阅读说明：本技术 使用糖基转移酶对甜菊糖苷类化合物进行糖基化方法 (Method for glycosylating stevioside compounds by using glycosyltransferase ) 是由 王靖 李皓然 王小艳 郭元亨 陈博 丁子元 祁飞 刘瑞敏 李晨晨 李帅朋 孙绍鹏 于 2020-03-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及糖基转移酶UGT-76用于在甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’添加β-葡萄糖苷的新用途。另外,本发明还涉及使用糖基转移酶UGT-76和/或糖基转移酶UGT-76和糖基转移酶UGT-91生产莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷D(RD)和/或莱鲍迪苷M(RM)的方法。本发明在一定程度上解决了甜菊糖苷生物合成可用的糖基转移酶种类较少、方法较单一、且催化专一性及转化效率都较低的问题。本发明的转化率可达到100％,并且不需添加二甲亚砜或甲醛等不属于食品安全试剂的助溶剂和通透剂,因此更加安全,且方法操作简单,生产成本低,适合于工业化生产。(The invention relates to a new application of glycosyltransferase UGT-76 in adding β -glucoside to C-3' of the first glycosyl group of O- (Glc) n of stevioside compounds, and in addition, the invention also relates to a method for producing Rebaudioside A (RA), Rebaudioside D (RD) and/or Rebaudioside M (RM) by using glycosyltransferase UGT-76 and/or glycosyltransferase UGT-76 and UGT-91.)

使用糖基转移酶对甜菊糖苷类化合物进行糖基化方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，具体而言，涉及用来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76和/或来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76与来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91酶的组合对甜菊糖苷类化合物进行糖基化的方法，以及制备糖基化的甜菊糖苷类化合物的方法。

背景技术

2016年《柳叶刀》上发布相关的研究成果称中国已经超越美国成为全球肥胖人口最多的国家，健康膳食、低糖饮食受到我国政府及民众越来越多的关注及青睐，同时随着世界多国启动征收糖税政策，国际市场对高倍甜味剂的需求开始进入爆炸性增长阶段。高倍甜味剂有天然高倍甜味剂和人工合成高倍甜味剂，2014年以来《nature》和《CellMetabolism》相继发表研究表明阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖等人工合成高倍甜味剂的食用会改变肠道微生物菌群而诱发代谢紊乱(如葡萄糖不耐症)，并会导致摄入更多的食物而增加体重，因此，消费者对天然高倍甜味剂的需求及其在市场中的份额成逐年上升趋势。

甜菊糖苷类化合物是一类天然高倍(甜度为蔗糖的300倍)、“零卡路里”的甜味剂，被誉为继甘蔗和甜菜之后的“第三大糖源”。目前知晓的甜菊糖苷类化合物的结构式如下所示，随着R1、R2的不同，产生不同侧链修饰的甜菊糖苷类化合物，具体见表1。随着研究的不断进展，发现在甜菊糖苷产品中，高含量的稀有甜菊糖苷类化合物例如甜菊糖莱鲍迪苷A、甜菊糖莱鲍迪苷D以及甜菊糖莱鲍迪苷M等，能够改善甜菊糖苷产品的苦涩味，但是这些稀有成分在甜叶菊中的含量极低，通过以甜叶菊为原料进行提取的传统方法很难获得这些稀有的甜菊糖莱鲍迪苷。

表1从甜叶菊分离的甜菊糖苷类化合物

为突破目前的局限，近年来发展了生物法合成稀有甜菊糖苷和酶法转化的相关技术，生物合成法(采用微生物体内从葡萄糖合成甜菊糖苷的方法)目前发展较快研究较热，但目前仍未有成熟产品上市。

虽然目前已有部分酶法合成甜菊糖苷类化合物的方法，但普遍存在酶的转化效率低，一般为50％-90％；其次，大部分的方法需要添加二甲亚砜或甲醛等不属于食品安全试剂的助溶剂和通透剂，不利于采用该方法生产甜菊糖苷类化合物的应用；最后，目前大部分方法由于考虑到糖基转移酶的转化率问题均需要采用特定PH值的缓冲液作为酶催化的基质，使得生产成本较高，不适合产业化生产。因此急需一种安全高效并适合于工业化生产的新的合成甜菊糖苷类化合物的方法。

发明内容

因此，在一个方面，本发明提供了来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76用于催化在甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上添加葡萄糖苷的用途。

在本发明中，来源于向日葵(Helianthus annuus)的糖基转移酶UGT-76(在下文中也可简称为UGT-76酶)可具有NCBI ID:OTF99622中所示的糖基转移酶的活性。例如，所述来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76可具有由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。O-(Glc)n对应于式1化合物的-O-R₁和/或-O-R₂，其中，n可选自2至5之间的整数。

在另一方面，本发明提供了体外糖基化的方法，所述方法包括：步骤(1)，在第一葡萄糖基转移酶存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上，从而形成第一糖基化产物，其中，n为2至5之间的整数，其中，所第一述葡萄糖基转移酶为如上所述的UGT-76酶。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤a：在第一葡萄糖基转移酶的存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到所述甜菊糖苷类化合物和/或所述第一糖基化产物的COO-Glc的C-2’上，从而得到第二糖基化产物，其中，所述第二葡萄糖基转移酶为来源于斯塔摩酵母(Starmerella bombicola)的糖基转移酶UGT-91(在下文中也可简称为UGT-91酶)，所述具有NCBI ID:ADT71703中所示的糖基转移酶的活性。例如，所述第二葡萄糖基转移酶可具有如SEQ ID No：3所示氨基酸序列的。

在进一步优选的实施方式中，所述方法还包括，对第一糖基化产物和/或第二糖基化产物进行分离的步骤。

在本发明的方法的一个实施方式中，当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖苷(STV)时，所述第一糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷A(RA)；和/或，

当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖莱鲍迪苷D(RD)时，所述第一糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷M(RM)。

在本发明的方法的一个实施方式中，当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖苷时，所述第一糖基化产物为RA和/或RM，所述第二糖基化产物为RD。

在另一方面中，本发明提供了制备RA的方法，所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76催化甜菊糖苷生成RA。

在又一方面中，本发明还提供了制备RA和/或RD和/或RM中的一种或多种的方法，所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由来自向日葵的糖基转移酶UGT-76和来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91催化甜菊糖苷，从而生成RA和/或RD和/或RM中的一种或多种。

本发明的有益技术效果如下：本发明涉及来源于向日葵的UGT-76和来源于斯塔摩酵母的UGT-91两种糖基转移酶在生物合成高端甜菊糖苷类化合物中的新用途，在一定程度上解决了甜菊糖苷生物合成的糖基转移酶种类较少、方法较单一、且催化专一性及转化效率都较低的问题。此外，基于这两种酶蛋白的底物专一性构建从甜菊三糖苷到系列甜菊糖苷类化合物RA、RD和RM等的高效酶催化体系，基于高效酶催化体系可开发生产系列生物合成的稀有甜菊糖苷产品。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方式的UGT-76酶和UGT-91酶的催化活性示意图。

图2为所表达的UGT-76蛋白和UGT-91蛋白的电泳结果。

图3A和图3B为示出了用UGT-76酶由STV生产RA时，转化前的底物和转化后的反应产物的HPLC检测结果的图。

图4为示出用UGT-76酶和UGT-91酶由STV合成RD时，对反应产物的HPLC检测结果的图，其中底物反应完全，STV 100％转化生成RA，然后RA100％转化生成RD。

图5为示出用UGT-76酶和UGT-91酶由STV合成RM时，反应产物的HPLC检测结果的图，其中底物反应完全，RA 100％转化生成RD，RD 95％以上转化生成RM。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明人发现来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76能够催化在甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上添加β-葡萄糖苷的糖化反应，其中，n可选自2-5中的整数。其中，糖基转移酶UGT-76具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。例如，UGT-76酶可具有由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。

例如，UGT-76酶可将葡萄糖基供体(例如UDP-葡萄糖)的糖基转移到甜菊糖苷的O-(Glc)₂的第一个糖基的C-3’上，从而得到RA。或者，UGT-76酶可将葡萄糖基供体(例如UDP-葡萄糖)的糖基转移到RD的O-(Glc)₂的第一个糖基的C-3’上，从而得到RM。

此外，本发明人还发现，将来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76与来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91组合能够催化获得进一步的糖基化的甜菊糖苷类化合物。这是由于UGT-91酶可催化在甜菊糖苷类化合物的COO-Glc的C-2’上添加β-葡萄糖苷的糖化反应。其中，糖基转移酶UGT-91可具有如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。例如，UGT-91酶可由SEQID No：3所示的氨基酸序列组成。

因此，在本发明中，本发明人提供了体外糖基化的方法，所述方法包括：步骤(1)，在第一葡萄糖基转移酶存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上，从而形成第一糖基化产物，其中，n为2至5之间的整数，所述第一葡萄糖基转移酶为具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76。

在一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括步骤a：在第二葡萄糖基转移酶的存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到所述甜菊糖苷类化合物和/或所述第一糖基化产物的COO-Glc的C-2’上，从而得到第二糖基化产物，其中，所述第二葡萄糖基转移酶为具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列的来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91。

在一些实施方式中，可先进行UGT-76酶催化的糖基化反应，然后进行UGT-91酶催化的糖基化反应，或者以相反的顺序。在一些实施方式中，可交替多次进行或同时进行UGT-76酶催化的糖基化反应和UGT-91酶催化的糖基化反应。在一些实施方式中，可同时进行UGT-76酶催化的糖基化反应和UGT-91酶催化的糖基化反应。

例如，UGT-76酶和UGT-91酶的组合可由甜菊糖苷制备得到含有RA、RD和RM中的一种或多种的甜菊糖苷类化合物。在另一实施方式中，先通过UGT-76酶催化甜菊糖苷的糖基化，得到RA；再通过UGT-91酶催化RA的糖基化，得到RD。在另一实施方式中，先通过UGT-76酶催化甜菊糖苷的糖基化，得到RA；通过UGT-91酶催化RA的糖基化，得到RD；最后，通过UGT-76酶催化RD的糖基化，得到RM。

在本发明中，可被所述第一和/第二糖基转移酶糖基化的主要反应原料可为各种来源的甜菊糖苷类化合物。可选的甜菊糖苷类化合物原料包括但不限于：从天然植物中提取并直接用于本发明方法的甜菊糖苷类化合物，例如以甜叶菊叶为原料，通过浸提、除杂、脱色、干燥等工艺获得；市售的甜菊糖苷类化合物；合成的甜菊糖苷类化合物(例如，甜菊糖苷、甜菊糖莱鲍迪苷A和甜菊糖莱鲍迪苷D)，例如通过微生物发酵(如重组毕赤酵母、重组酿酒酵母、重组大肠杆菌等)合成。可将粉末、晶体、溶液等状态的甜菊糖苷类化合物(例如，甜菊糖苷、甜菊糖莱鲍迪苷A和甜菊糖莱鲍迪苷D)用于本发明的反应体系中。

例如，所述甜菊糖苷类化合物选自于由以下所组成的组中的一种或多种：甜菊醇双糖苷、甜菊糖苷、甜菊糖莱鲍迪苷A、甜菊糖莱鲍迪苷D和甜菊糖莱鲍迪苷E。

可用于本发明的葡萄糖基供体选自于由以下所组成的组中一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、或GDP-葡萄糖，或其组合。

糖基转移酶是一类催化活化的糖连接到不同的受体分子(如本发明的甜菊糖苷类化合物)上的酶。在本发明中，UGT-76酶可具有选自SEQ ID NO：1的多肽或其功能性衍生物。同时，本发明中的UGT-91酶可具有选自SEQ ID NO：3的多肽或其功能性衍生物。

本发明所用的术语“多肽的功能衍生物”包括具有与所示多肽具有相同功能的、SEQ ID NOs：1或3序列的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

本发明的这两种酶可包括但不限于：从其天然来源中提取的酶，例如，从向日葵中提取的天然UGT-76酶或者从斯塔摩酵母中分离的天然UGT-91酶，或者含有所述酶的提取物；或者通过分子生物学方法和/或基因工程方法获得的具有UGT-76酶和/或UGT-91酶活性的催化剂，只要其具有所需的催化活性。

本发明所述的通过基因工程方法获得的具有UGT-76酶和/或UGT-91酶活性的催化剂包括但不限于，产生UGT-76酶和/或UGT-91酶的微生物菌体或该微生物菌体的处理物(例如，裂解物)、含有UGT-76酶和/或UGT-91酶的微生物提取物、以及分离的UGT-76酶和/或UGT-91酶。

作为举例，可用于制备上述具有UGT-76酶和/或UGT-91酶活性的催化剂的微生物宿主可选自以下：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母。其中，宿主细胞优选为枯草芽孢杆菌。

本领域技术人员知晓在上述宿主细胞中表达外源蛋白的方法。举例而言，所述方法包括以下步骤：从UGT-76酶和/或UGT-91酶的天然来源植物中分离编码UGT-76酶和/或UGT-91酶的基因，和/或根据UGT-76酶和/或UGT-91酶的多肽序列或其功能性衍生物人工合成编码其的多核苷酸序列；将包含上述基因和/或多核苷酸序列的表达组件(例如，包含编码序列的重组表达载体或重组DNA片段)转化或转导合适的宿主细胞；在合适的培养基中培养的宿主细胞；以及从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的UGT-76酶和UGT-91酶的核苷酸序列的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly-His以及Poly-Arg等。这些标签可用于对蛋白进行纯化等。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在UGT-76酶和UGT-91酶的氨基酸序列的氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本领域的技术人员能够根据所选的宿主容易地构建包含编码UGT-76酶和UGT-91酶DNA的多核苷酸序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的多核苷酸序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡那霉素、四环素或氨苄青霉素抗性或绿色荧光蛋白(GFP)。

关于包含上述编码序列的重组DNA片段，本领域技术人员可根据所选的宿主选择合适的方法获得，并且本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的启动子、终止子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在一个实施方式中，本发明中的多肽优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

在本发明中，UGT-76酶和UGT-91酶可在不同的宿主细胞中表达，也可在相同的宿主细胞中进行表达。

本发明的酶促催化反应在水相体系中进行，以甜菊糖苷类化合物为受体底物，将葡萄糖基供体在UGT-76酶和任选地UGT-91酶催化作用下进行糖基化反应，生成第一和/或第二糖基化的甜菊糖苷类化合物。

本发明的水相体系可包含水(如纯水、蒸馏水、超纯水等)、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。例如，将原料溶解在水中。在反应体系中，原料(例如，STV、RA和/或RD)的初始浓度可为0.1～100g/L，优选1～60g/L，更优选10g～60g/L。在含有两种以上的原料时，所述初始浓度是指两种原料各自的浓度。葡萄糖基供体在反应体系中的初始浓度可为0.065～65g/L，优选0.65～40g/L，6.5～40g/L，26～40g/L。

UGT-76酶和/或UGT-91酶在反应体系中的终浓度可为2000～10000U/L，优选3000～8000U/L，更优选3000～5000U/L，尤其优选4000～5000U/L。在本发明中，UGT-76酶和/或UGT-91酶在反应体系中与原料(例如，STV、RA和/或RD)的含量比可为1:1～10，优选1:3，更优选1:5。例如，当原料为STV时，UGT-76酶在反应体系中的含量为50U/g STV；当原料为RD时，UGT-76酶在反应体系中的含量为100U/g RD。例如，当原料为STV时，UGT-76酶和UGT-91酶在反应体系中的含量分别为50U/g STV和200U/g STV；当原料为RA时，UGT-76酶和UGT-91酶在反应体系中的含量为100U/g RA和500U/g RA。

根据反应产物生成情况，可选择将UGT-76酶和/或UGT-91酶的反应温度设置在30～45℃，优选地为32～40℃、更优选为35～39℃，可根据所用的具体酶以及工业成本等对此进行调整。可将UGT-76酶和/或UGT-91酶反应体系的pH设置为酶最适pH左右，例如pH为5.0-9.0、优选6.0-7.5、更优选6.5-7.0，可根据所用的具体酶对此进行调整。UGT-76酶和/或UGT-91酶反应的时间可根据反应进程进行调整，例如反应0.5～72小时、优选5～48小时、更优选1.5～36小时、最优选10～20小时。

酶反应完成后，可通过各种方式终止酶反应(例如较简单的方式是通过煮沸(如100℃煮沸5分钟)使该酶变性以终止反应)。可选地，对所得反应产物进行离心并分离上清液以用于下一步反应。也可将所得反应产物不经分离和纯化直接用于下一步反应。

反应完成后，可对所得反应产物进行进一步分离、干燥、提纯、鉴定等步骤，以获得所需的莱鲍迪苷A/D/M。

例如，可通过离心分离反应上清液和沉淀物，如12000rpm，离心5分钟等。例如，可通过色谱法分离反应产物，如采用HPLC。例如，可通过冻干法对所得产物进行干燥。例如，可通过结晶法对所得产物进行进一步的纯化。

在本发明的另一方面，还提供了制备RA的方法。所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由UGT-76酶催化STV生成RA。

所述反应条件如上所定义。在一个实施方式中，所述STV以包含STV的甜叶菊提取物提供，其中，STV的含量优选为50wt％以上，例如，60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％、99wt％以上或甚至100wt％。所述葡萄糖基供体选自于由以下所组成的组中一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、或GDP-葡萄糖，或其组合；其中，优选UDP-葡萄糖。在一个优选的实施方式中，STV与UGT-76酶在反应体系中的比例为50U/gSTv以上，优选为100U/g STv，这一比例使得STV能够被完全转换为RA。其中，葡萄糖基供体的含量以过量提供，优选葡萄糖基供体与UGT-76酶的比例为35U/g葡萄糖基供体以上，优选为70U/g葡萄糖基供体以上。

在优选的实施方式中，所述制备RA的方法还包括对酶催化反应进行终止和/或对RA进行分离的步骤。

在本发明的另一方面，还提供了制备RD的方法。所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由UGT-76酶和UGT-91酶催化STV生成RD。

所述反应条件如上所定义。在一个实施方式中，所述STV为包含STV的甜叶菊提取物，其中，STV的含量优选为50wt％以上，例如，60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％、99wt％以上或甚至100wt％。所述葡萄糖基供体选自于由以下所组成的组中的一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、或GDP-葡萄糖，或其组合；其中，优选UDP-葡萄糖。

在本发明的实施方式中，所述生产RD的方法包含以下步骤：在葡萄糖基供体存在下，由UGT-76酶催化STV生成RA；任选地对UGT-76酶催化反应进行终止，和/或对RA进行分离；在葡萄糖基供体存在下，由UGT-91酶催化RA生成RD；以及，任选地对酶催化反应进行终止和/或对RD进行分离。

在优选的实施方式中，UGT-76酶与STV的比例如制备RA的方法中所述，以使得STV被完全地转化为RA。在不对酶促反应进行终止或不进行RA的分离的步骤的情况下，UGT-76酶与STV的比例优选不超过100U/g，以免将RD进一步转化为RM。

在一些实施方式中，RA与UGT-91酶在反应体系中的比例为200U/g RA、优选为500U/g RA，这一比例使得RA能够被完全转换为RD。其中，过量提供葡萄糖基供体，其中葡萄糖基供体与UGT-91酶的比例优选为140U/g葡萄糖基供体，更优选为350U/g葡萄糖基供体。

在本发明的实施方式中，所述制备RD的方法包含以下步骤：在葡萄糖基供体存在下，同时加入UGT-76酶和UGT-91酶催化STV一步生成RD；以及任选地对催化反应进行终止，和/或对RD进行分离。

在优选的实施方式中，UGT-76酶与UGT-91酶以及STV的比例为100U UGT-76酶/gSTv和500U UGT-91酶/g STv；并且尤其是UGT-76酶与STV的含量不高于100U/g，以避免生成RM。

在本发明的另一方面，还提供了制备RM的方法。所述方法包括：在葡萄糖基供体存在的情况下，由UGT-76酶和UGT-91酶催化STV生成RM；或者，在葡萄糖基供体存在的情况下，由UGT-76酶和UGT-91酶催化RA生成RM；或者，在葡萄糖基供体存在的情况下，由UGT-76酶催化RD生成RM。

所述反应条件如上所定义。在一个实施方式中，所述STV以包含STV的甜叶菊提取物，其中，STV的含量优选为50wt％以上，例如，60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％、99wt％以上或甚至100wt％。所述葡萄糖基供体选自于由以下所组成的组中一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、或GDP-葡萄糖，或其组合；其中，优选UDP-葡萄糖。

所述RA和RD可如上所述来制备，或者可以包含RA和/或RD的甜叶菊提取物来提供，其中，RA和/或RD的含量优选为50wt％以上，例如，60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％、99wt％以上或甚至100wt％。

在优选的实施方式，所述由STV生成RM方法包括以下步骤：采用如上所述的方法，由STV生成RD；任选地，对催化反应进行终止，和/或对RD进行分离；以及在葡萄糖基供体存在下，由UGT-76酶催化RD生成RM；以及，任选地对催化反应进行终止，和/或对RM进行分离。

在由UGT-76酶催化RD生成RM的步骤中，UGT-76酶与RD的比例为100U/g RD、优选为200U/g RD；葡萄糖基供体的量为140U/g葡萄糖基供体。

在优选的实施方式，所述由RA生成RM方法包括：在葡萄糖基供体存在下，由UGT-91酶催化RA生成RD；任选地，对催化反应进行终止，和/或对RD进行分离；在葡萄糖基供体存在下，由UGT-76酶催化RD生成RM；以及，任选地对催化反应进行终止，和/或对RM进行分离。

在优选的实施方式，所述由RA生成RM方法包括：在葡萄糖基供体存在下，由UGT-91酶和UGT-76酶催化RA一步生成RM；以及，任选地对催化反应进行终止，和/或对RM进行分离。

其中，UGT-91酶与UGT-76酶和RA的比例优选为200U UGT-91酶:50U UGT-76酶：1gRA，更优选为500U UGT-91酶:100U UGT-76酶：1g RA。

所述由RD生成RM方法包括，在葡萄糖基供体存在下，由UGT-76酶催化RD生成RM；以及，任选地对催化反应进行终止，和/或对RM进行分离。具体可参见如上的定义。

将通过以下段落中的实施方案对本发明进行进一步的描述：

[1]一种糖基化方法，所述方法包括使用来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76在甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上添加β-葡萄糖苷而进行糖基化，其中，n为2至5之间的整数。

[2].如权利要求1所述的方法，所述方法为体外糖基化的方法，所述体外糖基化的方法包括：步骤(1)，在第一葡萄糖基转移酶存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的O-(Glc)n的第一个糖基的C-3’上，从而形成第一糖基化产物，其中，n为2至5之间的整数，所述葡萄糖基转移酶为具有如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76。

[3].如段落[2]所述的方法，其中，所述甜菊糖苷类化合物选自于由以下所组成的组中的一种或多种：

甜菊醇双糖苷、甜菊糖苷、甜菊糖莱鲍迪苷D和甜菊糖莱鲍迪苷E。

[4].如段落[2]或[3]所述的方法，所述方法进一步包括步骤a：在第二葡萄糖基转移酶的存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到所述甜菊糖苷类化合物和/或所述第一糖基化产物的COO-Glc的C-2’上，从而得到第二糖基化产物，其中，所述第二葡萄糖基转移酶为具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列的来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91。

[5].如段落[2]-[4]中任一项所述的方法，其中，所述甜菊糖苷类化合物为选自于由以下所组成的组中的一种或多种：存在于天然植物中的甜菊糖苷类化合物、提取的甜菊糖苷类化合物、和合成的甜菊糖苷类化合物；和/或，所述葡萄糖基供体选自于由以下所组成的组中一种或多种：UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、CDP-葡萄糖、或GDP-葡萄糖，或其组合。

[6].如段落[2]-[5]中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或糖基转移酶的用量为2000～10000U/L，优选3000～8000U/L、更优选3000～5000U/L、最优选4000～5000U/L。

[7].如段落[2]-[6]中任一项所述的方法，其中，所述甜菊糖苷类化合物和/或所述第一糖基化产物的起始浓度为0.1～100g/L，优选1～60g/L、更优选10～60g/L、最优选30～60g/L；所述葡萄糖基供体的起始浓度为0.065～65g/L，优选0.65～40g/L、更优选6.5～40g/L、最优选20～40g/L。

[8].如段落[2]-[7]中任一项所述的方法，其中，所述糖基化的条件为选自于由以下组的一种或多种：

(a)在水性体系中进行，所述水性体系选自以下中的一种或多种：水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液，pH为5.0-9.0、优选6.0-7.5、更优选6.5-7.0；

(b)反应温度为30～45℃、优选地为32～40℃、更优选为35～39℃；和/或

(c)反应时间为0.5～72小时、优选5～48小时、更优选1.5～36小时、最优选10～20小时。

[9].如段落[2]-[8]中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括，对第一糖基化产物进行分离的步骤。

[10].如段落[2]所述的方法，其中，

当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖苷时，所述第一糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷A；和/或，

当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖莱鲍迪苷D时，所述第一糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷M。

[11].如段落[4]所述的方法，其中，

当所述甜菊糖苷类化合物为甜菊糖苷时，所述第一糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷A和/或甜菊糖莱鲍迪苷M，所述第二糖基化产物为甜菊糖莱鲍迪苷D。

[12].一种制备甜菊糖莱鲍迪苷A的方法，所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由来源于向日葵的糖基转移酶UGT-76催化甜菊糖苷生成所述甜菊糖莱鲍迪苷A。

[13].一种制备甜菊糖莱鲍迪苷A和/或甜菊糖莱鲍迪苷D和/或甜菊糖莱鲍迪苷M中的一种或多种的方法，所述方法包括在葡萄糖基供体存在的情况下，由来自向日葵的糖基转移酶UGT-76和来源于塔摩酵母的糖基转移酶UGT-91催化甜菊糖苷，从而生成甜菊糖莱鲍迪苷A和/或甜菊糖莱鲍迪苷D和/或甜菊糖莱鲍迪苷M中的一种或多种。

[14].一种用于制备甜菊糖莱鲍迪苷A的组合物，其特征在于，所述组合物包含含有糖基转移酶UGT-76的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-76的提取物或糖基转移酶UGT-76，以及葡萄糖基供体。

[15].一种用于制备甜菊糖莱鲍迪苷D的组合物，其特征在于，所述组合物包含含有糖基转移酶UGT-76的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-76的提取物或糖基转移酶UGT-76，含有糖基转移酶UGT-91的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-91的提取物或糖基转移酶UGT-91，以及葡萄糖基供体。

[16].一种用于制备甜菊糖莱鲍迪苷M的组合物，其特征在于，所述组合物包含含有糖基转移酶UGT-76的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-76的提取物或糖基转移酶UGT-76，含有糖基转移酶UGT-91的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-91的提取物或糖基转移酶UGT-91，以及葡萄糖基供体。

[17].一种用于制备甜菊糖莱鲍迪苷A和/或甜菊糖莱鲍迪苷D和/或甜菊糖莱鲍迪苷M中任一种或多种的组合物，其特征在于，所述组合物包含含有糖基转移酶UGT-76的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-76的提取物或糖基转移酶UGT-76，含有糖基转移酶UGT-91的重组菌或其裂解物、含有糖基转移酶UGT-91的提取物或糖基转移酶UGT-91，以及葡萄糖基供体。

实施例

以下结合具体实施例对本文进行详细描述。下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特别说明，下述实施例中使用的试剂购自Sigma、Thermofisher等公司。

实施例1 UGT-76和UGT-91的获得

通过对NCBI数据库，获得两个具有活性的糖基转移酶向日葵UGT-76(NCBI ID:OTF99622)和来源斯塔摩酵母UGT-91(NCBI ID:ADT71703)的核苷酸序列。

通过如下方法得到UGT-76和UGT-91酶：由通用生物系统(安徽)有限公司合成UGT-76和UGT-91序列(分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)，并在其5’端添加BamH I酶切位点，同时在终止密码子前添加组氨酸标签，在3’端添加Not I酶切位点。通过BamH I和Not I(New England Biolabs，NEB)对所合成的片段进行双酶切，并用T4 DNA连接酶(Takara)将双酶切后的片段连接至同样通过BamH I和Not I进行双酶切的pET30载体(本实验室保存)。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在带有卡那霉素的LB固体平板上进行培养并筛选阳性克隆。挑取单菌落进行菌落PCR验证；并对菌落PCR显示阳性的克隆进行测序验证。

经对测序验证，对显示序列正确的阳性克隆进行质粒提取，得到重组质粒UGT-76-pET30和UGT-91-pET30，将其分别转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，在带有卡那霉素的LB平板上挑取单菌落进行菌落PCR验证，得到UGT-76和UGT-91表达菌株。

将UGT-76和UGT-91表达菌株接种于5mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以1％(v/v)的接种量接入500mL LB培养基中，37℃、200rpm继续培养2-3h后，待培养物OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG。随后置于16℃、150rpm条件下过夜培养。

离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，而后用40mL该缓冲液重悬菌体。在4℃下使用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，条件为功率20％，超声10min，超声3s，间隔2s。在4℃下10000g离心10min，收集上清液，即UGT-76和UGT-91粗分离蛋白产品。使用AKTApurifier 100蛋白层析仪，将流速保持1.0mL/min，用0.2M硫酸镍溶液洗柱子，使柱子结合上镍离子；用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)预平衡Ni柱(GE，HisTrap FF，1mL)，平衡至少2个柱体积；上样时，将流速降至0.5mL/min上样；分别用含有20mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和50mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗去结合力弱的杂蛋白，然后用含有250mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)冲洗柱子，洗脱下来的是结合力强的目的蛋白，即为纯化的UGT-76和UGT-91，电泳结果如图2所示。

实施例2高纯度RA的生产

以购自山东海根生物技术有限公司的甜菊糖提取物(总苷含量为90wt％，其中总苷是指所有甜菊糖苷类化合物的总和，主要含有STV和RA，产品编号为甜菊糖HG-RA-50)为底物，1mL反应体系中，底物浓度为20g/L，UDP-葡萄糖浓度为20mM，UGT-76酶浓度为0.1mg/mL，在37℃条件下，反应8h后，通过HPLC检测反应产物，底物中STV能够100％转化生成RA(图3)。

反应后的混合溶液首先经大孔树脂处理，脱除其中的杂质成分，如蛋白、无机盐、色素等，洗脱的溶液使用离子交换色谱分离尿苷二磷酸和糖类成分，尿苷二磷酸回用至前端的酶催化体系，糖溶液进行多级多效蒸发浓缩。由前端催化工艺控制，获得不同转化得率的莱鲍迪苷A溶液，对于高纯度的莱鲍迪苷A溶液，直接通过冷却、醇析，获得莱鲍迪苷A结晶，通过过滤、洗涤、干燥、精制和包装，即为成品莱鲍迪苷A，其中莱鲍迪苷A成分纯度不低于95％；对于低纯度的莱鲍迪苷A溶液，首先利用莱鲍迪苷A和甜菊糖苷的溶解度差异，通过低温结晶，析出部分莱鲍迪苷A成分，回用至前端催化体系，而后使用低温醇析，获得含有莱鲍迪苷A的晶体，通过过滤、洗涤、干燥、精制和包装，即为成品莱鲍迪苷A，其中莱鲍迪苷A成分纯度为50％。配合建立相应的检测体系和质量标准，对成品的出厂质量进行品质控制。

通过高效液相色谱(HPLC)定性定量检测对分离纯化后的产物进行鉴定，具体方法如下：

高效液相色谱仪：Agilent LC1260

色谱柱：Agilent·Zorbax·SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)

流动相：乙腈-磷酸钠缓冲液(pH＝2.60，27:73v/v)

流速：1.0mL/min，柱温为40℃，进样量:10μL

紫外检测器，检测波长210nm

检测结果为：RA出峰时间为7.997min(图3A)、STV出峰时间为8.496min(图3A)。

实施例3高纯度RD的生产

以总苷含量为50wt％-90wt％的甜菊糖提取物(如上所述，购自山东海根生物技术有限公司)为底物催化合成RD涉及到两种糖基转移酶(UGT76和UGT91)，以HG-RA-99(山东海根生物技术有限公司)为底物催化合成RD只涉及到UGT91一种糖基转移酶，反应示意图如图1所示。

以总苷含量90wt％的甜菊糖提取物(购自山东海根生物技术有限公司)为底物，1mL反应体系中，底物浓度为2g/L，UDP-葡萄糖浓度为2mM，UGT-76酶浓度为0.01mg/mL，UGT91酶浓度为0.02mg/mL，在37℃条件下，反应24h后，通过HPLC检测反应产物，底物中STV能够100％转化生成RA，然后RA能够100％转化生成RD(图4)。检测方法同实施例2，RD的出峰时间为3.222min。

实施例4高纯度RM的生产

以总苷90wt％的甜菊糖提取物(购自山东海根生物技术有限公司)为底物，1mL反应体系中，底物浓度为2g/L，UDP-葡萄糖浓度为2mM，UGT-76酶浓度为0.01mg/mL，UGT91酶浓度为0.02mg/mL，在37℃条件下，反应24h后，再加入0.01mg/mL的UGT-76酶，在37℃条件下，反应24h后，通过HPLC检测反应产物，底物中STv能够100％转化生成RA，然后RA能够100％转化生成RD，最后RD能够95％以上转化生成RM(图5)。检测方法同实施例2，RM的出峰时间为3.981min。

序列表

<110> 中粮营养健康研究院有限公司；金禾益康（北京）生物科技有限公司

<120> 使用糖基转移酶对甜菊糖苷类化合物进行糖基化方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 向日葵（Helianthus annuus）

<400> 1

Met Glu Thr Gln Thr Glu Thr Thr Asn Thr Val Arg Arg Asn Gln Arg

1 5 10 15

Ile Ile Phe Phe Pro Leu Pro Tyr Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu

20 25 30

Gln Leu Ala Asn Leu Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Leu

35 40 45

His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr

50 55 60

Phe Lys Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro His Asp Glu Arg Tyr Ser Asn

65 70 75 80

Leu Pro Leu His Gly Met Gly Ala Phe Asn Arg Leu Phe Val Phe Asn

85 90 95

Glu Asp Gly Ala Asp Glu Leu Arg His Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu

100 105 110

Ala Ser Lys Glu Asp Asp Glu His Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala

115 120 125

Leu Trp His Phe Thr Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Pro Arg

130 135 140

Leu Val Leu Arg Thr Ser Ser Leu Phe Cys Phe Leu Ala Tyr Ala Ser

145 150 155 160

Phe Pro Val Phe Asp Asp Leu Gly Tyr Leu Asn Leu Ala Asp Gln Thr

165 170 175

Arg Leu Asp Glu Gln Val Ala Glu Phe Pro Met Leu Lys Val Arg Asp

180 185 190

Ile Ile Lys Leu Gly Phe Lys Ser Ser Lys Asp Ser Ile Gly Met Met

195 200 205

Leu Gly Asn Met Val Lys Gln Thr Lys Ala Ser Leu Gly Ile Ile Phe

210 215 220

Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu Pro Glu Val Glu Thr Val Ile Arg

225 230 235 240

Asp Ile Leu Ala Pro Ser Phe Leu Ile Pro Phe Pro Lys His Phe Thr

245 250 255

Ala Ser Ser Ser Ser Leu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Val Phe Pro Trp

260 265 270

Leu Asp Gln Gln Pro Pro Asn Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser

275 280 285

Thr Thr Glu Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala His Gly Leu

290 295 300

Val Asp Ser Glu Gln Thr Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Tyr Val

305 310 315 320

Lys Gly Pro Ile Trp Ile Glu Leu Leu Asp Asp Gly Phe Val Gly Glu

325 330 335

Lys Gly Arg Ile Val Lys Trp Ala Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His

340 345 350

Glu Ala Ile Gly Ala Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu

355 360 365

Glu Ser Val Cys Glu Gly Val Pro Met Ile Met Ser Pro Phe Met Gly

370 375 380

Asp Gln Ala Leu Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Ser Lys Val Gly

385 390 395 400

Val Tyr Leu Gly Asn Gly Trp Glu Arg Arg Glu Ile Ala Ser Ala Ile

405 410 415

Arg Lys Val Met Val Asp Glu Glu Gly Glu His Ile Arg Glu Asn Ala

420 425 430

Arg Asp Leu Lys Gln Lys Ala Asp Asp Ser Leu Val Lys Gly Gly Ser

435 440 445

Ser Tyr Glu Ser Leu Glu Ser Leu Val Ala Tyr Ile Ser Ser Phe

450 455 460

<210> 2

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaacgc agacagaaac gacgaatacg gttcgccgca atcagcgcat cattttcttc 60

ccgcttccgt atcaaggtca tatcaacccg atgctgcaac tggcgaatct gctgtattca 120

aaaggcttta gcattacaat tcttcataca aatttcaaca aacctaagac gagcaactac 180

ccgcacttca cgtttaaatt tattctggac aacgaccctc atgacgaacg ctatagcaat 240

ttaccgctgc atggcatggg cgcatttaat cgtttatttg tgtttaacga ggacggcgca 300

gatgaactga gacatgagct ggaactgctg atgcttgcgt caaaggagga tgatgagcac 360

gtgagctgtt taattacaga tgcactgtgg cacttcacac agagcgtggc agattcttta 420

aatctgccgc gccttgttct gcgcacttct tctttatttt gctttctggc gtacgcttct 480

tttccggtgt ttgacgattt aggctattta aatctggcag accaaacaag actggacgag 540

caagttgcgg agtttccgat gcttaaagtg cgcgatatta ttaaactggg ctttaaaagc 600

agcaaagata gcatcggaat gatgctgggc aacatggtga aacagacgaa ggcgagcctt 660

ggcatcatct ttaatagctt caaggagctg gaggaaccgg aggtggaaac ggttattcgc 720

gacatccttg cgccgtcatt ccttatcccg ttcccgaagc attttacagc gtcaagcagc 780

agccttctgg accaagaccg tacagtgttt ccttggctgg accaacagcc gcctaattct 840

gttctgtacg tgagcttcgg cagcacgacg gaggtggacg aaaaggactt tttagaaatc 900

gcgcatggtt tagtggactc agagcagacg tttctttggg tggttcgtcc cggttacgtg 960

aaaggcccta tttggattga gctgctggac gatggcttcg tgggcgaaaa aggccgcatt 1020

gtgaaatggg caccgcagca agaagtgctt gcgcatgaag ctattggagc gttttggaca 1080

catagcggct ggaactcaac gcttgagagc gtgtgcgaag gagtgccgat gattatgtca 1140

ccgttcatgg gcgaccaagc tcttaacgca cgctatatga gcgacgtgag caaagtgggc 1200

gtttatctgg gcaacggctg ggaaagaaga gagattgcga gcgcgattcg caaagtgatg 1260

gtggacgaag agggcgaaca tattcgcgaa aacgcgcgcg atttaaagca gaaagcagat 1320

gactctttag tgaaaggcgg aagcagctat gaatcactgg agtctttagt ggcgtacatt 1380

agcagcttc 1389

<210> 3

<211> 432

<212> PRT

<213> 斯塔摩酵母（Starmerella bombicola）

<400> 3

Met Ala Ile Glu Lys Pro Val Ile Val Ala Cys Ala Cys Pro Leu Ala

1 5 10 15

Gly His Val Gly Pro Val Leu Ser Leu Val Arg Gly Leu Leu Asn Arg

20 25 30

Gly Tyr Glu Val Thr Phe Val Thr Gly Asn Ala Phe Lys Glu Lys Val

35 40 45

Ile Glu Ala Gly Cys Thr Phe Val Pro Leu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr

50 55 60

His Glu Tyr Asn Leu Pro Glu Ile Ala Pro Gly Leu Leu Thr Ile Pro

65 70 75 80

Pro Gly Leu Glu Gln Thr Gly Tyr Ser Met Asn Glu Ile Phe Val Lys

85 90 95

Ala Ile Pro Glu Gln Tyr Asp Ala Leu Gln Thr Ala Leu Lys Gln Val

100 105 110

Glu Ala Glu Asn Lys Ser Ala Val Val Ile Gly Glu Thr Met Phe Leu

115 120 125

Gly Val His Pro Ile Ser Leu Gly Ala Pro Gly Leu Lys Pro Gln Gly

130 135 140

Val Ile Thr Leu Gly Thr Ile Pro Cys Met Leu Lys Ala Glu Lys Ala

145 150 155 160

Pro Gly Val Pro Ser Leu Glu Pro Met Ile Asp Thr Leu Val Arg Gln

165 170 175

Gln Val Phe Gln Pro Gly Thr Asp Ser Glu Lys Glu Ile Met Lys Thr

180 185 190

Leu Gly Ala Thr Lys Glu Pro Glu Phe Leu Leu Glu Asn Ile Tyr Ser

195 200 205

Ser Pro Asp Arg Phe Leu Gln Leu Cys Pro Pro Ser Leu Glu Phe His

210 215 220

Leu Thr Ser Pro Pro Pro Gly Phe Ser Phe Ala Gly Ser Ala Pro His

225 230 235 240

Val Lys Ser Ala Gly Leu Ala Thr Pro Pro His Leu Pro Ser Trp Trp

245 250 255

Pro Asp Val Leu Ser Ala Lys Arg Leu Ile Val Val Thr Gln Gly Thr

260 265 270

Ala Ala Ile Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Pro Ala Leu Gln Ala Phe

275 280 285

Ala Asp Glu Glu Asp Thr Leu Val Val Gly Ile Leu Gly Val Lys Gly

290 295 300

Ala Ser Leu Pro Asp Ser Val Lys Val Pro Ala Asn Ala Arg Ile Val

305 310 315 320

Asp Tyr Phe Pro Tyr Asp Glu Leu Leu Pro His Ala Ser Val Phe Ile

325 330 335

Tyr Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gln His Ser Leu Ser His Gly Val

340 345 350

Pro Val Ile Ile Gly Gly Gly Met Leu Val Asp Lys Pro Ala Val Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Val Trp Ala Gly Val Gly Tyr Asp Leu Gln Thr Leu Gln

370 375 380

Ala Thr Ser Glu Leu Val Ser Thr Ala Val Lys Glu Val Leu Ala Thr

385 390 395 400

Pro Ser Tyr His Glu Lys Ala Met Ala Val Lys Lys Glu Leu Glu Lys

405 410 415

Tyr Lys Ser Leu Asp Ile Leu Glu Ser Ala Ile Ser Glu Leu Ala Ser

420 425 430

<210> 4

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctattg aaaagccagt cattgttgct tgcgcatgtc cattggctgg tcatgttggt 60

ccagtcttgt ctttagttag aggtttgtta aacagaggtt acgaggtcac atttgttact 120

ggtaacgctt ttaaagaaaa agttattgaa gctggttgca ctttcgtccc attgcaaggt 180

agagcagatt atcacgaata taatttgcct gagatagctc ctggtttgtt gacaattcca 240

ccaggtttgg aacagactgg ttattctatg aatgaaattt tcgttaaggc tattcctgag 300

cagtacgacg ctttgcagac tgctttgaag caggtcgaag cagagaacaa gtcagcagtc 360

gttattggtg aaacaatgtt cttgggtgtt cacccaatat cattgggtgc tcctggtttg 420

aaacctcagg gtgtcattac tttgggtact attccatgca tgttgaaggc tgaaaaggct 480

ccaggtgtcc catcattgga gccaatgatt gatactttag ttagacagca ggtctttcaa 540

ccaggtactg actctgaaaa agaaattatg aagacattag gtgctactaa agaaccagaa 600

tttttattag aaaacattta ttcttcacca gataggttct tgcagttgtg tccaccatct 660

ttggagttcc atttgacttc tcctccacct ggtttctctt ttgctggttc tgcaccacac 720

gtcaagtcag ctggtttggc tacaccacca cacttgcctt cttggtggcc agatgtctta 780

tctgctaaga gattgattgt tgttacacaa ggaacagcag ctattaacta tgaagatttg 840

ttgattcctg ctttgcaggc tttcgctgac gaagaagaca ctttggtcgt cggaatattg 900

ggtgtcaagg gtgcttcttt gccagactct gtcaaggtcc cagctaacgc tagaattgtt 960

gactattttc catacgatga attgttgcca cacgcttcag tttttattta taacggtggt 1020

tatggtggtt tacaacattc tttgtctcat ggtgttcctg ttattattgg tggtggtatg 1080

ttggtcgaca aacccgctgt tgcatctagg gctgtttggg ctggtgttgg ttacgacttg 1140

cagactttgc aagctacttc agaattagtc tcaaccgctg ttaaggaggt cttggcaact 1200

ccatcatacc acgagaaggc aatggctgtt aagaaggaat tagaaaagta taagtctttg 1260

gacattttgg aatctgcaat atctgaattg gcttct 1296