd generation mesenchymal stem cells; irradiating the mesenchymal stem cells by utilizing gamma rays of a cobalt 60 radioactive source, setting the irradiation dose gradient to be 2Gy, 4Gy, 6Gy and 8Gy, controlling the gamma ray dose rate to be 2.538Gy/min, and carrying out integral calculation on the boundary effect in the source lifting process to ensure that the actually-born accumulated irradiation dose of the mesenchymal stem cells reaches the set dose; and selecting the mesenchymal stem cells irradiated by a specific gamma ray irradiation dose as the radioactive cell damage model by combining living cell screening detection according to the proliferation capacity and apoptosis degree of the mesenchymal stem cells. The invention provides a cell model with higher reliability and repeatability for researching the ionizing radiation damage effect, radiation protection and related diseases of organisms in the future.)

一种放射性细胞损伤模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及骨髓间充质干细胞体外辐射模型的建立，具体涉及一种基于钴60的大鼠骨髓间充质干细胞模型的构建方法。

背景技术

放射治疗是针对各种恶性肿瘤的一种局部治疗方法，参与了约70％的恶性肿瘤的治疗过程，其中约40％仅通过放疗即可达到根治目的。放射线通过对人体组织细胞产生电离辐射效应从而实现对肿瘤的治疗作用，但由于放射线并不具有细胞和组织的特异性，故而常伴随着一系列并发症的发生，对患者的生存质量造成严重危害。常用于放疗的射线类型主要包括放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的X射线及各类粒子束等。在各种类型的放疗射线来源中，起主要作用的射线主要是X射线和γ射线，二者均属电磁波，其区别在于：γ射线为放射性同位素原子核发生衰变过程中发出的核辐射，而X射线则是由高能电子撞击X线机球管导致原子核外电子能级升高，在向低能级跃迁过程中发射出的原子核外部辐射。由于X射线波长远大于γ射线，故而后者的能量和在组织中的穿透性远大于前者。

放疗可以导致一系列并发症的发生，其中放射性颌骨骨髓炎(osteoradionecrosis of jaws，ORNJ)是头颈部恶性肿瘤放疗后最严重的一类并发症，发生率约8.2％～22％，可导致放疗区内的口腔颌面部组织长期不愈、死骨暴露，张口受限、吞咽语言困难、病理性骨折和面部畸形等，使患者生活质量大大下降。ORNJ一旦发生，几乎无法逆转，目前尚无公认有效的预防和保守治疗方法，ORNJ发病机制的研究一直是国内外学者的研究热点。近些年来有学者提出了放射性纤维萎缩学说，认为ORNJ是一种放疗诱导的纤维化疾病，ORNJ的主要致病机制为肌成纤维细胞(MFB)的转化与过度增殖，并伴有成骨细胞在照射后死亡、迁移率下降。下颌骨局部的骨髓间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)是ORNJ中MFB的主要来源之一，而局部移植BMSCs也对ORNJ有明显的治疗作用。

BMSCs是骨骼中存在最多的细胞，是具有多向分化潜能的细胞，具有自我复制更新能力以及免疫调节作用。近年来有关BMSCs与放射性损伤的研究已成为国内外研究热点。有学者研究过X射线对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1增殖的影响，但是成骨前体细胞MC3T3-E1主要用于探索成骨细胞增殖、成熟和分化的研究模型，并不适用于放射性骨坏死的研究。也有学者利用小鼠急性放射性损伤模型，提取放射性损伤小鼠的骨髓细胞进行研究，但是小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，骨髓间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度，且科研成本较高。

目前关于放射性细胞辐照损伤模型的建立研究尚少，且绝大多数研究射线对细胞生物学效应的实验模型都以X射线作为辐照加载条件。但对于在临床治疗中大量应用的γ射线对生物体组织细胞造成的辐射损伤研究尚不充分，缺少应用γ射线对细胞辐照损伤的相关研究。

发明内容

基于放射性细胞辐照损伤模型的建立研究现状，当前关于细胞放射损伤及相关疾病的研究主要存在以下技术问题：(1)射线来源不统一，对X射线和γ射线电离辐射损伤作用的区别认识不清；(2)射线剂量不统一；(3)辐射对象细胞不统一，不利于分析判断射线作用；(4)放射性细胞辐射损伤评价指标不统一、不客观；(5)可重复性较差。

为解决上述技术问题，本发明通过评估在不同剂量下基于钴60放射源发射的γ射线对SD大鼠骨髓间充质干细胞在增殖、凋亡方面所造成的影响，寻找适用于放疗及其并发症研究的放射剂量，建立切实可行的基于γ射线的大鼠BMSCs细胞实验模型。本发明所构建的放射性细胞损伤模型是一种可靠性、可重复性俱佳的标准化大鼠骨髓间充质干细胞体外辐照模型，可为研究放射性损伤提供一个新的细胞研究平台。

一种放射性细胞损伤模型的构建方法，其应用γ射线对骨髓间充质干细胞进行梯度剂量照射；照射后检测γ射线对骨髓间充质干细胞的损伤情况；根据骨髓间充质干细胞增殖能力、凋亡程度的改变，选定γ射线照射剂量，并以选定的γ射线照射剂量照射的骨髓间充质干细胞作为所述放射性细胞损伤模型。

放射性同位素钴60能放出较强的γ射线，其强度容易控制，γ射线有较强的穿透能力，对细胞有杀伤力，在医疗领域应用广泛，由于X射线波长远大于γ射线，故而后者的能量和在组织中的穿透性远大于前者。作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，所述γ射线选用基于钴60放射源的γ射线，对骨髓间充质干细胞的照射剂量设置为2～8Gy。

SD大鼠的骨髓间充质干细胞增殖能力和活性优于小鼠的骨髓间充质干细胞，并易于获取和在实验室内培养、繁殖，本发明选取SD大鼠来源的BMSCs作为建立放射性细胞损伤模型的细胞。作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，所述骨髓间充质干细胞取自幼年SD大鼠，应用γ射线对第3代骨髓间充质干细胞进行照射。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，所述骨髓间充质干细胞的提取方法为：在无菌条件下，取出幼年SD大鼠的股骨和胫骨中的骨髓；制备成骨髓细胞悬液，离心，弃去上清液；接种，培养，选用传至第3代的骨髓间充质干细胞。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，所述γ射线照射骨髓间充质干细胞的剂量率控制在2.538Gy/min，对升降源过程中的边界效应进行积分计算，使骨髓间充质干细胞实际所受的累积照射剂量达到2～8Gy。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，其利用钴60放射源的γ射线照射幼年SD大鼠的骨髓间充质干细胞，作为所述放射性细胞损伤模型的条件选择为：4Gy剂量、2.538Gy/min剂量率。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，其包括，

从幼年SD大鼠的股骨和胫骨的骨髓中提取骨髓间充质干细胞，培养传至第3代；

对第3代骨髓间充质干细胞进行鉴定；

利用钴60放射源的γ射线照射经鉴定确认后的骨髓间充质干细胞，照射剂量梯度设置为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，γ射线剂量率控制在2.538Gy/min，对升降源过程中的边界效应进行积分计算，使骨髓间充质干细胞实际所受的累积照射剂量达到2Gy、4Gy、6Gy、8Gy；

根据骨髓间充质干细胞增殖能力、凋亡程度，结合活细胞筛选检测，选定特定γ射线照射剂量照射的骨髓间充质干细胞作为所述放射性细胞损伤模型。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，所述γ射线4Gy剂量照射后的骨髓间充质干细胞内的α-SMA表达量增加。

作为所述放射性细胞损伤模型的构建方法的优选，其对第3代骨髓间充质干细胞进行流式细胞鉴定，CD45为阴性表达，CD44和CD90为阳性表达。

本发明的有益效果或优点：

本发明所述放射性细胞损伤模型的构建方法，具体地，应用γ射线对大鼠骨髓间充质干细胞进行梯度剂量照射，照射后检测γ射线各剂量下细胞增殖能力和凋亡程度；并检测γ射线组照射后各剂量下活细胞比例。本发明成功探索出了基于钴60放射源的γ射线用于建立大鼠骨髓间充质干细胞实验模型的理想加载条件，即利用钴60放射源的γ射线在4Gy剂量、2.538Gy/min剂量率照射条件下可建立大鼠骨髓间充质干细胞实验模型。

本发明通过在相同剂量率条件下对BMSCs加载梯度剂量的γ射线，基本明确了在选定剂量区间内细胞电离辐射损伤效应随剂量变化的趋势，筛选出2.538Gy/min剂量率、4Gy剂量这一可较好应用于电离辐射损伤相关实验研究的理想参数。本发明所述放射性细胞损伤模型的构建方法，为以后研究生物体电离辐射损伤效应、辐射防护以及相关疾病提供了一个具有较高可靠性和可重复性的细胞模型，提高了实验结果的客观性和科学性。

附图说明

图1是培养第3d时的SD大鼠骨髓间充质干细胞状态图。

图2是培养第6d时的SD大鼠骨髓间充质干细胞状态图。

图3是SD大鼠第3代骨髓间充质干细胞状态图。

图4是SD大鼠第3代骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定CD44阳性表达图。

图5是SD大鼠第3代骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定CD90阳性表达图。

图6是SD大鼠第3代骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定CD45阴性表达图。

图7是接受γ射线照射后骨髓间充质干细胞生长曲线图。

图8是接受γ射线照射后骨髓间充质干细胞活细胞计数结果图。

图9是接受γ射线4Gy剂量照射后骨髓间充质干细胞内α-SMA的表达图。

图10是接受γ射线4Gy剂量照射后骨髓间充质干细胞内α-SMA的表达数据分析图。

具体实施方式

为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现结合实施例对本发明所述放射性细胞损伤模型的构建方法的实施做进一步详细阐述。

1、细胞来源、分组及射线加载

本实施例所用的骨髓间充质干细胞(BMSCs)取自雄性幼年SD大鼠，将P3代(第3代)骨髓间充质干细胞按照每孔2×10³个细胞和2.5×10⁶个细胞分别接种于96孔板和6cm培养皿中，在细胞贴壁后进行照射。将细胞分为空白对照组(NC)、γ射线组，其中γ射线组根据放射加载剂量分为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy组(γ2-γ8)。

γ射线组放射源采用西北核技术研究所的钴60放射源，通过调整培养皿与钴源之间的距离，将射线剂量率控制在2.538Gy/min，对升降源过程中的边界效应进行积分计算，使细胞实际所受的累积剂量达到0、2、4、6、8Gy。

2、电离辐射相关指标检测

对γ射线各组骨髓间充质干细胞分别在照射后1、2、3、4、5d进行CCK-8染色检测细胞增殖能力并绘制生长曲线；对各剂量下γ射线组细胞在照射后第7d进行活/死细胞双染实验测定活细胞百分比。

3、统计学分析

各组实验均至少重复3次，每次设置3个复孔。使用GraphPad Prism软件进行数据分析，应用student-t检验进行统计学分析，P＜0.05代表差异具有统计学意义。

4、骨髓间充质干细胞的提取与鉴定

(1)骨髓间充质干细胞提取

取10d左右的SD大鼠麻醉后脱颈处死，用体积分数为75％的乙醇全身浸泡消毒10min，在超净台内无菌条件下用高压灭菌后的器械取其股骨和胫骨，将取出的股骨和胫骨放置于含有1％双抗的PBS培养皿中，轻轻冲洗2次，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，用无菌的2ml注射器吸取含有10％胎牛血清和1％青/链霉素(双抗)的Alpha-MEM培养基，将骨髓腔内的骨髓冲出至培养皿内，反复冲洗几次直至骨髓腔发白，用移液管反复吹打冲出的细胞悬液，将细胞悬液收集至15ml离心管内，用细胞离心机在常温下1000rpm/min离心5min，离心结束后弃去上清液，用10ml含有10％胎牛血清和1％双抗的Alpha-MEM培养基重悬细胞沉淀，而后将重悬后的细胞悬液接种至10cm的培养皿中，放置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱内，上述取细胞全程要在冰盒上进行。放入37℃细胞培养箱内培养3d后，将培养基全部换成新鲜的培养基，在倒置相差显微镜下观察，可观察到在骨髓组织块周围爬出梭形贴壁细胞，部分细胞为成纤维样细胞样形态(图1)。在相差显微镜下观察培养第6d的细胞，贴壁细胞增多，且细胞形成较大的克隆团块，大部分细胞呈长梭形，贴壁细胞密度达80％以上(图2)。细胞密度约为80％～90％左右时进行传代，细胞传至第3代时在相差显微镜下观察，可见细胞呈现比较均匀的漩涡状生长，细胞生长能力强且形态基本一致(图3)。

(2)骨髓间充质干细胞鉴定

取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行流式细胞鉴定，鉴定结果见图4至图6，CD45为阴性表达，CD44和CD90为阳性表达，鉴定其为SD大鼠的骨髓间充质干细胞，细胞可以稳定传代至P10代(第10代)。

5、放射性细胞损伤加载条件探索

将SD大鼠来源的第3代BMSCs分别以每孔2×10³个细胞的密度接种至96孔板，以每皿2.5×10⁶个细胞的密度接种至6cm培养皿，利用钴60放射源的γ射线对BMSCs进行不同剂量(2Gy，4Gy，6Gy，8Gy)的射线照射，BMSCs细胞放置点距离放射源2m，照射时96孔板和6cm培养皿的底部与射线接近垂直，射线剂量率控制在2.538Gy/min，对升降源过程中的边界效应进行积分计算，使细胞实际所受的累积剂量达到2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，空白对照组的BMSCs细胞与需要照射的BMSCs细胞一同带至照射地点(位置)但不进行γ射线照射。

接种至96孔板的第3代BMSCs进行CCK-8染色检测，检测照射后的细胞第1-5d的细胞增殖能力，图7给出了CCK-8染色检测的5组(含空白对照组)BMSCs接受γ射线照射后5d的O.D值。从图7可以看出，在接受γ射线最初的72h细胞增殖能力改变不明显，甚至出现短暂的代偿性上升；从第3d起，4、6、8Gy组细胞增殖活变缓，但从第4d开始出现下降出现明显下降。具体地，BMSCs在接受γ射线照射后的4d内细胞都处于增殖状态，与正常对照细胞(空白对照组)相比增殖能力有所下降；接受γ射线4Gy、6Gy、8Gy剂量照射的BMSCs在第4d后的增殖能力急剧下降，且下降趋势与剂量梯度呈依赖性，照射剂量越大则细胞的增殖能力越差；而照射剂量为2Gy的BMSCs殖能力却呈显著增长。由此看出，γ射线不同剂量照射BMSCs对其增殖具有不同的影响，接受γ射线2Gy剂量照射的BMSCs与对照组相比增殖能力差异较小；而经过6Gy和8Gy剂量照射的BMSCs增殖能力显著下降，大多数细胞凋亡；4Gy剂量照射的BMSCs增殖能力有所下降且有部分细胞得以存活，可以进行下一步实验研究，即选定4Gy剂量照射的BMSCs为放射性细胞损伤模型进行下一阶段实验研究。

分别对γ射线各剂量照射条件下细胞进行活细胞筛选，接受γ射线照射后骨髓间充质干细胞活细胞的计数结果见图8。图8给出了活细胞筛选后5组BMSCs中活细胞所占的百分比，可见随着照射剂量的增大，两种射线在大于2Gy的照射剂量下均可造成活细胞比例的明显降低(P＜0.05)。具体地，照射的剂量越大活细胞的比例越低，2Gy剂量照射的BMSCs与空白对照组相比无明显差异，无统计学意义(P＝0.488)，4Gy、6Gy、8Gy剂量照射的BMSCs的结果均有统计学意义(P<0.05)。可见，活细胞筛选结果与CCK-8染色检测结果一致，γ射线照射剂量越大时活细胞的比例越低。

通过上述实验研究发现，在2Gy的低剂量照射条件下，细胞尽管在照射早期短暂发生了增殖能力减缓、凋亡水平升高等现象，但这种现象维持时间过短，细胞的增殖活性可以在照射后第3d基本至空白对照组水平，且照射后1周凋亡细胞所占比例与空白对照组基本无异。在4Gy的中等照射剂量下，既可以确保明显的细胞增殖能力下降和细胞凋亡现象，又能保持相对较高比例的活细胞存量，可以为后续试验提供较为充足的细胞量；与临床病理表现及前期动物实验结果贴合度较高。说明4Gy射线确实对细胞造成了明确的电离辐射损伤，又不至于把大部分细胞杀死，可以为后续实验余留足够的细胞。而6、8Gy照射剂量虽然同样可造成细胞增殖能力和凋亡水平的明显改变，但活细胞比例相对较低，如应用于细胞模型的建立可能无法较好满足后续实验细胞数量的要求，故综合考虑选用4Gy作为理想照射剂量。

6、western blot检测

由上述可确定BMSCs放射性细胞损伤模型的γ射线照射剂量选定为4Gy。通过western blot技术检测经过4Gy剂量照射后的BMSCs内的MFB的特异性分子标志物—α-SMA的表达，检测结果见图9和图10。从图9和图10可以证明，接受4Gy射线照射后的BMSCs内的α-SMA蛋白表达明显高于空白对照组，具有统计学意义。

本实施例通过在相同剂量率条件下对BMSCs加载梯度剂量的γ射线，基本明确了在选定剂量区间内细胞电离辐射损伤效应随剂量变化的趋势，筛选出2.538Gy/min剂量率、4Gy剂量这一可较好应用于电离辐射损伤相关实验研究的理想参数。

以上所述，实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明技术的精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。