一种低分量海参活性肽的提取方法
阅读说明：本技术 一种低分量海参活性肽的提取方法 (Method for extracting low-component sea cucumber bioactive peptide ) 是由 鞠文明 孙永军 王淑倩 吴中英 李俊峰 胡炜 邱美茹 王鹏程 彭莉晶 吴学记 刘 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低分量海参活性肽的提取方法,其经过以下步骤：a.原料处理；b.原料脱色；c.酶解；d.多肽分子分级分离和纯化；e.干燥。本发明利用超临界技术脱除色素和脂肪,通过切向流过滤技术分级分离活性肽并纯化,经低温超微粉碎耦合真空干燥获得低分子量海参活性肽。本发明可以快速的对海参活性肽进行提取,提取的海参活性肽纯度高,分子量低且均一性好,生物活性高,易于被人体消化吸收,并且原料利用率高,节约资源,提取耗时较短,制作方法简单。(The invention discloses a method for extracting low-component sea cucumber bioactive peptide, which comprises the following steps: a. treating raw materials; b. decoloring raw materials; c. carrying out enzymolysis; d. separating and purifying polypeptide molecules; e. and (5) drying. The invention removes pigment and fat by using a supercritical technology, fractionally separates and purifies active peptide by using a tangential flow filtration technology, and obtains the low molecular weight sea cucumber active peptide by low-temperature ultramicro-crushing coupled vacuum drying. The method can quickly extract the sea cucumber bioactive peptide, the extracted sea cucumber bioactive peptide has high purity, low molecular weight, good uniformity, high biological activity, easy digestion and absorption by human bodies, high raw material utilization rate, resource saving, short extraction time and simple preparation method.)
技术领域
本发明涉及肽的提取制备，具体为一种低分量海参活性肽的提取方法。
背景技术
世界各大洋均有海参分布，种类最多的是印度—西太平洋区，尤其是食用海参，大多分布在热带珊瑚礁内。我国北方只有一种食用海参，即刺参，而海南岛和西沙群岛却产有十几种食用海参。食用海参大多生活于潮间带或浅海。海参为狭盐性动物，在半咸水或低盐海水中很少见。对水质的污染也很敏感，在污染的海水里，海参难以生存。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物，由两个及以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物，通常由10-100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，活性肽对人体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢有促进作用，但低分子量海参肽更易吸收且活性最显著，目前海参肽的种类很多，低分子量的海参肽由于提取效率低、操作复杂、成本高，未形成有效的产品，如何制备低分量海参活性肽，成为我们需要解决的问题。
发明内容
为了克服现有低分子量海参肽制备存在提取效率低、操作复杂的不足，本发明的目的在于提供一种提取效率高、操作简便的低分量海参活性肽的提取方法。本发明针对海参资源，利用超临界技术脱除色素和脂肪，通过切向流过滤技术分级分离活性肽并纯化，经低温超微粉碎耦合真空干燥获得低分子量海参活性肽。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种低分量海参活性肽的提取方法，其特征在于：其经过以下工艺步骤：
a. 原料处理：选取海参，将海参粉碎成条状；
b. 原料脱色：将条状海参进行超临界萃取技术脱色处理；
c. 酶解：配制水解酶溶液与脱色的海参进行混合，并在一定酶解条件下酶解；
d. 多肽分子分级分离和纯化：采用切向流超滤并进行多肽分子分级分离和纯化；
e. 干燥：采用低温超微粉碎耦合真空干燥制备成低分量海参活性肽。
作为优选的方法，步骤b中，超临界脱色条件为：乙醇做携带剂用量为50-60ml/500g海参原料，压力22-25MPa，温度45-50℃，二氧化碳流速12-15kg/h。
作为优选的方法，步骤c中，所述的水解酶包括碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。
作为优选的方法，步骤c中，所述的酶解条件为：调整pH值至7.5-9，按照酶与海参的重量比为1：150-200添加碱性蛋白酶，在55-62℃条件下酶解2-4小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，然后调pH值至5.5-6.0； 然后按酶与混合溶液的重量比1：45-60添加复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，在45-58℃条件下酶解2-3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，最后将酶与混合溶液的重量比为1：60-80添加木瓜蛋白酶，在52-55℃条件下酶解1-3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟。
作为优选的方法，步骤d中，所述的切向流超滤采用分别截留平均分子质量为10000u、3000u和1000u的膜。
作为优选的方法，步骤e中，所述的低温超微粉碎耦合真空干燥是低温超微粉碎机工作温度-20--15℃，超微粉碎机腔体真空度为70-90Pa。
作为优选的方法，所述的复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，按质量分数复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1:1-3:1-2。
本发明有益效果：
（1）超临界技术用于海参原料预处理，进行色素的脱除，提高了产品的纯度，最为重要的是超临界处理是无损处理技术，原料质量得以保持；
（2）多酶复合酶解法最大限度的利用了海参原料，保证了酶解产物的有效性，获得的多肽分子具有较高的生物活性；
（3）采取切向流超滤可根据活性肽性质及需要，分成不同的分子量等级，有利于活性肽的分级利用，更重要的是，可定位特定功能的肽，减少了肽资源的浪费；
（4）使用低温超微粉碎耦合真空干燥方法，此法不仅适用于低温处理工艺，也保证了产物的生物活性，其利用超微粉碎，低温将冰处理为微米级原料，通过真空的气化作用，实现瞬时干燥，达到了真空冷冻干燥的效果。本发明方法提取效率更高，产量更大，操作简便，适于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施案例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
实施例1
一种低分量海参活性肽的提取方法，其经过以下工艺步骤：
a. 原料处理：选取海参，将海参粉碎成条状；
b. 原料脱色：将条状海参进行超临界萃取技术脱色处理，超临界脱色条件为：乙醇做携带剂用量为55ml/500g海参原料，压力24MPa，温度48℃，二氧化碳流速13kg/h；
c. 酶解：将配制的水解酶溶液与脱色的海参进行混合，并在一定酶解条件下酶解；其中，所述水解酶包括碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶解条件为：调整pH值至8，按照酶与海参的重量比为1：180添加碱性蛋白酶，在60℃条件下酶解3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，然后调pH值至5.5；然后按酶与混合溶液的重量比1：50添加复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，在48℃条件下酶解2.5小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，最后将酶与混合溶液的重量比为1：75添加木瓜蛋白酶，在54℃条件下酶解3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，所述复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，按质量分数复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1:2:2；
d. 多肽分子分级分离和纯化：采用切向流超滤并进行多肽分子分级分离和纯化，分别截留平均分子质量为10000u、3000u和1000u的膜；
e. 干燥：采用低温超微粉碎耦合真空干燥制备成低分量海参活性肽，所述低温超微粉碎耦合真空干燥是低温超微粉碎机工作温度-20℃，超微粉碎机腔体真空度为80Pa。
实施例2
一种低分量海参活性肽的提取方法，其经过以下工艺步骤：
a. 原料处理：选取海参，将海参粉碎成条状；
b. 原料脱色：将条状海参进行超临界萃取技术脱色处理，超临界脱色条件为：乙醇做携带剂用量为50ml/500g海参原料，压力22MPa，温度45℃，二氧化碳流速12kg/h；
c. 酶解：将配制的水解酶溶液与脱色的海参进行混合，并在一定酶解条件下酶解上；其中，所述的水解酶包括碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；酶解条件为：调整pH值至7.5，按照酶与海参的重量比为1：200添加碱性蛋白酶，在55℃条件下酶解2小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，然后调pH值至5.5； 然后按酶与混合溶液的重量比1：60添加复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，在45℃条件下酶解2小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，最后将酶与混合溶液的重量比为1：80添加木瓜蛋白酶，在52℃条件下酶解1小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，所述复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，按质量分数复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1:1:1；
d. 多肽分子分级分离和纯化：采用切向流超滤并进行多肽分子分级分离和纯化，分别截留平均分子质量为10000u、3000u和1000u的膜；
e. 干燥：采用低温超微粉碎耦合真空干燥制备成低分量海参活性肽，所述低温超微粉碎耦合真空干燥是低温超微粉碎机工作温度-20℃，超微粉碎机腔体真空度为70Pa。
实施例3
一种低分量海参活性肽的提取方法，其经过以下工艺步骤：
a. 原料处理：选取海参，将海参粉碎成条状；
b. 原料脱色：将条状海参进行超临界萃取技术脱色处理，超临界脱色条件为：乙醇做携带剂用量为60ml/500g海参原料，压力25MPa，温度50℃，二氧化碳流速15kg/h；
c. 酶解：将配制的水解酶溶液与脱色的海参进行混合，并在一定酶解条件下酶解；其中，所述的水解酶包括碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；酶解条件为：调整pH值至9，按照酶与海参的重量比为1：150添加碱性蛋白酶，在62℃条件下酶解4小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，然后调pH值至6.0； 然后按酶与混合溶液的重量比1：45添加复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，在58℃条件下酶解3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，最后将酶与混合溶液的重量比为1：60添加木瓜蛋白酶，在55℃条件下酶解3小时，将酶解后的反应溶液在105℃水浴中灭酶15分钟，所述复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶，按质量分数复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1: 3:2；
d. 多肽分子分级分离和纯化：采用切向流超滤并进行多肽分子分级分离和纯化，分别截留平均分子质量为10000u、3000u和1000u的膜；
e. 干燥：采用低温超微粉碎耦合真空干燥制备成低分量海参活性肽，其中，低温超微粉碎耦合真空干燥是低温超微粉碎机工作温度-15℃，超微粉碎机腔体真空度为90Pa。
对比例1
在本对比例中，其提取方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤b不进行超临界二氧化碳脱色处理。
对比例2
在本对比例中，其提取方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤c不进行碱性蛋白酶酶解处理。
对比例3
在本对比例中，其提取方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤c不进行复合蛋白酶酶解处理。
对比例4
在本对比例中，其提取方法和实施例1基本相同，其区别在于：步骤c不进行木瓜蛋白酶酶解处理。
检测酶解产物中多肽含量，酶解液中多肽含量的测定参照文献（鲁伟,任国谱,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J]. 食品科学,2005,26 (7):169-171）进行计算；多肽的得率按下式计算：
多肽得率（%）=（酶解后测得多肽含量-酶解前多肽含量）/总蛋白含量
将上述实施例和对比例提取的多肽以多肽含量和多肽的率为指标进行效果比较，结果见表1所示。
表1 不同实施例和对比例提取的多肽含量和多肽得率
由表1可知，通过本发明处理的海参，肽得率高，且小分子活性肽含量、集中度比较高，90%在3000Da以下，其中以分子量小于 1000Da 的小肽为主。由对比例不难发现，超临界技术脱色、分步酶解对海参肽的分子量影响较大，各种酶分步酶解协同效果显著。本发明可以快速的对海参活性肽进行提取，提取的海参活性肽纯度高，提取耗时较短，制作方法简单。