阅读说明：本技术 交联的蛋白质泡沫及其使用多用途细胞支架的方法 (Cross-linked protein foams and methods of using the same ) 是由 I·阿塔 S·Y·S·哲利 于 2018-10-04 设计创作，主要内容包括：在一个实施例中,本发明提供了组合物,其中所述组合物是多孔支架,其中所述支架的孔为1至500微米,所述组合物包含：a)选自胶原和明胶的可交联蛋白质；b)诱导可交联蛋白质交联的交联剂；和c)液体。(In one embodiment, the present invention provides a composition, wherein the composition is a porous scaffold, wherein the pores of the scaffold are from 1 to 500 microns, the composition comprising: a) a cross-linkable protein selected from the group consisting of collagen and gelatin; b) a cross-linking agent that induces cross-linking of the cross-linkable protein; and c) a liquid.)

交联的蛋白质泡沫及其使用多用途细胞支架的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年10月4日提交的美国临时专利申请号62/567,919的优先权，其全部内容以引用的方式整体并入。

技术领域

本发明涉及改善的交联组合物，其包含可交联蛋白质和诱导可交联蛋白质交联的无毒材料。该组合物预期用于触发组织再生的生物过程。

背景技术

可以原位形成凝胶的生物材料可用于各种应用，例如，用于控制细胞和/或药物递送的可注射基质、用于组织工程的可注射支架、或者在生理环境中粘结组织或密封气体或液体泄漏的粘合剂。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供了组合物

其中所述组合物是多孔支架，

其中所述支架的孔为1至500微米，所述组合物包含：

a)选自胶原和明胶的可交联蛋白质；

b)诱导可交联蛋白质交联的交联剂；和

c)液体。

在一个实施例中，液体是生理缓冲液。

在一个实施例中，组合物是泡沫。

在一个实施例中，可交联蛋白质作为平均粒度为5至200微米的微粉化的蛋白质粉末引入组合物内。

在一个实施例中，可交联蛋白质包含200至300布卢姆(bloom)的明胶。

在一个实施例中，可交联明胶以0.5％w/w至25％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，交联剂是转谷氨酰胺酶。

在一个实施例中，转谷氨酰胺酶以0.0001％w/w至2％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，本发明提供了组合物，其包含：

a)可交联明胶；

b)诱导可交联明胶交联的转谷氨酰胺酶；和

c)液体，

其中所述组合物是孔径为1至500微米的多孔支架，

其中所述可交联明胶作为粒度为5至200微米的微粉化的明胶粉末引入组合物内，

其中所述可交联明胶为200至300布卢姆，

其中所述可交联明胶以0.5％w/w至30％w/w的范围存在于组合物中，并且

其中所述转谷氨酰胺酶以0.0001％w/w至2％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，液体是生理缓冲液。

在一个实施例中，组合物在患者需要治疗组织缺损的部位处在患者中原位形成。

在一个实施例中，在将组合物在患者需要治疗组织缺损的部位处引入患者内之前，形成所述组合物。

在一个实施例中，本发明提供了方法，其中所述方法治疗有此需要的患者中的组织缺损或疾病，其包括：

a)以足以治疗组织缺损或疾病的量，将组合物引入患者内的组织缺损的部位处；

其中所述组合物在缺损部位处附着至组织。

在一个实施例中，本发明提供了方法，其中所述方法治疗有此需要的患者中的组织缺损或疾病，其包括：

a)以足以治疗组织缺损或疾病的量，在患者中的组织缺损的部位处形成组合物；

其中所述组合物在缺损部位处附着至组织。

在一个实施例中，组织缺损是伤口。

在一个实施例中，组织是受损的并且需要再生。

在一个实施例中，组织缺损是骨缺损。

在一个实施例中，组合物在患者中诱导骨的再生。

在一个实施例中，至少一种细胞类型浸润到组合物内并在其中生长。

在一个实施例中，至少一种细胞类型是选自以下的细胞类型：胰腺干细胞、肠内分泌细胞、骨细胞、肝细胞、肌腱细胞、肌细胞、血细胞、软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胚胎干细胞、间充质干细胞、自体骨髓衍生的间充质干细胞、祖细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、骨系统干细胞、软骨细胞系干细胞、上皮干细胞和肝干细胞。

在一个实施例中，本发明提供了方法，其中所述方法刺激成纤维细胞在患者中产生新的胶原，其包括：

a)以足以诱导成纤维细胞刺激的量，在患者中形成组合物，

b)其中所述组合物被配置为促进成纤维细胞刺激和胶原合成，其中所述成纤维细胞附着和胶原合成诱导组织(皮肤)再生，和

c)其中所述组合物是多孔支架，

d)其中所述支架的孔为1至500微米，所述组合物包含：

i.选自胶原和明胶的可交联蛋白质；

ii.诱导可交联蛋白质交联的交联剂；和

iii.液体。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以3％w/w至30％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以8％w/w至25％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以8％w/w至20％w/w的范围存在于组合物中。

附图说明

图1是显示了根据本发明的一些实施例的微粉化蛋白质的粒度分布的图。

图2是根据本发明的一些实施例，用于形成本发明的组合物的装置的照片。

图3A是显示了根据本发明的一些实施例，在经处理的组织中的细胞的照片。

图3B是显示了根据本发明的一些实施例，在未处理的组织中的细胞的照片。

图4是显示了根据本发明的一些实施例，在支架组合物中接种的细胞的照片。

图5是根据本发明的一些实施例的胶原沉积分析的照片。

图6A-6E是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

图7A-D是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

图8是根据本发明的一些实施例的组合物的显微照片。

图9是根据本发明的一些实施例的喷射研磨设备的照片。

图10显示了根据本发明的一些实施例，在支架组合物中接种的细胞的生存力。

图11A和11B是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

图12是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

图13A-D是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

图14是根据本发明的一些实施例，本发明的组合物的照片。

具体实施方式

为了公开内容的清楚且并非限制，本发明的详细描述分为下述小节，其描述或示出了本发明的某些特点、实施例或应用。

在说明书和权利要求自始至终，下述术语采取本文明确关联的含义，除非上下文另有明确说明。如本文使用的，短语“在一个实施例中”和“在一些实施例中”不一定指相同的实施例，尽管它可以是这样。此外，如本文使用的，短语“在另一个实施例中”和“在一些其它实施例中”不一定指不同的实施例，尽管它可以是这样。因此，如下所述，本发明的各种实施例可以容易地组合，而不脱离本发明的范围或精神。

另外，如本文使用的，术语“或”是包括性的“或”运算符，并且等价于术语“和/或”，除非上下文另有明确说明。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的另外因素，除非上下文另有明确说明。另外，在说明书自始至终，“一个”、“一种”和“该/所述”的含义包括复数所指物。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。

如本文使用的，“明胶”通过动物组织或从动物组织获得的胶原的部分水解而获得，其中所述动物组织选自动物皮肤、结缔组织、鹿角、角、骨、鱼鳞，以及使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统(作为非限制性例子，包括烟草)、或任何类型的细胞培养物或其任何组合产生的重组明胶。

如本文使用的，“布卢姆”定义为将直径二分之一英寸的柱塞压入含有6％固体的明胶溶液内4mm所需的以克计的重量，所述明胶溶液在10DC下胶凝17小时。

如本文使用的，“载体”指在交联反应之前或期间，共价或非共价地结合交联酶的聚合物、蛋白质、多糖或任何其它组成成分。

如本文使用的，“共聚物”指基质的组成成分，其可以参与交联反应，并且通常不是基质的主要组成成分。共聚物通常不与酶或基质材料例如基质的蛋白质碱基共价结合。共聚物的非限制性例子是多糖例如右旋糖酐，和/或纤维素类聚合物例如羧甲基纤维素。

如本文使用的，“交联酶”指至少一种酶(例如但不限于，1种酶，2种酶，3种酶，4种酶、5种酶等)，其可以直接(例如但不限于，转谷氨酰胺化)或间接地(例如但不限于，醌或自由基形成)交联聚合物股上的底物基团，以形成基质例如但不限于水凝胶。

如本文使用的，“扩散”或“迁移率”指例如但不限于在溶液中的酶和/或其它分子(例如但不限于任何蛋白质、氢、或基质)的随机分子运动，其可以起因于布朗运动。

如本文定义的，“扩散系数”或“扩散率”指定量关于单一类型的分子在特定条件下的扩散程度的术语。具体地，扩散系数或扩散率是比例关系，即由于分子扩散的摩尔通量与种类浓度中的梯度(或用于扩散的驱动力)之间的常数。通过测量酶从水凝胶中的洗脱来进行测量方法，即被水凝胶洗脱的酶的速率和/或总量。

如本文定义的，“流体力学体积”指通常可以使用尺寸排阻色谱测量的蛋白质或酶的分子量。组成成分的流体力学体积指当组成成分以液体形式运动时，它采取的直径和/或体积。

如本文定义的，“基质”指交联材料的组合物。通常，当基质形成材料交联时，包括这些材料的组合物从液态转变为凝胶态，从而形成“凝胶”、“水凝胶”或“胶凝组合物”。

如本文使用的，“分子量”，缩写为“MW”，指以蛋白质或聚合物的道尔顿或千道尔顿计的绝对重量。例如，PEG化蛋白质(例如但不限于，一个或多个PEG(聚乙二醇)分子已与其偶联的蛋白质)的MW是其所有组成成分的MW总和。

如本文使用的，“患者”指需要根据本发明的方法的治疗的任何动物或人。

如本文定义的，“感知体积”或“有效体积”指交联基质内部的交联酶的有效流体力学体积。在交联反应之前或在交联反应期间，可以通过酶与另一种分子、载体、聚合物、蛋白质、多糖和其它的共价或非共价结合来增加感知体积。

如本文使用的，“聚合物”指含有可重复单元的天然、合成或半合成分子。

如本文定义的，“减少的迁移率”指在溶液中或在水凝胶内部蛋白质或酶的较慢的分子运动或较小的扩散系数，并且可以通过洗脱速率来测量。

如本文定义的，“大小”指分子的分子量或流体动力学体积或感知体积。

如本文定义的，“研磨”指通过下述方法中的任一种来碾磨材料：喷射研磨、旋转/涡旋研磨、球磨、高压均质化和微流化、喷雾干燥、重结晶、乳剂-溶剂提取和使用超临界流体的方法例如超临界溶液快速膨胀(RESS)。

“喷射研磨”指通过旋转或涡旋研磨的微粉化方法。

可交联蛋白质

根据关于所述方法和/或基质的至少一些实施例，至少一种底物聚合物包含选自以下的底物聚合物：天然的可交联聚合物、可通过酶交联的部分变性的聚合物、以及包含可通过未修饰或修饰的酶交联的官能团或肽的聚合物。任选地，至少一种底物聚合物包含明胶、胶原、酪蛋白或白蛋白、或修饰的聚合物，并且其中所述修饰的酶分子包含转谷氨酰胺酶和/或氧化酶、修饰的转谷氨酰胺酶和/或修饰的氧化酶。任选地，至少一种底物聚合物包含选自通过动物组织或从动物组织获得的胶原的部分水解而获得的明胶的明胶，其中所述动物组织选自动物皮肤、结缔组织、鹿角、角、骨、鱼鳞，以及使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统、或任何类型的细胞培养物或其任何组合产生的重组明胶。任选地，明胶具有哺乳动物或鱼类起源。任选地，明胶是A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。任选地，明胶为250-300布卢姆。在一些实施例中，明胶具有75-150kda的平均分子量。

在一些实施例中，具有一个或多个合适的官能团的合成或部分合成的聚合物也可以充当关于本文所述的任何酶的可交联底物。在本发明的另一个实施例中，使用酶的组合。在本发明的另一个实施例中，使用交联剂的组合，而不必只是酶。

在一些实施例中，可交联聚合物包含至少一个RGD(Arg-Gly-Asp)基序。在一些实施例中，至少一个RGD基序促进细胞附着至本发明的组合物。

在一些实施例中，可交联聚合物包含不均匀分布的RGD基序，其可以充当用于细胞的支架，而不依赖于细胞类型或运动状态，使其成为多用途细胞支架。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的可交联聚合物。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的非重组的可交联多肽。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的明胶。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的非重组明胶。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的微粉化明胶。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的多孔支架，例如明胶泡沫。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的交联多孔支架，例如具有至少3％w/w明胶的明胶泡沫。

因此，本发明提供了通过RGD基序的多用途展示，具有改善的细胞附着和运动相容性的交联多孔支架，例如具有105-25％w/w明胶的明胶泡沫。

因此，本发明提供了伴随纤维蛋白添加的任何所述组合物。

如本文定义的，“聚合物股”或“聚合物链”指用于酶交联的底物聚合物，根据本发明的至少一些实施例，其属于以下类别之一(仅作为非限制性例子)：

1)具有底物基团的任何聚合物，所述底物基团天然地可通过酶交联，并且本身天然地可通过酶交联。例如，在转谷氨酰胺酶的情况下，这包括天然地可通过酶交联的蛋白质或多肽，例如明胶、胶原和酪蛋白。

2)含有可通过酶交联，但由于其结构而无法天然地通过酶交联的底物基团的聚合物。在这种情况下，必须在酶交联之前修饰聚合物结构。例如，在转谷氨酰胺酶的情况下，这包括蛋白质例如白蛋白或乳球蛋白，其不是酶的天然底物，因为它们具有阻碍酶进入的球状结构。通过使用还原剂、变性剂或加热，使蛋白质部分变性，可以将这些制备成底物。

3)天然或合成的聚合物，其不是用于酶交联的底物，但已用其为酶底物的肽或官能团进行修饰，因此致使修饰的聚合物可通过酶交联。此类聚合物的非限制性例子包括任何合适类型的蛋白质，其可以例如包含如上所述的明胶。明胶可以包括任何类型的明胶，其包含本领域已知的蛋白质，包括但不限于通过动物组织或从动物组织获得的胶原的部分水解而获得的明胶，所述动物组织包括但不限于动物皮肤、结缔组织(包括但不限于韧带、软骨等等)、鹿角或角等等、和/或骨、和/或鱼鳞和/或骨或其它组分；和/或使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统、或任何类型的细胞培养物或其任何组合产生的重组明胶。

根据本发明的一些实施例，来自动物起源的明胶可以包括来自哺乳动物起源的明胶，例如但不限于猪皮、猪骨和牛骨，或分割的牛皮，或任何其它猪或牛来源，或其任何组合中的一种或多种。在一些实施例中，明胶可以包括猪明胶，因为它具有较低的过敏反应率。来自动物起源的明胶可以任选地为A型(酸处理的)或B型(碱处理的)，尽管它可以为A型。

在一些实施例中，来自动物起源的明胶包含在第一提取期间获得的明胶，所述第一提取一般在较低的温度(50-60℃，尽管这个确切的温度范围不一定是限制)下执行。以这种方式产生的明胶在250-300布卢姆的范围内，并且具有至少约95-100kDa的高分子量。在一些实施例中，使用275-300布卢姆的明胶。此类明胶的生产者的非限制性例子是PBGelatins(Tessenderlo Group，比利时)。

根据本发明的一些实施例，来自动物起源的明胶可以包括来自鱼类的明胶。在一些实施例中，可以使用任何类型的鱼，例如冷水品种的鱼，例如鲤鱼、鳕鱼、或犬鱼或金枪鱼。在一些实施例中，鱼明胶的pH(在10％w/w溶液中测量的)范围可以为pH 4至pH 6。

在一些实施例中，冷水鱼明胶在10℃下在水中形成溶液。在一些实施例中，冷水鱼明胶为0布卢姆。在一些实施例中，可以使用高分子量冷水鱼明胶，其包括至少约95-115kDa的平均分子量(其中冷水鱼明胶与250-300布卢姆动物明胶的分子量可比较)。在一些实施例中，由于脯氨酸和羟脯氨酸的量减少，冷水鱼明胶在比动物明胶更低的温度下经历热可逆凝胶化。此类明胶的生产者的非限制性例子是Norland Products(Cranbury,NJ)。

在本发明的一些实施例中，低内毒素活性(endotoxicity)明胶用于形成明胶基质组合物的明胶溶液组分。在一些实施例中，低内毒素活性明胶从供应商如Gelita^TM(Eberbach，德国)商购可得。如本文使用的，低内毒素活性明胶定义为具有小于1000内毒素活性单位(EU)/克的明胶。在一些实施例中，使用内毒素活性小于500EU/克的明胶。

在一些实施例中，当生成与脊柱或大脑接触的材料时，使用内毒素活性小于100EU/克(例如，在1-100EU/克之间)的明胶。在一些实施例中，使用具有小于50EU/g的明胶。在一些实施例中，可以使用内毒素活性小于10EU/g的明胶。

根据本发明的一些实施例，I型、II型或任何其它类型的水解或非水解胶原替换明胶，因为该蛋白质物质是交联的。各种类型的胶原已证实形成热稳定的mTG交联凝胶的能力。例如，如出版物“Characterization of a microbial transglutaminase cross-linked type II collagen scaffold”；PMID:16846344中报告的。

根据本发明的一些实施例，使用了重组人明胶。在一些实施例中，重组人明胶从供应商如Fibrogen^TM(San Francisco,CA)商购可得。在一些实施例中，重组人明胶从供应商如Collplant Ltd.(Rehovot，以色列)商购可得。在一些实施例中，重组明胶可以是至少约90％纯的(例如90.01-100％)。在一些实施例中，重组明胶可以是至少约95％纯的(例如95.01-100％)。在一些实施例中，重组明胶在10℃下可以是非胶凝的，且因此被视为0布卢姆。对于本发明的一些实施例，可以使用高分子量重组明胶，例如但不限于包括至少约95-100kDa的分子量。

在一些实施例中，可交联蛋白质可以包含明胶，但也可以另外或可替代地包含另一种类型的蛋白质。根据本发明的一些实施例，蛋白质也是转谷氨酰胺酶的底物。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶的底物可以包括胶原、或独立地具有形成生物粘合剂的特性的其它合成的聚合物序列、或已用转谷氨酰胺酶特异性底物修饰的聚合物，所述底物增加了材料通过谷氨酰胺转移酶交联的能力。该组合物还可以包括纤维蛋白。

在示例性的实施例中，具有用于交联的适当转谷氨酰胺酶靶的合成多肽和聚合物序列可以具有约20至约40℃的转变点。在一些实施例中，物理特征包括但不限于结合组织的能力和形成纤维的能力。此类肽的非限制性例子描述于美国专利号5,428,014和5,939,385中，所述美国专利在此以引用的方式并入，如同在本文中完全阐述一样，其描述了生物相容性、生物粘附性、转谷氨酰胺酶可交联的多肽，其中所述转谷氨酰胺酶催化蛋白结合的谷氨酰胺酰基残基的γ-甲酰胺基和Lys残基的ε-氨基之间的酰基转移反应，导致8-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键的形成。

在一些实施例中，本发明的化合物是基本上干燥的明胶，其被配置为用温或冷液体(例如但不限于，在4℃至37℃之间的液体)快速水合，以形成多孔支架、凝胶或泡沫，其中所述多孔支架、凝胶或泡沫还被配置为成型并模制成任何腔、离体或体内、体腔、伤口上、器官上或其任何组合。在一些实施例中，在非交联明胶和交联剂水合/重构之后，使非交联明胶与交联剂反应/混合，其中所述非交联明胶和交联剂的混合导致形成稳定的、不可溶的、非热可逆的凝胶、泡沫或多孔支架。

如本文使用的，粒度对溶解度常数的作用可以如下进行定量：

其中*K_A是关于摩尔表面积为A的溶质颗粒的溶解度常数，*K_A→0是关于摩尔表面积趋于零(即，当颗粒很大时)的物质的溶解度常数，γ是溶质颗粒在溶剂中的表面张力，Am是溶质的摩尔表面积(以m²/mol计)，R是普适气体常数，且T是绝对温度。

用于制备药物和蛋白质的微米级颗粒的典型技术是先前形成的较大颗粒的机械粉碎(例如，通过压碎、碾磨和研磨)。在本发明的方法的一些实施例中，研磨通过研钵且在其它优选实施例中在喷射研磨中实现。图1示出了通过在喷射研磨的微粉化后的粒度分布。

在一些实施例中，本发明的方法包括制备非交联蛋白(例如但不限于明胶)的快速溶解的干燥蛋白。在一些实施例中，通过喷射研磨制备明胶，以实现2至250微米的粒度。在一些实施例中，粒度在5至130微米之间。在一些实施例中，粒度在10至80微米之间。在一些实施例中，粒度在10至70微米之间。在一些实施例中，粒度在10至60微米之间。在一些实施例中，粒度在10至50微米之间。在一些实施例中，粒度在10至40微米之间。在一些实施例中，粒度在10至30微米之间。在一些实施例中，粒度在10至20微米之间。在一些实施例中，粒度在2至10微米之间。在一些实施例中，粒度在10至100微米之间。在一些实施例中，粒度在20至100微米之间。在一些实施例中，粒度在30至100微米之间。在一些实施例中，粒度在40至100微米之间。在一些实施例中，粒度在50至100微米之间。在一些实施例中，粒度在60至100微米之间。在一些实施例中，粒度在70至100微米之间。在一些实施例中，粒度在80至100微米之间。在一些实施例中，粒度在90至100微米之间。在一些实施例中，粒度在5至50微米之间。在一些实施例中，粒度在10至20微米之间。在一些实施例中，粒度在10至15微米之间。在一些实施例中，粒度在15至20微米之间。在一些实施例中，粒度在12至18微米之间。

在一些实施例中，本发明的方法包括喷射研磨，其中所述喷射研磨导致制备每个明胶颗粒(晶体)的表面，用于在液体中快速溶解(例如但不限于在0.01秒-60秒内溶解)(即，与非喷射研磨的原材料相比，所得到的喷射研磨的颗粒令人惊讶地展示增加的吸湿特征)。在一些实施例中，可以将喷射研磨的颗粒与交联剂混合，以导致热稳定的和组织粘附的水凝胶或泡沫的形成。在一些实施例中，可以将多孔支架、凝胶/泡沫置于体腔内和/或人或动物的组织层之间。在一些实施例中，本发明可以用于各种医学应用。在一些实施例中，本发明可以用作呈现整联蛋白附着位点(例如RGD基序)的改善暴露和可及性的细胞支架。

在一些实施例中，明胶通过研磨成小粒度进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有在2-200微米之间的微米尺寸分布。在一些实施例中，明胶通过研磨成小粒度进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有在2至100微米之间的微米尺寸分布。在一些实施例中，明胶通过研磨成小粒度进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有在2至50微米之间的微米尺寸分布。在一些实施例中，明胶通过研磨成小粒度进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有在50至150微米之间的微米尺寸分布。在一些实施例中，明胶通过研磨成小粒度进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有在100至150微米之间的微米尺寸分布。在一些实施例中，明胶通过喷射研磨进行制备，以导致增加的交联分布，其中所制备的明胶的特征在于具有微米尺寸分布。在一些实施例中，预交联的明胶可以(1)冻干，然后(2)喷射研磨，以产生干粉状明胶(即“高布卢姆明胶”)，其中所述干粉状明胶可以在等于或小于120秒的时间段内(例如，在0.01秒-120秒之间)，在例如但不限于5℃-37℃之间的温度下溶解在溶液中，以生成溶液。

在一个实施例中，研磨设备和方法如美国专利号5,855,326中公开的，所述美国专利在此以引用的方式整体并入。在另一个实施例中，研磨设备如美国专利号6,789,756中公开的，所述美国专利在此以引用的方式整体并入。此类研磨设备的一个例子是由SuperFineLtd.of Yokneam，以色列制造的SuperFine Vortex Mill^TM(在图9中示意性地示出)。其全部内容以引用的方式并入、给予Beliaysky的美国专利号5,855,326公开了用于颗粒状固体材料的精细粉碎的旋转研磨腔室，该腔室在具有基本上圆柱形形状的壳体中形成，所述壳体具有两个端面和侧壁，所述侧壁提供有一个或多个切向喷嘴，用于将工作流体注入腔室内并在其中产生涡旋，所述腔室包括用于将待粉碎的颗粒状固体材料引入其内的手段、在一个或两个所述端面中提供的轴向布置的排放通道、以及以一个或多个机械元件形式的控制手段，所述机械元件适于在产生涡旋时相互作用，其各层靠近腔室的内壁移动，从而允许控制粉碎。旋转腔室的操作在使用的专利和给予Beliaysky的美国专利号6,789,756中例示，所述美国专利的全部内容也以引用的方式并入，公开了用于研磨基本上颗粒状固体材料的改善的涡旋磨机，其包括一个或多个工作腔室。该磨机还包括一个或多个工作流体入口和一个或多个排放口。一个或多个工作流体入口连同一个或多个排放口一起，促进了一个或多个工作腔室内的涡流。还存在一个或多个进料入口以提供固体材料的研磨，所述固体材料从一个或多个排放口排出。另外，存在用于在一个或多个工作腔室中诱导工作流体的流动中的受控扰动的设备，从而改善涡流中的固体材料的研磨。

在一些实施例中，本发明的方法可以包括使用等离子体束能量用于增加明胶颗粒的表面吸湿性，其中用等离子体束能量处理的所得到的微粉化明胶具有与非等离子束处理的明胶基本上相同的特征/特性。在一些实施例中，可以用等离子束能量处理用于与明胶混合的另外物质/化合物，例如但不限于微生物转谷氨酰胺酶、骨增强物质、蛋白质和待混合到最终产物内的共聚物、或其任何组合。

在一些实施例中，本发明的组合物的特征可以在于，当与液体混合0.01至120秒的时间段时，吸湿性颗粒状明胶粉末被配置为溶解成可流动的凝胶或泡沫。在一些实施例中，液体可以作为产品制剂(即，试剂盒)的一部分提供，在混合之前，由医学从业者(例如，护士、医师、医师的助手等)现场装载到注射器内。在一些实施例中，单独或连同交联剂混合在一起的干明胶、或连同外科网一起的明胶和交联剂两者可以直接施加于机体，并且通过施加流体(即盐水)激活、或当与潮湿组织接触时通过体液(即，对于机体内源性的液体)激活。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在4至40℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在4至20℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在4至15℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在10至25℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在25至37℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在15至25℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在20至25℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在10至20℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在12至18℃之间的温度下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在14至19℃之间的温度(其为手术室的温度范围)下水合。在一些实施例中，研磨的明胶粉末可以在约16℃的温度下水合。在一些实施例中，本发明的溶解明胶被配置为即使在低于37℃的温度下，也维持可流动的形式(即，溶解明胶并不立即越过其液体-凝胶转变点，而变回为不能工作的固体)。

在一些实施例中，本发明的溶解明胶可以通过长针、导管或内窥镜递送。在一些实施例中，当发泡时，本发明的溶解明胶具有小于相同组成的汇合的明胶水凝胶的粘度。

在一些实施例中，本发明的方法包括使用辐射能制备/灭菌明胶，其中与未辐射的起始明胶相比，所得到的辐射明胶具有基本上相似的功能特性(例如，交联能力)。

在一些实施例中，本发明的方法包括使用辐射能制备/灭菌明胶，其中与未辐射的起始明胶相比，所得到的辐射明胶具有至少25％的功能特性(例如，交联能力)。在一些实施例中，本发明的方法包括使用辐射能制备/灭菌明胶，其中与未辐射的起始明胶相比，所得到的辐射明胶具有25％至100％的功能特性(例如，被交联的能力)。

在一些实施例中，本发明的方法包括将明胶粉末与另外的活性组分混合，所述另外的活性组分例如但不限于稳定剂(例如但不限于：EDC(1-乙基-3-(3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、碳酰胺、戊二醛、辣根过氧化物酶和/或转谷氨酰胺酶)，其中混合的明胶和稳定剂形成稳定的多孔支架、凝胶或泡沫，其中所述多孔支架、凝胶或泡沫的形状是不可逆的(即，由于明胶分子之间的共价键合交联)。在一些实施例中，明胶多孔支架、凝胶或泡沫的交联(即稳定化)可以在人或动物的身体外部或内部发生。

在一些实施例中，本发明的方法包括使聚合物例如蛋白质和/或多肽干燥，其中所述蛋白质和/或多肽是胶原和/或明胶和/或任何明胶变体，以便导致与典型的非粉状明胶相比，包括在冷或室温液体(例如但不限于，5℃至37℃之间的液体)的环境中，在液体中具有基本上更快速(例如但不限于，0.01秒至60秒重构)的重构概况的干燥聚合物。在一些非限制性的示例性实施例中，明胶粉末可以表征为具有(1)基本上更长的贮存期限(例如，在1个月至36个月之间)，以及(2)基本上更快速的重构/溶解度。在一些实施例中，将干燥聚合物灭菌，并且与基本上相似的未灭菌的干燥聚合物相比，灭菌的干燥聚合物显示出基本上相似的生物学功能和溶解/重构特征。在一些实施例中，将干燥聚合物灭菌，并且与基本上相似的未灭菌的干燥聚合物相比，灭菌的干燥聚合物显示出至少25％的生物学功能和溶解/重构特征。在一些实施例中，将干燥聚合物灭菌，并且与基本上相似的未灭菌的干燥聚合物相比，灭菌的干燥聚合物显示出50％至100％的生物学功能和溶解/重构特征。

交联剂

在示例性实施例中，直接交联聚合物股上的底物基团的直接交联酶的非限制性例子包括转谷氨酰胺酶和氧化酶。转谷氨酰胺酶的例子包括微生物转谷氨酰胺酶(mTG)、组织转谷氨酰胺酶(tTG)、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶和因子XIII。在一些实施例中，这些酶可以来自天然或重组来源。在一些实施例中，聚合物股中的谷氨酰胺和赖氨酸氨基酸是用于转谷氨酰胺酶交联的底物。

在示例性实施例中，氧化酶的非限制性例子是酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶或其任何组合。在一些实施例中，氧化酶通过醌形成(酪氨酸酶)或自由基形成(漆酶、过氧化物酶)交联聚合物。然后，醌和自由基彼此相互作用或者与其它氨基酸或酚酸相互作用，以使聚合物交联。在一些实施例中，用于氧化酶的可交联底物可以是含有酪氨酸或其它芳香族氨基酸的任何蛋白质。在一些实施例中，底物可以是碳水化合物，其含有酚酸，例如但不限于阿魏酸。在一些实施例中，碳水化合物可以是但不限于阿拉伯木聚糖或果胶。

根据本发明的方法的一些实施例，转谷氨酰胺酶溶液经历一级或多级纯化，以执行以下中的一种或多种：1)从转谷氨酰胺酶混合物中去除发酵残渣；2)在转谷氨酰胺酶溶液中浓缩一定量的活性转谷氨酰胺酶；3)从载体蛋白和/或碳水化合物中纯化转谷氨酰胺酶溶液；4)降低转谷氨酰胺酶溶液的内毒素水平；5)从转谷氨酰胺酶溶液中去除所有微生物，将溶液有效灭菌；所有这些都不希望限于封闭列表或其任何组合。

根据本发明的一些实施例，转谷氨酰胺酶可以是重组转谷氨酰胺酶。此类的非限制性例子是在大肠杆菌(E-coli)细菌中表达的酶。

在一些实施例中，在与可交联蛋白质或多肽混合之前，过滤交联材料的溶液。在一些实施例中，过滤过程首先使用粗过滤，有时称为澄清，以去除大块的发酵残渣，其将迅速堵塞较细的过滤步骤。此类粗过滤的非限制性例子是约0.45μm孔径过滤和约0.65μm孔径过滤。在一些实施例中，可以使交联材料的溶液通过孔径小于0.22μm的过滤器，例如以将材料的生物负荷量减少至低于10个菌落形成单位(CFU)/克，并且使其适合于医疗用途。在一些实施例中，减少生物负荷量以达到小于约10-2的灭菌保证水平(SAL)。在一些实施例中，减少生物负荷量以达到小于约10-3的灭菌保证水平(SAL)，其中SAL是微生物学中用于描述单个单元在已经受灭菌过程后为无菌的可能性的术语。

根据本发明的方法的另一个实施例，使用切向流和/或中空纤维超滤技术，以通过去除载体碳水化合物和蛋白质来纯化交联材料的溶液，并且使溶液浓缩。用于与本发明一起使用的孔径是其孔径小于交联组合物的组分大小的那些。在一些实施例中，交联材料是mTG，并且孔径在10-50kDa的范围内。在一个实施例中，交联材料是mTG，并且孔径在10-30kDa的范围内。在一些实施例中，此类的非限制性商业例子是Uniflux(GE)、AKTA Pilot(GE)或AKTA Flux 6(GE)。

在一些实施例中，一个或多个尺寸排阻色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围物质分开(例如但不限于，苯基琼脂糖FF柱(2.6*10cm，Pharmacia Biotech)或例如Sephacryl柱(GE))。在一些实施例中，一个或多个疏水和/或亲水相互作用色谱步骤用于选择性地将交联材料与周围物质分开。在一些实施例中，交联材料是蛋白质，并且一个或多个离子交换色谱步骤用于结合交联蛋白，从周围材料中纯化它。

在一些实施例中，交联蛋白是mTG，并且一个或多个阳离子交换色谱步骤用于纯化mTG。在一些实施例中，阳离子交换树脂是琼脂糖树脂。

在一些实施例中，纯化将交联材料的内毒素水平减少至小于5个内毒素单位(EU)/克。在一些实施例中，纯化将交联材料的内毒素水平减少至0.001至5个内毒素单位(EU)/克。

在一些实施例中，交联剂是mTG，并且纯化导致其中比活性大于20酶单位/毫克和大于25单位/毫克的mTG组合物。在一些实施例中，交联材料是mTG，并且纯化导致其中比活性为10酶单位/毫克至35单位/毫克的mTG组合物。在一些实施例中，交联材料是mTG，并且纯化导致95％至99.9％的电泳纯度。

在一些实施例中，作为非限制性例子，本文描述了mTG纯化方法，其纯化食品级mTG产物，以产生mTG组合物，其具有大于24个酶单位/毫克的比活性、大于95％的电泳纯度、小于5个内毒素单位/克和小于10CFU/g。作为非限制性例子，本文描述了mTG纯化方法，其纯化食品级mTG产物，以产生mTG组合物，其具有25-35酶单位/毫克的比活性、95-99.9％的电泳纯度、0.001至5个内毒素单位/克、0.001<10CFU/g或其任何组合。在一些实施例中，随后将所述规格的纯化酶连同或不连同另外的碳水化合物或稳定剂一起冻干，并且随后经受通过γ辐射或电子束辐射的终末灭菌。在一些实施例中，所述终末灭菌后的比活性为5-30个酶单位/毫克。在一些实施例中，所述终末灭菌后的比活性为20-30个酶单位/毫克。在一些实施例中，所述终末灭菌后的比活性为20-25个酶单位/毫克。

在一些实施例中，作为非限制性例子，mTG纯化方法描述于出版物“Purificationand Characterization of Novel Transglutaminase from Bacillus subtilisSpores”；PMID:11193401中。

在一些实施例中，在纯化后，可以将mTG干燥或冷冻干燥，然后以类似于本文所述那种的方法，通过(任何类型的)研磨微粉化成5至50微米的吸湿性颗粒。在一些实施例中，在纯化后，可以将mTG与作为稳定水胶体的纤维素醚(HPMC)或海藻糖混合。

在一些实施例中，可以将转谷氨酰胺酶与麦芽糊精混合。在一些实施例中，麦芽糊精是稳定剂。

在一些实施例中，富集和/或纯化的酶可以通过以下得到稳定：添加包括mTG和稳定赋形剂的微粒，并且还包含添加剂材料，例如可以在辐射过程中有助于稳定的稳定剂(例如但不限于，纤维素、糖、麦芽糊精、类胡萝卜素、抗坏血酸、L-酪氨酸)。在一些实施例中，稳定赋形剂是多元醇、甘露醇、蔗糖、甘油、乳糖、甘氨酸或海藻糖。

在一些实施例中，修饰的转谷氨酰胺酶包含修饰的微生物转谷氨酰胺酶。在一些实施例中，修饰聚合物，以允许通过修饰的微生物转谷氨酰胺酶交联。在一些实施例中，修饰的氧化酶包含酪氨酸酶、漆酶、过氧化物酶或其任何组合中的一种或多种。在一些实施例中，基质还包含作为至少一种底物聚合物的碳水化合物，所述碳水化合物包含酚酸，用于通过修饰的氧化酶交联。在一些实施例中，碳水化合物包含阿拉伯木聚糖或果胶中的一种或多种。在一些实施例中，通过PEG化修饰酶分子，并且其中所述PEG化通过从接受基质的宿主动物的免疫系统掩蔽酶分子，来提供免疫原性掩蔽。在一些实施例中，宿主动物是人。

根据本发明的一些实施例的组合物

在一些实施例中，本发明提供了组合物

其中所述组合物是多孔支架，

其中所述支架的孔为1至500微米，所述组合物包含：

a)选自胶原和明胶的可交联蛋白质；

b)诱导可交联蛋白质交联的交联剂；和

c)液体。

如本文使用的，术语“支架”指已进行改造，以引起期望的细胞相互作用，以促成用于医学目的的新功能组织的形成。细胞可以被‘接种’到能够支持三维组织形成的这些结构内。支架可以模拟天然组织的天然细胞外基质，重演体内环境并且允许细胞影响其自身的微环境。支架可以发挥下述目的中的至少一种：

1)允许细胞附着和迁移；

2)递送且保留细胞和生物化学因子；

3)允许极其重要的细胞营养素和表达产物的扩散；或

4)发挥某些机械和生物学影响，以修改细胞相的行为。

在一些实施例中，液体是生理缓冲液。

在一些实施例中，组合物是泡沫。

在一些实施例中，可交联蛋白质作为平均粒度为5至200微米的微粉化的蛋白质粉末引入组合物内。

在一些实施例中，可交联蛋白质包含200至300布卢姆的明胶。

在一些实施例中，可交联明胶以0.5％w/w至25％w/w的范围存在于组合物中。

在一些实施例中，交联剂是转谷氨酰胺酶。

在一些实施例中，转谷氨酰胺酶以0.0001％w/w至2％w/w的范围存在于组合物中。

在一些实施例中，本发明提供了组合物，其包含：

a)可交联明胶；

b)诱导可交联明胶交联的转谷氨酰胺酶；和

c)液体，

其中所述组合物是孔径为1至500微米的多孔支架，

其中所述可交联明胶作为粒度为1至200微米的微粉化的明胶粉末引入组合物内，

其中所述可交联明胶为200至300布卢姆，

其中所述可交联明胶以0.5％w/w至25％w/w的范围存在于组合物中，和

其中所述转谷氨酰胺酶以0.0001％w/w至2％w/w的范围存在于组合物中。

在一些实施例中，液体是生理缓冲液。

在一些实施例中，组合物在患者需要治疗组织缺损的部位处在患者中原位形成。

在一些实施例中，在将组合物在患者需要治疗组织缺损的部位处引入患者内之前，形成所述组合物。

在一些实施例中，干燥的交联剂是转谷氨酰胺酶。在一些实施例中，干燥的蛋白质组合物是明胶。在一些实施例中，干颗粒状蛋白不需要稳定剂。在一些实施例中，粉末组合物在少于5分钟内溶解成可流动的溶液。在一些实施例中，粉末组合物在少于5分钟内溶解成可流动的溶液。在一些实施例中，粉末组合物在低于37℃的温度下、在少于5分钟内溶解成可流动的溶液。在一些实施例中，粉末组合物在低于27℃的温度下、在少于1分钟内溶解成可流动的溶液。在一些实施例中，粉末组合物在低于20℃的温度(其为手术室的标准温度)下、在少于1分钟内溶解成可流动的溶液。在一些实施例中，明胶组合物连同交联剂粉末一起贮存于单个区室中。在一些实施例中，将明胶粉末和交联剂与液体以至多10ml/1克明胶的比率混合。在一些实施例中，将明胶粉末和交联剂与液体以至多8ml/1克明胶的比率混合。在一些实施例中，将明胶粉末和交联剂与液体以至多6ml/1克明胶的比率混合。在一些实施例中，将明胶粉末和交联剂与液体以至多4ml/1克明胶的比率混合。在一些实施例中，将明胶粉末和交联剂与液体以至多2ml/1克明胶的比率混合。在一些实施例中，将粉末混合物压入可吸收或不可吸收的垫内，以为其提供机械背衬。在一些实施例中，垫是非织造的氧化纤维素。在一些实施例中，按压进入可降解或不可降解的外科网内。在一些实施例中，明胶组合物的浓度在0.5％-25％w/w的范围内。在一些实施例中，明胶组合物的浓度在8-20％w/w的范围内。在一些实施例中，干明胶粉末含有小于约15％的水分。在一些实施例中，干明胶粉末含有小于约8％的水分。在一些实施例中，组合物具有在约6至约7的范围内的pH。在一些实施例中，干交联剂粉末含有小于约15％的水分。在一些实施例中，干交联剂粉末含有小于约8％的水分。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶是钙不依赖性的。

在一些实施例中，转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶或重组转谷氨酰胺酶。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶的蛋白质浓度以组合物的约0.0001％至约2％w/w的量存在。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶以组合物的约0.01％至约1.35％w/w的量存在。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶的浓度在总组合物的约1至约180个酶单位(U/mL)的范围内。

在一些实施例中，如果酶和明胶在溶液中，则酶组合物与明胶组合物的比率为约1:1至1:5v/v。在一些实施例中，如果酶和明胶为固体干燥形式，则纯化的酶组合物与明胶组合物的比率为约1:100至1:500w/w。

在一些实施例中，明胶由动物起源、重组起源或其组合产生。在一些实施例中，动物起源选自鱼类和哺乳动物。在一些实施例中，明胶是A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。在一些实施例中，明胶包含至少约250布卢姆或其等价物的高分子量明胶。在一些实施例中，组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂选自聚山梨醇酯20(Tween.TM.20)、聚氧乙二醇十二烷基醚(Brij.TM.35)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic.TM.F-68)、月桂基硫酸钠(SLS)或十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂醇聚醚硫酸钠或十二烷基醚硫酸钠(SLES)、泊洛沙姆或泊洛沙胺、烷基聚葡糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺或其任何组合。在一些实施例中，组合物还包含增塑剂。在一些实施例中，增塑剂选自山梨糖醇、柠檬酸烷基酯、甘油、甘油酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、脱水山梨糖醇酯、乙酰化单甘油酯、甘油、脂肪酸酯、乙二醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、泊洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂或食用油的单甘油酯和甘油二酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇(PEG)200至20,000、碳蜡聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原胶、Plasdone.RTM.(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露醇及其任何组合。

在一些实施例中，本发明的组合物是可交联组合物，其包含研磨的冻干的明胶组合物和干燥的转谷氨酰胺酶组合物，其中所述干燥的转谷氨酰胺酶组合物充分地分散在研磨的冻干的明胶组合物各处。

在一些实施例中，本发明的组合物是可交联组合物，其包含明胶和交联剂，其中所述交联剂一旦混合就与明胶反应，以形成生物可降解的稳定的多孔支架。在一些实施例中，多孔支架在组织上保持柔性至少两周。在一些实施例中，转谷氨酰胺酶是修饰的酶分子，修饰的酶分子具有修饰，当通过聚合物的交联形成基质时，所述修饰改变交联的基质中的酶分子的感知体积。在一些实施例中，明胶具有1200I.U./g或更少的内毒素含量。在一些实施例中，明胶通过使用小于10巴的压力降进行喷射研磨。在一些实施例中，明胶通过使用小于5巴的压力降进行喷射研磨。在一些实施例中，明胶喷射研磨通过使用小于5m^A3/分钟的所需气流。在一些实施例中，明胶喷射研磨通过使用小于2m^A3/分钟的所需气流。在一些实施例中，组合物还包含钡、碘、其它不透射线的物质或其组合。

在一些实施例中，本发明的方法包括使用辐射能制备/灭菌明胶和交联剂组合物，其中与未辐射的起始组合物相比，所得到的辐射组合物具有至少25％的功能特性(例如，交联能力、酶比活性)。在一些实施例中，本发明的方法包括使用辐射能制备/灭菌明胶-交联剂组合物，其中与未辐射的起始组合物相比，所得到的辐射明胶具有25％至100％的功能特性(例如，交联能力)。

在一些实施例中，本发明的方法包括使用环氧乙烷制备/灭菌明胶和交联剂组合物，其中与未处理、未灭菌的起始明胶相比，所得到的处理组合物具有至少25％的功能特性(例如，交联能力)。在一些实施例中，本发明的方法包括使用环氧乙烷制备/灭菌组合物，其中与未处理、未灭菌的起始组合物相比，所得到的处理组合物具有25-100％的功能特性(例如，交联能力)。

在一些实施例中，本发明的组合物用于选自以下的至少一个目的：用于细胞的支架、组织重塑剂、增量剂、皮肤填充剂、骨粘合剂、组织填充剂、减少肺体积的组合物、外科密封剂、生物粘合剂、瘘修复组合物、止血剂、外科网、用于持续释放生物活性剂的组合物。

在一些实施例中，至少一种细胞类型浸润到组合物内并在其中生长。

在一些实施例中，至少一种细胞类型是选自以下的细胞类型：胰腺干细胞、肠内分泌细胞、骨细胞、肝细胞、肌腱细胞、肌细胞、血细胞、软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胚胎干细胞、间充质干细胞、自体骨髓衍生的间充质干细胞、祖细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、骨系统干细胞、软骨细胞系干细胞、上皮干细胞和肝干细胞。

在一些实施例中，组合物从患者的免疫系统中分离出浸润的至少一种细胞类型。

在一些实施例中，组合物是泡沫。不预期受任何特定的理论限制，一旦被交联(例如通过mTG)，多孔支架就可以在体内保持稳定，并且诱导组织内向生长和再生。可替代地，多孔支架可以充当用于细胞的三维支持支架。交联的多孔支架具有改善的细胞附着和运动相容性。

在一些实施例中，可交联蛋白质与交联剂混合。在一些实施例中，可交联蛋白质和交联剂是干粉，并且将干粉混合，然后通过生理液体、缓冲液或细胞支持培养基溶解。在一些实施例中，仅当可交联蛋白质和交联剂两者均溶解在生理缓冲液中时，交联剂才使蛋白质交联。

在一些实施例中，除上述组分之外，本发明的医用材料通常还包括对于细胞培养所需的培养基组分、盐(缓冲液组分)。此外，当植入时，它还可以在移植单元中含有促动再生剂(生长因子)组织。可用的生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等、角质形成细胞生长因子(KGF))、上皮细胞生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白(BMP：BMP-2、BMP-3、BMP-7等)可以作为例证。这些生长因子可以根据用于繁殖目的的组织类型通过适当选择来使用。具体地，例如，在表皮细胞再生目的的情况下以及在真皮再生目的的情况下的表皮生长因子，可以使用每种成纤维细胞生长因子。具体地，例如，在骨细胞再生目的的情况下以及在真皮再生目的的情况下的骨形态发生蛋白，可以使用每种成纤维细胞生长因子。如果当考虑到它时，它是优选的，则它可以与两种或更多种类的生长因子组合使用。

在一些实施例中，干粉可以包装在注射器或任何容器中。在一些实施例中，可以通过辐射或环氧乙烷(ETO)来灭菌干粉。

在一些实施例中，将可交联蛋白质混合，并且将交联剂与选自以下的至少一种其它试剂组合：稳定剂(例如但不限于：EDC(1-乙基-3-(3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、碳酰胺、戊二醛、辣根过氧化物酶、生长因子、治疗剂和激素。

在一些实施例中，当作为干粉混合时，干粉具有减少的浸出和/或相互作用。参考图2，在一些实施例中，将干粉分别溶解在生理缓冲液中，并且通过将溶解的组分从一个互连的注射器推到另一个进行混合。然而，任何混合方法，例如搅拌都可以满足。可替代地，将干粉混合在一起，然后将混合物溶解在生理缓冲液中用于活化。

在一些实施例中，蛋白质的交联导致多孔支架。在一些实施例中，多孔支架是热稳定的。在一些实施例中，多孔支架是粘性的。不预期受任何特定理论的限制，由于形成蛋白质分子之间的交联的共价键，交联是不可逆的。在一些实施例中，多孔支架在结构上类似于哺乳动物组织的细胞外基质，经常可以在温和条件下加工，并且可以以微创方式递送。

交联可以在患者身体的外部或内部发生。因此，在一些实施例中，交联在患者中的部位处原位发生。可替代地，多孔支架离体形成，然后引入患者内。

在一些实施例中，本发明的水凝胶在尚未固化的时候，一旦以液体形式递送到组织，就可以通过针；胶粘剂稳定成稳定和固结的物理形成物(即，至少0.05ml体积的统一的单个颗粒)。

实例4的结果指示，通过将粒度减少到低于d(0.5)＝15微米，明胶溶解良好，但与微生物转谷氨酰胺酶较慢地反应。在本发明的一些实施例中，需要提供在水合后并非快速稳定的快速溶解的粉末。它们需要通过长针，并且允许对于外科医生的足够长的工作时间。在一些实施例中，可以通过将明胶粒度控制在1-15微米之间来实现此类制剂。在一些实施例中，可以用8-14微米之间的明胶粒度来实现此类制剂。

在一些实施例中，组合物包含多孔支架，所述多孔支架配置为(1)原位或离体稳定，并且(2)符合所需形状或体腔，导致形成生物相容性密封剂或支架，其配置为允许细胞和组织的向内生长。

在一些实施例中，稳定的多孔支架结构是组织传导性的，并且可以用于下述医学用途：组织重塑剂、增量剂、组织填充剂或组织打印(例如3D组织打印)。明胶的粉化和/或重构成交联的多孔支架(特别是通过转谷氨酰胺酶)极大地改善细胞附着和运动性。明胶多孔支架上的整联蛋白识别基序(例如RGD)的不均匀和丰富展示以及细胞对此类基序的可及性，增强了其作为支架的功能。

在组织打印的实施例中，干粉可以与活细胞结合通过打印机施加，以构成通过粉末状胶或重构胶彼此粘附的细胞的精确2D或3D结构。例如，作为示例，此类3D结构可以含有用于形成血管的一些内皮细胞，其可以在支架中打印，目的是一旦支架被植入，它们就对内部细胞提供血液供应。

在一些实施例中，多孔支架具有密度，其中所述密度与多孔支架的降解和/或细胞向内生长动力学直接相关。在一些实施例中，另外的生物活性物质还可以通过例如但不限于10％至300％的增加，来影响细胞向内生长动力学(即，增加细胞向内生长动力学)。在一些实施例中，悬浮的生物活性物质和/或细胞和/或富血小板血浆(PRP)和/或生长因子和/或骨形态发生蛋白，基本上保留在身体的靶区域中(例如但不限于，其中患者无需像正常实践那样保持治疗的身体区域固定不合理的长时期、或用因子多重注射)。

在一些实施例中，泡沫最初是具有在0.1-11KPa之间的弹性(杨氏)模量的闭孔泡沫，其中所述弹性模量可以通过改变蛋白质、交联剂和/或生理缓冲液的浓度，和/或通过改变其中使用的明胶的布卢姆加以改变。

在一些实施例中，蛋白质泡沫具有在1-11KPa之间的初始弹性(杨氏)模量。在一些实施例中，蛋白质泡沫具有在2-10KPa之间的初始弹性(杨氏)模量。在一些实施例中，稳定泡沫的初始(即交联后约30分钟)伸长率为原始起始长度的0.1至1倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的0.1至1.5倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的0.1至2倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的0.1至3倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的0.1至4倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的0.1至5倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1至2倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1至3倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1至4倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1至5倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1.5至2倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1.5至3倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1.5至4倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的1.5至5倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的2至3倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的2至4倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的2至5倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的3至4倍。在一些实施例中，稳定泡沫的初始伸长率为原始起始长度的3至5倍。

实例5的表中示出了显示泡沫的机械测量的实施例，所述泡沫包含明胶作为蛋白质和mTG作为交联剂。

在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径1至500微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径2至400微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径2至300微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径2至200微米。

在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径2至50微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径2至10微米。

在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径10至500微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径50至400微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径100至400微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径200至400微米。在一些实施例中，多孔支架的孔径为直径300至400微米。

参考图8，在一些实施例中，泡沫的孔径为直径1至500微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径2至400微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径2至300微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径2至200微米。

在一些实施例中，泡沫的孔径为直径1至50微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径2至10微米。

在一些实施例中，泡沫的孔径为直径10至500微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径50至400微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径100至400微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径200至400微米。在一些实施例中，泡沫的孔径为直径300至400微米。

在一些实施例中，可以加入消泡剂，例如但不限于聚二甲基硅氧烷、聚山梨醇酯等，以达到较稠密的泡沫，其中所述较稠密的泡沫可以具有5KPa至15KPa的剪切模量。

不预期受任何特定理论的限制，在一些实施例中，添加生物相容性洗涤剂和/或表面活性剂导致引起泡沫的破裂，其中在泡沫稳定之前引入破裂，并且形成作为可流动凝胶的重构泡沫。在一些实施例中，可以将可流动凝胶与交联剂溶液混合(例如，手动、机械或通过同时推动穿过静态混合器)，以生成均质的稳定化凝胶。在一些实施例中，汇合的(即，与泡沫相反)稳定化凝胶可以经受在体内延长时间的降解。

在一些实施例中，组合物可以包括至少一种表面活性剂。如本文使用的，“表面活性剂”指降低水的表面张力的化合物。在一些实施例中，表面活性剂可以是离子表面活性剂，例如月桂基硫酸钠和辛酸；或中性表面活性剂，例如聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇。

在一些实施例中，可以将糊精(右旋糖酐)加入组合物中，用于降低体内降解动力学的速度。

在一些非限制性的示例性实施例中，通过加入硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，例如硫酸软骨素，甚至可以进一步增强细胞的向内生长。在一些实施例中，GAG可以作为共聚物粉末加入粉末的干制剂中，化学键合至蛋白质/交联剂(即，mTG)、在制备的喷射研磨阶段之前的任何其它组分、或其任何组合。在一些实施例中，GAG的浓度可以为组合物的0.5％w/w至10％w/w。

不预期受任何特定理论的限制，多孔支架内的细胞可以涉及在三维中的基质相互作用，类似于它们在天然细胞外基质的纤维环境中的经历。与2D支架或较不适合的支架材料相比，实现了在三维中发生的更自然的细胞扩散。

不预期受任何特定理论的限制，在三维多孔支架中实现的细胞形状可以修饰基因表达、蛋白质翻译和依次的功能。

在一些实施例中，细胞在制备时共混到多孔支架内(与水合液体混合)或随后进入多孔支架，在其中它们保留其天然的3D体系结构。因此，不预期受任何特定理论的限制，在一些实施例中，支架不仅保存各个细胞的天然3D形状，它还作用于以更天然的方式将细胞聚集在一起。这导致组织样结构和细胞间相互作用的形成，其更代表正常的组织功能。

在一些利用明胶的实施例中，交联明胶的弹性特性以及整联蛋白附着位点(聚合物上的细胞结合位点)的丰度允许细胞向内生长、增殖并导致生理组织再生，并且使各种组织工程应用成为可能。在一些实施例中，交联明胶可以在体外用多重细胞类型产生组织样结构。不同类型的细胞可以作为混合群体、或不同细胞类型的离散层在3D共培养模型中聚集在一起。根据一些实施例，明胶和交联剂例如mTG可以与细胞培养基混合；所述细胞培养基含有但不限于下述物质：葡萄糖、稳定的谷氨酰胺(丙氨酰-谷氨酰胺)、青霉素、CaCl₂·H₂O、硝酸铁(Fe(NO₃)3-9H₂O)、氯化钾(KCl)、MgSO₄·7H₂O、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸钠(NaH₂PO₄·H₂O)、D-葡萄糖、酚红、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-精氨酸-Hcl、L-胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸HCl-H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸-Hcl、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、吡多醇Hcl、核黄素、硫胺HCl和胎牛血清。

与细胞培养基的混合并不损害多孔支架的交联。

根据一些实施例，明胶和mTG干粉可以与细胞培养基(含有但不限于下述物质：葡萄糖、稳定的谷氨酰胺(丙氨酰-谷氨酰胺)、青霉素、CaCl₂·H₂O、硝酸铁(Fe(NO₃)3-9H₂O)、氯化钾(KCl)、MgSO₄·7H₂O、氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、磷酸钠(NaH₂PO₄·H₂O)、D-葡萄糖、酚红、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-精氨酸-Hcl、L-胱氨酸、甘氨酸、L-组氨酸HCl-H₂O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸-Hcl、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、吡多醇Hcl、核黄素、硫胺HCl和胎牛血清)混合且由其水合。在一些实施例中，这允许细胞在初始明胶细胞基质中的更佳存活。细胞可以与培养基混合且保持在一个注射器中，而mTG和明胶粉在另一个注射器中。然后，用允许手动推动的锁定机构，将注射器彼此连接，以将成分混合在一起。通过将它们从一个注射器推到另一个注射器中几次，细胞、培养基、明胶、mTG和气体混合在一起，以形成接种有细胞的最佳支架。实例19中详述了显示本发明的交联明胶多孔支架中的细胞生存力的示例性实施例。

在一些实施例中，本发明的方法可以包括修改待形成的交联基质中的酶分子的感知体积。在一些实施例中，根据形成基质的聚合物交联程度来确定修改的感知体积，使得与用未修饰的酶分子的交联程度相比，降低的交联程度指示增加的感知体积。在一些实施例中，一种增加酶分子的感知体积的方法是通过至少一个分子或部分与酶分子的共价或非共价附着，来增加分子的大小和/或流体动力学体积。在一些实施例中，本发明的方法包括修饰酶的使用。

在一些实施例中，增加感知体积的方法是通过修饰酶分子的静电荷，使得它们的净电荷与聚合物或共聚物链上的净电荷具有相反的极性。在一个实施例中，可以通过改变酶的等电点(pi)来实现增加感知体积。

根据本发明的组合物的一些实施例，提供了交联的多孔支架，其包含通过修饰的酶分子交联的底物聚合物，其中当基质通过聚合物的交联形成时，所述修饰的酶分子具有改变酶分子的感知体积的修饰。在一些实施例中，修饰的酶分子具有增加修饰的酶分子的实际大小的修饰。在一些实施例中，修饰的酶分子具有增加修饰的酶分子的流体动力学体积的修饰。在一些实施例中，修饰的酶分子具有修饰，与未修饰的酶相比，所述修饰通过改变修饰的酶的等电点(pi)，将修饰的酶分子的静电荷修饰为与底物聚合物的净电荷具有相反的符号。在一些实施例中，修饰是通过选自以下过程针对酶的赖氨酸的s-氨基：琥珀酰化(用琥珀酸酐)、乙酰化(用乙酸酐)、氨基甲酰化(用氰酸酯)、还原性烷基化(醛)和用马来酸酐处理。在一些实施例中，修饰针对酶的一个或多个含有羧酸的侧链，以降低负电荷的数目。

在一些实施例中，修饰包含至少一个分子或部分与修饰的酶分子的共价或非共价附着。在一些实施例中，修饰包含修饰分子与修饰的酶分子的共价附着。在一些实施例中，与未修饰的酶相比，修饰的酶分子具有减少的扩散速率和减少的交联速率，但与未修饰的酶相比，具有至少相似的测量的酶活性(例如但不限于与未修饰的酶相比，约20％至100％的活性)。

在一些实施例中，减少的交联速率是未修饰的酶交联速率的至少10％。在一些实施例中，减少的交联速率是未修饰的酶交联速率的10％-40％。

在一些实施例中，修饰分子包含载体或聚合物。在一些实施例中，聚合物包含合成聚合物、纤维素类聚合物、蛋白质、多糖或其任何组合。在一些实施例中，纤维素类聚合物包含羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素或其任何组合中的一种或多种。在一些实施例中，多糖包含右旋糖酐、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、淀粉衍生物或其任何组合中的一种或多种。

在本发明的组合物的一些实施例中，修饰分子包含PEG(聚乙二醇)。在一些实施例中，PEG包含PEG衍生物。在一些实施例中，PEG衍生物包含活化的PEG。在一些实施例中，活化的PEG包含以下中的一种或多种：甲氧基PEG(mPEG)、其衍生物、mPEG-NHS、mPEG的琥珀酰亚胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS)、mPEG-戊二酸酯-NHS、mPEG-戊酸酯-NHS、mPEG-碳酸酯-NHS、mPEG-羧甲基-NHS、mPEG-丙酸酯-NHS、mPEG-羧戊基-NHS)、mPEG-硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-异氰酸酯、mPEG-环氧化物或其组合。在一些实施例中，活化的PEG与酶上的胺基或硫醇基反应。在一些实施例中，活化的PEG与活化酶的赖氨酸残基的摩尔比在0.5至25的范围内。在一些实施例中，活化的PEG是单官能的、异双官能的、同双官能的或多官能的。在一些实施例中，活化的PEG是分支PEG或多臂PEG。在一些实施例中，活化的PEG具有范围为1000至40,000道尔顿的大小。

在一些实施例中，多孔支架还包含未与酶或底物聚合物共价结合的共聚物。在一些实施例中，共聚物包含多糖或纤维素类聚合物。在一些实施例中，多糖包括右旋糖酐、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、淀粉衍生物或其任何组合。在一些实施例中，纤维素类聚合物包含羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素。

在一些实施例中，修饰的酶分子通过将修饰的酶分子与多个其它酶分子交联，以形成多个交联的酶分子的聚集物进行修饰。在一些实施例中，酶分子的修饰影响基质的至少一种特性。在一些实施例中，至少一种特性选自拉伸强度、刚度、底物聚合物的交联程度、粘度、弹性、柔性、断裂应变、断裂应力、泊松比、溶胀度和杨氏模量、或其组合。

在一些实施例中，修饰的酶的修饰程度决定了修饰的酶在多孔支架中的活动性或从多孔支架中扩散。在一些实施例中，与未修饰的酶和蛋白质的溶液或多孔支架相比，修饰的酶的修饰减少了修饰的酶在修饰的酶和蛋白质的溶液中、或在修饰的酶和蛋白质的多孔支架中的扩散系数。在一些实施例中，修饰的酶的修饰程度决定一种或多种泡沫机械特性。在一些实施例中，与未修饰的酶分子相比，修饰的酶分子显示在交联的聚合物中比在溶液中更大的交联速率差异。

在一些实施例中，粉末状交联剂可以是与粉末状聚合物反应的酶和/或修饰的酶。在一些实施例中，粉末状聚合物可以是蛋白质，例如但不限于明胶。

在一些实施例中，选择凝胶-液体转变点降低剂，例如作为非限制性例子尿素或钙。钙的此类尿素可以以干粉形式加入干制剂中。此类添加可以增加混合泡沫通过细针的可注射性。它还使泡沫原位坍塌，以形成多孔支架和膨胀的汇合凝胶的组合。此类试剂的浓度越高，形成越少的支架和越汇合的水凝胶。这可能适合于某些应用，但不适合于其它应用。

根据本发明的至少一些实施例，提供了用于控制基质(“基质”指水凝胶或多孔支架)的形成的方法，其包括用修饰来修饰酶分子，当基质形成时，所述修改改变交联基质中的酶分子的感知体积；将修饰的酶分子与其为修饰的酶分子的底物的至少一种底物聚合物混合；并且通过至少一种底物聚合物经由修饰的酶分子的交联来形成基质，其中形成基质至少部分地受酶分子的修饰的控制。在一些实施例中，随着至少一种底物聚合物的交联程度增加，修饰减少了修饰的酶分子的交联速率。在一些实施例中，修饰的酶分子和至少一种底物聚合物以微粉化的粉末形式混合，使得随着溶液的粘度增加，修饰控制至少一种底物聚合物的交联程度。在一些实施例中，修饰包含在范围为7至9的pH下酶的PEG化。在一些实施例中，PEG化反应的pH为7.5-8.5。

用于计算制剂明胶稀释度(“DG”)的指导：

对于在麦芽糊精载体中含有明胶和mTG两者的制剂：

·X克明胶+Y克麦芽糊精+Z克液体

·明胶的稀释度等于DG％w/w＝100*X/(X+Y+Z)

·例如：1克明胶+1克麦芽糊精+4克液体＝1/6＝16.6％w/w。

对于仅含有明胶的制剂：

·X克明胶+Z克液体

·明胶的稀释度等于DG％w/w＝100*X/(X+Z)

·例如：1克明胶+4克液体＝1/5＝20％w/w。

上文计算假定下述：

·1克明胶＝麦芽糊精载体中的1克mTG＝1克液体；

·1ml液体＝1克液体；和

·与其它组分相比，酶的重量是可忽略不计的。

用于计算制剂酶稀释度(“DE”)的指导：

对于在麦芽糊精载体中含有mTG的制剂：

·X克明胶、Y克麦芽糊精、E克酶、Z克液体

·酶的稀释度等于DE％w/w＝100*E/(X+Y+E+Z)

·上文计算假定：

·1mg酶＝10单位活性；

·1克明胶＝1克麦芽糊精＝1克液体；和

·1ml液体＝1克液体。

对于含有mTG而不含麦芽糊精的制剂：

·X克明胶、E克酶、Z克液体

·酶的稀释度等于DE％w/w＝100*E/(X+E+Z)

·上文计算假定：

·1mg酶＝10单位活性；

·1克明胶＝1克液体，酶的量是可忽略不计的；和

·1ml液体＝1克液体。

治疗有此需要的患者的方法

在一个实施例中，本发明提供了方法，其中所述方法刺激成纤维细胞在患者中产生新的胶原，其包括：

a)以足以诱导成纤维细胞刺激的量，在患者中形成组合物，

b)其中所述组合物被配置为促进成纤维细胞刺激和胶原合成，其中所述成纤维细胞附着和胶原合成诱导组织(皮肤)再生，和

c)其中所述组合物是多孔支架，

d)其中所述支架的孔为1至500微米，所述组合物包含：

i.选自胶原和明胶的可交联蛋白质；

ii.诱导可交联蛋白质交联的交联剂；和

iii.液体。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以3％w/w至30％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以8％w/w至25％w/w的范围存在于组合物中。

在一个实施例中，在用液体稀释后，明胶以9％w/w至20％w/w的范围存在于组合物中。

根据至少一些实施例，提供了用于局部药物递送的媒介物的组合物，其包含如本文所述的多孔支架。根据至少一些实施例，提供了用于组织工程的组合物，其包含如本文所述的基质，适合作为可注射的多孔支架。根据至少一些实施例，修饰组合物的方法包括：提供具有可交联官能团的修饰的酶和具有可通过修饰的酶交联的至少一个部分的蛋白质；并且将修饰的酶和蛋白质混合，其中所述修饰的酶使蛋白质交联，并且还通过可交联官能团与蛋白质交联。

根据一些实施例，组合物用作用于局部药物递送的媒介物。根据一些实施例，组合物是用于组织工程和修复的可注射支架或组织重塑剂。根据至少一些实施例，提供了用于局部递送利多卡因或其它止痛剂的媒介物的组合物，其包含如本文所述的多孔支架。

如本文使用的，“增量剂”是用于增加组织体积的填充空间的可注射物质。它们可以注射到皮肤下用于改善的美容效果，注射到尿道周以治疗尿失禁，并且注射到肛周以治疗大便失禁。

在一些实施例中，本发明的组合物是增量剂，其配置为非迁移、耐用、可降解的，配置为经过延长的时间段被软结缔组织替换，或其任何组合。在一些实施例中，迁移随着颗粒大小和数目变化而变化。在一些实施例中，组合物提供了用于内源性或外源性细胞的支架，所述细胞随着时间过去增殖并维持体积效应。

在一些实施例中，组合物是原位交联凝胶，以便导致稳定和单一的固结物理形成物。在一些实施例中，组合物是可降解的，并且可以被成纤维细胞和免疫细胞逐渐浸润而无错位的风险，并且配置为被组织替换。

在一些实施例中，本发明的组合物随着时间过去被机体降解。在一些实施例中，至少70％至100％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少70％至100％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少75％至100％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少75％至100％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少80％至100％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少80％至100％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少90％至100％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少90％至100％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少70％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少75％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少80％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少85％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少90％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少95％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少100％的组合物在3个月后降解。在一些实施例中，至少70％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少75％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少80％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少85％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少90％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少95％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少100％的组合物在4个月后降解。在一些实施例中，至少70％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少75％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少80％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少85％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少90％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少95％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少100％的组合物在5个月后降解。在一些实施例中，至少70％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少75％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少80％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少85％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少90％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少95％的组合物在6个月后降解。在一些实施例中，至少100％的组合物在6个月后降解。

在一些实施例中，增量剂的组成可以是原位交联的多孔支架、泡沫或凝胶，以便导致稳定和单一的固结物理形成物。在一些实施例中，组合物由明胶和交联剂的干燥微粉化粉末组成。在一些实施例中，组合物由液态明胶和交联剂组成(在优选的实施例中，交联剂是转谷氨酰胺酶)。在一些实施例中，组合物由液态明胶和交联剂组成，其中其它赋形剂与明胶一起使用，以减少其天然的固体-凝胶转变点(例如尿素和钙)以减少其粘度，并且其中所述液体转谷氨酰胺酶含有赋形剂，以增强其稳定性且增加其粘度。

在一些实施例中，泡沫明胶可以通过长且细的导管或针递送。在一些实施例中，本发明的方法是通过中空的递送管递送明胶原位稳定泡沫，所述递送管长至少10cm并且直径至多10French。在一些实施例中，本发明的方法是通过中空的递送管递送明胶原位稳定泡沫，所述递送管长至少15cm并且直径至多6French。在一些实施例中，本发明的方法是通过中空的递送管递送明胶原位稳定泡沫，所述递送管长至少25cm并且直径至多6French。在一些实施例中，本发明的方法是通过中空的递送管递送明胶原位稳定泡沫，所述递送管长至少30cm并且直径至多6French。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少30号的针递送。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少27号的针递送。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少25号的针递送。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少23号的针递送。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少21号的针递送。在一些实施例中，泡沫明胶可通过直径至少18号的针递送。

在一些实施例中，本发明的增量剂被配置为去除或改善痤疮疤痕，并且纠正皱纹，抬高现有的疤痕，重新形成面部轮廓或其任何组合。

在一些实施例中，本发明的增量剂是具有下述品质的填充材料：(i)生理的-将其自身与身体组织合并；(ii)程序简单-可注射；(iii)无风险-无并发症或不利效应；(iv)半永久-随着时间过去降解；(v)充当用于细胞的向内生长的支架和组织重塑剂或其任何组合。

在一些实施例中，本发明的组合物是填充剂，例如皮内填充剂。在一些实施例中，填充剂可以由明胶和转谷氨酰胺酶稳定剂组成。在一些实施例中，本发明的组合物可以用于治疗室内宠物，例如但不限于猫和犬。

在一些实施例中，本发明是用于刺激成纤维细胞以在患者组织中产生新胶原的方法，其中使用了专门生物改造以作用于成纤维细胞局部粘附的可注射组织基质。在一些实施例中，可注射的组织基质由生物可降解的交联蛋白(例如但不限于明胶)泡沫制成，它通过微生物转谷氨酰胺酶原位交联，以形成具有理想机械特性的稳定且粘性的多孔基质。此类结构提供了最佳的机械和生物学支持，以刺激细胞向内生长，并且允许基质与成纤维细胞之间的正确串扰。通过模仿组织自然环境的细胞外基质，可以生长富含新生细胞的组织或真皮层，具有年轻皮肤的生物学和结构特性。泡沫降解，且最终被天然样体系结构替换。在本发明的一个实施例中提供的公开的组织基质，允许成纤维细胞的生长和增殖、胶原的分泌和在增强部位中的刺激ECM积累，因为本文所述的泡沫被身体缓慢降解，从而产生生物组织和/或皮肤再生。

在本发明的一些实施例中，明胶泡沫支架生物材料可以将整联蛋白结合位点引入成纤维细胞环境。此外，通过其有利的机械特征及其粘附性，连同其丰富的RDG(整联蛋白附着位点)，它将先前对于内源性ECM丧失的生物力学信号施加到治疗部位内。通过所述支架的此类生物力学信号传导形成粘着斑，并且刺激成纤维细胞胶原产生，同时减弱MMP产生。这允许明胶泡沫支架与身体整合。它还可以将任何生物力学信号转导至其附近的环境，引起邻近细胞中的表型转变。最终，明胶泡沫支架生物材料将降解，但不在受刺激的成纤维细胞制造新的相互连接的胶原ECM之前，以支持其自身及其邻近细胞，导致持久的皮肤再生。

在本发明的一些实施例中，明胶泡沫支架生物材料可以诱导来自先前存在的成纤维细胞的胶原产生，诱导其增殖，以及诱导来自间充质谱系细胞和纤维细胞的成纤维细胞成熟。它还可以促进细胞浸润到泡沫体积内，促使成纤维细胞在泡沫体积内产生ECM。泡沫降解和ECM生产的此类过程在增强部位中导致长期效应。在本发明的其它实施例中，明胶泡沫支架材料还可以诱导血管形成，以支持新的细胞群体和基质产生。这些血管将提供营养素流入/流出，并且促进此类改变的存活，从而使效应长期存在。因此，在本发明的一些实施例中，明胶泡沫支架生物材料可以支持遭受自然或病理状况折磨的真皮皮肤的再生，这取决于需要更多胶原产生的位置。

在本发明的一些实施例中，明胶泡沫支架生物材料可以诱导胶原产生，并且加强皮下支持性结缔组织例如(作为非限制性例子)隔膜的胶原含量，其增强了皮肤的外观和质地。

在本发明的一些实施例中，用过氧化物加强本发明的粉末或明胶泡沫支架生物材料，以提供用于开孔结构的溶液。在本发明的一些实施例中，对于开孔(孔)泡沫存在超过闭孔泡沫的优点。因此，建议将可溶的致孔剂与本发明的粉末混合将增加孔的互连性。在将致孔剂粉末与本发明的其它粉末混合的同时，致孔剂可以在明胶泡沫支架生物材料内部捕获。这种致孔剂通过液体的接触而被活化并且降解成气体形式。气压在每个闭室内部积累，以在相邻孔之间产生裂纹和连接。这提供了产生氧的支架，其可以改变给定病理状况的进程并且促进修复过程，包括但不限于细胞增殖和胶原合成。

在本发明的一些实施例中，在完全交联之后，还可以使交联的明胶泡沫支架生物材料丧失液体。这可以通过脱水、加热干燥或冷冻干燥来完成。所得泡沫是可以用于各种应用的坚硬生物材料。当干泡沫水合后，它恢复其柔软的泡沫形式，并且可以充当用于体内或体外细胞的支架。这种干燥形式的泡沫的施加可以是例如但不限于使在植入物(例如整形外科植入物)上的泡沫干燥，以增强与植入物的骨整合。另一个应用可以是将其用于组织加强和细胞活化。干泡沫可以被微粒化成50-500微米的小颗粒，使得它可以通过针注射到组织如真皮组织内。

在本发明的一些实施例中，纯化交联酶以去除任何制造杂质，并且所得到的产物不太容易受到免疫应答和降解的影响。像这样，它的体内降解曲线可能较慢，并且允许用于新胶原积累(组织重塑)的更多时间。更多的胶原积累转化为增强的功效。

现在参考下述实例，其连同上文说明书一起以非限制性方式示出了本发明的一些实施例。

实例

实例1：根据本发明的一些实施例，对组合物的拉力测试。

组分

(i)0.25克ACTIVA WM酶制剂(来自从茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)的1％微生物转谷氨酰胺酶，99％麦芽糊精)(Ajinomoto，日本)

(ii)0.25克Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24um，d(0.5)＝16.61um，d(0.9)＝31.51um

(iii)1ml盐水(+和液体添加剂)

方法

通过由L-3Communications制造的9.93千戈瑞电子束来灭菌粉末。无菌性已由AminoLab Ltd.(Rechovot，以色列)进行确认，测试根据SOP no.50.WI.110-保健产品的无菌测试进行。通过将混合物从一个注射器推到另一个注射器中10-12次来手动混合粉末。此后立即将混合物施加在两个胶原片之间，使得胶合的重叠为大约2cm*2.5cm，并且静置固化大约10分钟。用测力计Lutron FG-20KG测试该组合物的最大拉力(剪切力)。

撕裂未在粘胶中，而是在胶原片层本身失效时观察到，因此，撕裂不在粘胶区段处。

结果证实了将微粉化的粉末终末灭菌而不显著丧失活性的能力。

实例2：显微镜检查。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24um，d(0.5)＝16.61um，d(0.9)＝31.51um。下述mTG指ACTIVA(Ajinomoto，日本)。

制备明胶-mTG泡沫，并且在光学显微镜10x和40x放大率下显现，以评估其泡沫特性。

结果：

检测到气泡以随机方式跨越机体元素被锁定。气泡的大小从直径1到500微米不等。

实例3：根据本发明的一些实施例的组合物经由针的递送。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指ACTIVA(Ajinomoto,Tokyo)。

将明胶粉末与mTG以1:1的比率混合。0.75克混合物在26℃下与2.63ml水手动混合成泡沫。将泡沫推过18号针(D＝1.03mm)；长150mm。

结果：

泡沫成功地通过针从注射器中递送。泡沫在约3分钟后稳定，并且在50℃的水中保持稳定(意味着这是热不可逆的)。

实例4：根据本发明的一些实施例的各种组合物的测试。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：

(A)：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。

(B)：d(0.1)＝4.415μm，d(0.5)＝13.064μm，d(0.9)＝29.621μm。

(C)：d(0.1)＝13.451μm，(C)：d(0.5)＝94.66μm，d(0.9)＝423.785μm。

将明胶粉末与mTG酶：ACTIVA(Ajinomoto,Tokyo)混合，并且通过手动混合(相连的两个注射器，一个具有粉末，一个具有水)进行水合。所得是泡沫，测试其粘附两个胶原片层的能力，并且通过将制品浸没在50℃的水浴中，测试热可逆性。

实例5：用转谷氨酰胺酶交联的明胶泡沫的键合和机械特性的表征。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。如果指定的灭菌粉末-明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

使用The Lloyd Materials Testing LS1机器(Ametek Test&CalibrationInstruments)，1kN高精度材料测试机，测量交联泡沫的流变学参数，以测试生物材料的机械特性。按照下表中指定的比率通过手动混合制备生物材料，并且允许在混合和测试之间的40分钟。将其注射到特氟龙覆盖的玻璃板上、间隔物和具有特氟龙表面的玻璃盖两者之间，一旦稳定就产生3mm厚的矩形形状。从生物材料中冲压出标准的犬骨形成物，并且用于机械测试。通过向上移动上夹头，拉伸生物材料直至失效(完全撕裂)，来执行拉伸测试。基于样品宽度和厚度确定在最大力时的最大负荷和总伸长率百分比。杨氏模量通过选择两个点来计算，所述两个点代表图形中最线性的部分。测试速度为45mm/分钟，并且使用10N的测力传感器(序列号10N0360)。

爆裂压力测试基于ASTM F2392-04，外科密封剂爆裂强度的标准测试方法(TheStandard Test Method for Burst Strength of Surgical Sealants)进行。对于每个爆裂压力测试，使用胶原肠衣(Nitta Casings,N.J.)作为基底。在每个肠衣样品中冲压3-mm直径的孔，并且将每个样品夹在样品固定歧管内。通过手动混合组分来制备泡沫，允许40分钟的固化时间。然后，用双蒸馏水填充组织歧管，并且用以120mL/小时的速率致动的注射泵(KD Scientific Model 100 Series)进行加压。水通过硅酮管填充测试夹具，并且使用压力计来确定直到失效的最大压力(PSI)。每次测试后记录失效的类型(内聚、粘合)。对于每组测试三个重复。

结果：

下表中描述的结果清楚地证实制造根据本发明的生物材料的能力，所述生物材料具有的机械特性易于控制，以适应组织工程或手术密封领域中的不同需要。

Lloyd机械测试：

爆裂压力测试：

实例6：交联明胶泡沫的营养素渗透的表征。

该实例证实了根据本发明的组合物允许营养物循环的能力。通过将PBS从含有转谷氨酰胺酶/明胶组合物的一个注射器传递到另一个连接的注射器中10次的方法，通过手动混合干组分来制备下述组成的泡沫，并且在添加着色介质之前允许交联15分钟。混合4mLPBS+1克明胶和1克mTG。生物材料具有21mm的直径和26mm的厚度。Red Maimon的食物着色液体染料在水中稀释，然后将生物材料浸入有色液体中24小时，然后切成两半以测量颜色扩散。

实例7：在与明胶组分混合后的细胞存活。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。明胶微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

下述实例旨在证实正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)经受由产生根据本发明的组合物所需的混合显示出的剪切力的能力，并且评价通过直接混合或使用三通旋塞阀，将细胞掺入生物材料内部的最佳方法。当用作用于组织工程目的的细胞支架时，这种混合方法确保细胞在支架体积内部的均匀扩散和生存力。

使用胰蛋白酶(胰蛋白酶EDTA溶液B(0.25％),EDTA(0.05％)，具有酚红，Biological industries，03-052-1A)处理2ml共3-5分钟，在达到80％汇合后，从100mm平板中分离NHDF细胞，随后用6mL含有血清的培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries批号1530279，补充有10％认证的胎牛血清，目录#：04-001-1A和1％的青霉素-链霉素溶液，Biological Industries，03-031-1C)抵消胰蛋白酶。将细胞以1500RPM离心5分钟，然后重悬浮于6ml预热的培养基中，以得到360,000NHDF细胞/ml的原液浓度。

执行如下表中所述的将明胶粉末与含有细胞的培养基混合的三次重复，并且使用由含有细胞的培养基1:1稀释的台盼蓝(0.5％)、以及在接种后4、24小时的目视检查证实细胞的存活性。在孔1中，使用2个注射器系统(与母鲁尔锁连接的公鲁尔锁)，将明胶和含有细胞的培养基直接混合。在孔2-3中时，首先使用混合8次的2.5ml培养基溶解明胶，然后立即使用三通旋塞阀(Elcam Medical)，加入另外1.5ml含有细胞的培养基，并且完成另外2次混合。在组织培养处理的塑料(Coming Inc.，Costar，产品#：3516)的顶部6孔板上，接种含有细胞的明胶混合物。

在接种后4小时容易发现细胞粘附，而在接种后24小时，细胞看起来完全铺展在板上，其证明细胞是有活力的，并且能够经受住在混合过程中经历的剪切应力。

由于剪切应力的细胞存活性测定

实例8：交联明胶泡沫内部的细胞生存力。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。下述培养基指含有血清的培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries(以色列)，补充有10％认证的胎牛血清，目录#：04-001-1A和1％的青霉素-链霉素溶液，Biological Industries，03-031-1C)。

下述实例旨在证实被包埋或接种在根据本发明的组合物中的成纤维细胞能够存活且茁壮成长7天或更久。

使用胰蛋白酶(胰蛋白酶EDTA溶液B，Biological industries，03-052-1A)处理2ml共3-5分钟，在达到80％汇合后，从100mm平板中分离NHDF细胞，随后用含有血清的培养基抵消胰蛋白酶。将细胞以1500RPM离心5分钟，然后重悬浮于培养基中，以得到1,000,000个细胞/ml的原液浓度。

组A：具有与120mg灭菌mTG混合的200mg灭菌明胶的组成的明胶生物材料，装载到公鲁尔锁注射器上，并且与1ml细胞原液培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries批号1530279)混合10次，以制造生物材料，并且注射到未处理的塑料(Corning Inc.，Costar，参考#：3736，批号#：30015036)的6孔板上。

组B：将相同组成的生物材料与无细胞培养基混合，允许交联40分钟，并且在3ml培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries批号1530279，补充有10％认证的胎牛血清，目录#：04-001-1A和1％的青霉素-链霉素溶液，BiologicalIndustries，03-031-1C)中加入1x10^A6细胞，在移动到具有5％CO2和37℃ O/N的培养箱内之前，在37℃下在振荡器上放置2小时。这种方法允许细胞附着到明胶支架上，并且在其外围上生长，而不是包埋在其体积内。

组C：用作对照且不含细胞，但分别具有与组A和组B中相同组成的生物材料。

使组A、B和C在具有5％CO2和37摄氏度的培养箱中进行温育。

在接种后二十四小时，用手术刀将所有组切成四等分。将组B生物材料转移到未对于细胞培养进行处理的新塑料6孔板，以从未附着至生物材料的细胞中分离测试物品，然后将10％Alamarblue v/v加入所有孔中。在细胞接种后3天和6天测量Alamarblue减少。允许Alamarblue反应大约24小时。

结果：

图10中描绘的结果清楚地证实，在生物材料内部(组A)和生物材料(组B)上的细胞是有活力的，并且通过与对照(组C)相比，含有Alamarblue的培养基的不同着色显示的，能够在指定时间点还原Alamarblue。这些结果支持了以下主张：交联的明胶泡沫生物材料可以充当用于组织工程目的的良好支架。

实例9：根据本发明的一些实施例的组合物的皮下注射。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。

下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末通过9.93千戈瑞电子束(Sorvan，以色列)进行灭菌。测试的组合物包含：在一个注射器中的0.25克明胶粉末+0.25mTG粉末与1ml无菌盐水混合。

两只60kg SW猪用于该研究。将动物麻醉，并且在左前腿中使用针在皮肤下执行测试组合物(0.3-0.5ml泡沫)的注射。在90天的随访期后，对动物实施安乐死，并且收获组织用于显微镜分析。将组织样品固定在福尔马林中，并且运送用于玻片的制备以及苏木精和曙红染色。

结果：

动物无一已显示任何不利效应。该生物材料呈现良好的耐受性，并且大部分被降解。既没有记录到坏死，也没有记录到腔形成和迁移。

图2A示出了在注射后90天时，定位处理组织中的成纤维细胞。如图2A中所示，成纤维细胞是饱满的、纺锤形或星形的细胞，具有中心放置的卵圆形或圆形核。这通过其嗜碱性染色显示。这些发现一起提示那些成纤维细胞被激活，并且能够产生新的胶原。

图2B示出了在注射后90天，未处理的组织中的成纤维细胞。如图2B中所示，成纤维细胞是薄而扁平的，具有波浪状的核，并且其胞质容积是减少的，提示处于成熟期的非活性成纤维细胞。

本发明的组合物可以刺激成纤维细胞活化和新胶原产生，提示它可以帮助重建或恢复受损的ECM。在皮肤应用的情况下，这预期使皮肤看起来且感觉象更年轻的皮肤。

实例10：使用扫描电子显微镜用于成像在支架上的细胞形态。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。明胶:mTG比为1U mTG/10mg明胶。下述培养基指含有血清的培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries(以色列)，补充有10％认证的胎牛血清，目录#：04-001-1A和1％的青霉素-链霉素溶液，Biological Industries，03-031-1C)。

使用胰蛋白酶(胰蛋白酶EDTA溶液B，Biological industries，03-052-1A)处理2ml共3-5分钟，在达到80％汇合后，从100mm平板中分离NHDF细胞，随后用含有血清的培养基抵消胰蛋白酶。将细胞以1500RPM离心5分钟，然后重悬浮于培养基中，以得到1,000,000个细胞/ml的原液浓度。

在一个注射器中混合的微粉化明胶和mTG粉末与无细胞培养基混合，允许交联40分钟，并且在3ml培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基，高葡萄糖，Biological industries批号1530279，补充有10％认证的胎牛血清，目录#：04-001-1A和1％的青霉素-链霉素溶液，Biological Industries，03-031-1C)中加入1x10^6细胞，在移动到具有5％CO2和37℃ O/N的培养箱内之前，在37℃下在振荡器上放置2小时。这种方法允许细胞附着到明胶支架上，并且在其外围上生长，而不是包埋在其体积内。

7天温育后，将支架的一部分轻轻切开。具有细胞的支架在4℃下使用4％多聚甲醛固定24小时。该支架然后在梯度丙酮系列(30、50、70、80、90、95、100)进行脱水。随后为用balzers CPD 030Critical Point Dryer(CPD)的干燥。在SEM检查之前，用喷金仪包被样品。

图4示出了根据本发明的一些实施例的在支架组合物中接种的细胞。

结果：

发现成纤维细胞填入(populate)支架表面及其孔。接种的成纤维细胞以纺锤形形态显现，而不是如体外由其预期的扁平或圆形。这种形态也可以描述为细长的，代表年轻成纤维细胞的表型。细胞也能够在自身之间形成键。此类结果证实，交联的明胶泡沫可以影响成纤维细胞表型，促进新胶原产生和组织再生。

实例11：不同的皮肤填充剂相对于mTG交联的明胶泡沫在体内用于胶原沉积的能 力比较。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。明胶:mTG比为1U mTG/10mg明胶。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且如下注射测试组合物(1.6-2.4ml泡沫)或商购可得的皮肤填充剂的注射：在猪的腹侧区域上选择至少5x5 cm的6个皮肤区域。在每个区域的中点内侧插入套管，以均匀分布不同的皮肤增强皮肤填充剂和mTG交联的明胶泡沫的测试组合物。

注射的皮肤填充剂：

商业皮肤填充剂如由制造商(Restylane Vital,SCULPTRA,Radiesse,Restylane)指导的进行使用。

样品收集：7mm打孔活组织检查在注射后30天、60天、90天和150天时获取，浸没在10x体积的4％多聚甲醛中，并且进一步包埋在石蜡中。将块切成5μm的切片，并且对于苏木精和曙红进行染色，用于细胞浸润和组织应答分析，以及马森三色染色用于胶原沉积分析

结果：

在注射后12天和30天，不同的皮肤填充剂相对于mTG交联的明胶泡沫(组F)的分级组织病理学分析。

使用五个等级(0、1、2、3、4)的半定量分级，考虑到变化的严重性(0＝无病变，1＝最低限度变化，2＝轻度变化，3＝中度变化，4＝标记变化)。*-由于针外伤而形成病变，**-可见淋巴细胞的高度存在。

所有材料都显示引起异物颗粒化应答。细胞浸润主要由巨噬细胞和巨细胞组成，并且材料具有特征为通过吞噬外来材料的巨细胞吸收的降解模式。在所测试的任何材料中均未显示不利效应，例如坏死、水肿或钙化。

图5示出了在注射后30天，与组F相比，不同的皮肤填充剂的胶原沉积。

不同皮肤填充剂和mTG交联的明胶泡沫支架生物材料的马森三色染色清楚地显示以蓝色的胶原沉积染色。mTG交联的明胶泡沫中的胶原沉积在数量和组构方面更佳。胶原纤维似乎是平行组构的，而在商购可得的皮肤填充剂中，胶原纤维是紊乱的。

图6A-6E示出了根据本发明的实施例的本发明的组合物。

图像是通过用所述交联的明胶泡沫支架生物材料处理的真皮下组织的马森三色染色着色的组织病理学切片。图像来自注射后的12天、30天、60天、90、150天。证实了在处理部位处的新组构的胶原纤维的发展。主要是真皮下的隔膜由较厚的胶原含量得到加强。新胶原被染成蓝色。

结论：

在12天的组织学检查中，在组F(交联的明胶泡沫支架生物材料)的植入部位中已经存在丰富的成纤维细胞。在其它已知的填充剂中未观察到这一现象。

在组F注射后十二天，组织学检查证实轻度等级的炎症应答，其与其它商业材料等价。应注意，与已经高度纯化的商业产品相比，呈现最低限度更高的巨细胞、巨噬细胞和淋巴细胞存在(这可以通过测试产品的杂质来解释，其还不是临床等级)。

在组F注射后三十天，在植入部位中观察到许多胶原纤维。与其它测试材料(得分0-1)相比，在组F注射后新的胶原沉积量明显更高(得分2-3)。在组F注射后，不存在坏死、腔形成或水肿，证实良好的组织耐受性。

在组F注射后一百五十天，注意到在皮下组织处的纤维化隔膜是加强且增厚的。纤维看起来是波浪状和天然组构的，而不是如疤痕或纤维化组织中紊乱的，指示在交联明胶注射后产生I型胶原。不存在坏死、腔形成或水肿。

实例12：增加粘性材料的可注射性。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。明胶:mTG比为1U mTG/10mg明胶。

结果：

筛选微粉化的明胶粉末(截断较大的颗粒)，以减少明胶颗粒的尺寸并缩小颗粒分布范围。检测到，当用含有特定范围的孔径的网筛选明胶粉末时，可以在混合后调节泡沫的初始粘度，且因此可以通过不同规格的针进行注射。这允许修改泡沫的可注射性，其允许医师容易地处理细纹，而不损害患者的皮肤。

下表描述了可注射性中的改善。

筛选平均孔径(μm)	用于容易注射的最大针规格
		20	28
50	25
		100	22

实例13：调节支架的体内功能性

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。明胶:mTG比为1U mTG/10mg明胶。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且注射各种明胶与液体稀释度的测试组合物的注射，并且评估在注射后30天的胶原产生。

结果：

检测到通过调节组分(即，液体、明胶，mTG)的比率，可以优化胶原产生的量。下表描述了如取决于明胶和液体之间的比率(mTG酶保持恒定)产生的胶原量。12.5-8％w/w的明胶％w/w很可能比最高测试的明胶浓度例如16.6％w/w更有效。

稀释后的明胶w/w％	胶原产生；最大效应的％
		16.6	70
12.5	100
		8	100

图11A示出了在注射后30天，通过用所述8％w/w明胶交联的泡沫支架生物材料处理的组织的马森三色染色着色的组织病理学切片。图11A中的结果证实了在处理部位处的新组构的胶原纤维的发展。新胶原被染成蓝色。图11B示出了组织的苏木精和曙红染色，证实注射后巨噬细胞和巨细胞的有限存在。不可见材料的残留物，提供了总体良好的生物相容性结果。

实例14：使用生物可降解的交联明胶泡沫的疤痕预防，

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。明胶:mTG比为1U mTG/10mg明胶。稀释度为16.6％(w/w)的明胶。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且在动物背部的左侧和右侧各自上制备七个手术切口。左侧用于临床观察，且右侧用于组织学分析。去除一片卵形的皮肤。使用电烙术，增加了对伤口床的热损害，以加强创伤和可能的瘢痕形成。在任何干预之前，将一条缝合线置于切口的中间以接近切口边缘。在切口中间的上方和下方大致1cm处放置另外两条缝合线。缝合线这样放置，使得可见1-2mm的伤口开口，并且缝合线不会过紧闭合。

下表描述了伤口和治疗方案。

结果：

所有病变都通过擅长于疤痕治疗的皮肤科医生进行盲目评估。根据他的观察，与对照(组7)和早期注射(组1和2)相比，组3-6证实明显更佳的肉眼可见结果。

显示在手术后第3-20天时用可交联明胶泡沫处理开放性伤口在预防疤痕形成中是有益的。还显示了在第0天用泡沫处理伤口是无益的。

图7A-7D分别示出了在伤口形成后150天之后，由组1、4、6和7形成的疤痕。

实例16：交联的明胶组合物与透明质酸(HA)的混合，而在体内不丧失材料稳定性。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。使用100微米的筛网筛选微粉化的明胶粉末(截断较大的颗粒)，以减少明胶颗粒的尺寸并缩小颗粒分布范围。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且测试组合物的注射(1.5mL稀释物)就胶原产生进行测试，其对应于具有1U mTG/10mg明胶的8％明胶％w/w。在化合物注射之前，将1ml透明质酸(Belotero soft)加入注射器中并再次混合。使用21号针将材料注射到皮下组织内。

结果：

图12示出了组织的苏木精和曙红染色的组织病理学切片，证实在注射后巨噬细胞和巨细胞的存在。可见材料的残留物，提供了总体良好的生物相容性结果，并且显示该材料可以与透明质酸一起注射，而不妥协通过pH影响的酶的明胶交联。

结论：通过微生物转谷氨酰胺酶的明胶交联的组合物可以与由HA制成的其它流行的皮肤填充剂共注射。

实例17：交联明胶150天随访体内猪模型的前胶原I型染色。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。使用100微米的筛网筛选微粉化的明胶粉末(截断较大的颗粒)，以减少明胶颗粒的尺寸并缩小颗粒分布范围。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且测试组合物的注射(1.5mL稀释物)就胶原产生进行测试，其对应于具有1U mTG/10mg明胶的12.5％明胶％w/w。使用21号针将材料注射到皮下组织的5x5 cm区域中。在注射后15天、30天、90天和150天获取活组织检查，并且用前胶原I型抗体abeam 64409染色。

结果：图13A-D示出了在注射后染色的前胶原I型细胞。前胶原I型细胞主要在注射后15天和30天染色。在注射后90天也可见一些染色。在注射后150天染色不可见。

结论：mTG交联的明胶组合物能够通过前胶原I型的产生来诱导胶原I型的产生。该过程在注射后30天左右达到峰值，且到注射后150天消退。

实例18：交联的明胶和纯化的mTG能够诱导胶原产生。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。从25mM三-乙酸盐pH 6.5、300mg/mL麦芽糊精“制剂204”冻干纯化的大肠杆菌生长的重组mTG，或从25mM三-乙酸盐pH 6.5“制剂203”冻干纯化的mTG。天然mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。使用购自Zedira GmbH Z009的羟基酸酯(hydroxymate)测定试剂盒测量酶活性。

使用100微米的筛网筛选微粉化的明胶粉末(截断较大的颗粒)，以减少明胶颗粒的尺寸并缩小颗粒分布范围。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

10月龄的与Red Duroc猪杂交的一只90kg大白猪用于该研究。将动物麻醉，并且测试组合物的注射(1.5mL稀释物)就胶原产生进行测试，其对应于具有1U mTG/10mg明胶的12.5和14％明胶％w/w。使用21号针将材料注射到皮下组织的5x5 cm区域中。在注射后30天获取活组织检查。

结果：

图14示出了马森三色染色(左)以及苏木精和曙红染色(右)，显示了胶原产生。胶原产生和免疫应答与含有Activa-WM mTG的天然制剂可比较。

实例19：明胶、mTG和尿素的混合以实现较慢的胶凝时间和较密的植入物(较少气 泡)。

下述明胶指Gelita 275布卢姆，A型猪明胶(Gelita,Sioux City)医用级低内毒素，其由Superfine Ltd喷射研磨至以下范围的粒度：d(0.1)＝4.24μm，d(0.5)＝16.61μm，d(0.9)＝31.51μm。下述mTG指活性水平为100U/克的ACTIVA WM粉末(Ajinomoto,Tokyo)。mTG含有1％的酶和99％的麦芽糊精。使用100微米的筛网筛选微粉化的明胶粉末(截断较大的颗粒)，以减少明胶颗粒的尺寸并缩小颗粒分布范围。明胶和mTG微粉化粉末使用γ射线9.38千戈瑞(Sorvan，以色列)进行灭菌。

尿素购自Sigma Aldrich。

制备了含有PBS和0、1、2、4M尿素的溶液。

将1.5ml此类溶液装载到注射器内，并且与含有1:1明胶:mTG(总共500mg)的混合物的另一个注射器连接，并且混合以产生泡沫。

结果：

在混合后，使泡沫在37℃下温育，并且测量胶凝时间(直到翻转90°度时混合物是稳定的且不流动的时间)和交联时间(直到插入55℃水浴内时明胶:mTG混合物是稳定的时间)。随着尿素的浓度增加，胶凝时间和交联时间增加(即使在30分钟后，在4M尿素下也没有实现交联)。结果显示添加尿素可以增加泡沫的可注射性，并且改善外科医生的工作时间(尤其是通过细针)。这是由于水合明胶的物理胶凝时间的延迟以及酶活性的抑制。还值得注意的是，尿素减少了泡沫中的气泡量，并且在高剂量下，使许多泡沫破碎成汇合的水凝胶。

在本文件自始至终引用的出版物在此以引用的方式整体引入。尽管上文已通过参考实例和优选实施例说明了本发明的各个方面，但应了理解，本发明的范围不是由前述说明书限定的，而是由在专利法的原则下适当解释的下述权利要求限定的。