阅读说明：本技术 模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法 (Animal model construction method for simulating rat fracture internal fixation and low-toxicity infection ) 是由 朱晓彬 肖凌飞 肖潇 王嘉俊 姬文晨 于 2020-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法,该方法包括如下步骤：S1、动物的选择及饲养条件；S2、菌种的选择及培养；S3、动物麻醉和大鼠股骨骨折内固定模型构建；S4、低毒感染的模拟；S5、术后动物观察；S6、动物染菌模型评价,本发明涉及医学动物模型研究技术领域。该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法,通过构建一种实用、可行的大鼠骨折内固定合并低毒感染模型,为人们研究骨折内固定合并低毒感染提供动物实验模型以及检测指标,该实验方法设计严谨,极大程度地模拟骨折内固定合并低毒感染,造模后大鼠适合长期饲养,能够减少因为实验过程中动物死亡造成的经济和时间上的损失。(The invention discloses a method for constructing an animal model for simulating fracture internal fixation and low-toxicity infection of a rat, which comprises the following steps: s1, selecting animals and raising conditions; s2, selecting and culturing strains; s3, constructing an animal anesthesia and rat femoral fracture internal fixation model; s4, simulating low-toxicity infection; s5, observing the animals after the operation; s6, animal contamination model evaluation, and relates to the technical field of medical animal model research. According to the animal model construction method for simulating the internal fixation and low-toxicity infection of the rat fracture, a practical and feasible model for the internal fixation and low-toxicity infection of the rat fracture is constructed, an animal experiment model and detection indexes are provided for people to research the internal fixation and low-toxicity infection of the fracture, the experiment method is rigorous in design, the internal fixation and low-toxicity infection of the fracture is simulated to a great extent, the rat after the model is constructed is suitable for long-term feeding, and the economic and time losses caused by animal death in the experiment process can be reduced.)

模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法

技术领域

本发明涉及医学动物模型研究技术领域，具体为模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法。

背景技术

创伤后骨折需要恢复骨折的解剖位置并使用内固定器械进行固定，以帮助骨折愈合。然而，这类内固定器械在植入时，由于手术操作不当或器械灭菌不彻底，易导致细菌引入，从而引发感染。而这类感染特别难以控制，最终引发植入体细菌感染，从而导致植入手术失败。其中比较特别的一类是低毒感染，虽然没有明显的感染临床症状，但是可能导致骨折部位的不愈合或长期疼痛。低毒感染大多数由低毒力的病原体引起，如某些凝固酶阴性葡萄球菌。

怎样模拟骨折内固定合并低毒感染，是目前医学领域研究的一个难点和重点。现采用大鼠作为实验动物，模拟这类感染产生以及研究这类疾病所导致的动物临床症状，为后期人体骨折内固定合并低毒感染提供动物实验模型以及检测指标。

本发明以大鼠内固定动物模型为模板，探索了实用可行的手术部位染菌所致大鼠低毒感染的动物模型。实验操作大致流程为：(1)动物的选择及饲养条件；2)菌种的选择及培养；(3)动物麻醉和大鼠股骨骨折内固定模型构建；(4)动物染菌模型建立；(5)术后动物观察；(6)动物染菌模型评价，本发明通过构建一种实用、可行的大鼠骨折内固定合并低毒感染模型，为人们研究骨折内固定合并低毒感染提供动物实验模型以及检测指标。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，通过构建一种实用、可行的大鼠骨折内固定合并低毒感染模型，为人们研究骨折内固定合并低毒感染提供动物实验模型以及检测指标。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，具体包括以下步骤：

S1、动物的选择及饲养条件：挑选大鼠在室温通风条件下饲养与实验；

S2、菌种的选择及培养：首先用接种环轻挑斜面表皮葡萄球菌加入到营养肉汤培养基培养，至细菌达到中等浓度，然后在无菌条件下通过划线方法接种于营养琼脂板上，再用接种环挑取单个菌落，接种于新的营养肉汤培养基中，将菌管放入恒温摇床中培养，此时细菌处于稳定生长期，次日，采用麦氏比浊法，用新鲜营养肉汤培养基调节细菌浓度；

S3、动物麻醉和大鼠骨折内固定模型建立：用1％-4％浓度的异氟烷给大鼠吸入，术中持续给药，之后依次进行备皮、消毒、铺巾、暴露大鼠股骨、安装内固定器械和线锯截骨操作；

S4、低毒感染的模拟：将30mL的表皮葡萄球菌液用注射器注射于骨髓腔、骨折断端和内固定器械上，然后用丝线逐层闭合伤口，并采用聚维酮碘(安尔碘)消毒表皮；

S5、术后动物观察：待实验大鼠麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动空间合适，饲养标准均统一，术后不使用任何抗菌药物；

S6、动物染菌模型的评价：观察大鼠的体征情况，分别进行血液常规指标检测、微生物学检测、影像学检测和病理组织观察。

优选的，所述步骤S1中的大鼠为SD大鼠，雄性，体重为300±20g。

优选的，所述步骤S2中的表皮葡萄球菌品种为RP62A，购于美国模式培养物集存库(ATCC)，且培养条件是在32-37℃之间置于100-300rpm的恒温摇床中培养。

优选的，所述步骤S2中菌管放入恒温摇床中培养的时间为1-12h，且接种于营养琼脂板上的时间为15-24h。

优选的，所述步骤S3的具体操作如下：

a1、用异氟烷1％-4％给大鼠吸入，术中持续给药，麻醉剂量需要根据手术时间、术中情况、动物个体差异进行调整，待动物麻醉起效后，使用剃毛刀对手术部位进行备皮，在用聚维酮碘(安尔碘)进行皮肤消毒后，带灭菌手套，铺无菌洞巾，用手触摸确定股骨位置，沿股骨干方向在股骨中段做一约2-4cm长的外侧切口；

a2、分离皮下组织、浅筋膜，可见一条明显白线，为肌筋膜形成的肌间隔，沿肌间隙钝性分离可直接暴露至股骨干，钝性分离股骨干周围肌肉组织，然后将小腿内翻，带动股骨外旋，即可将股骨干前方充分暴露在术野中；

a3、根据股骨干前弓角度适度折弯钛合金钢板，将预弯的钛合金钢板用PBS磷酸缓冲液冲洗3遍，然后置入股骨干前方平整处，若钛合金钢板与骨面较为贴合，则用1mm钻头进行攻丝，然后拧入4枚1.1mm螺钉进行固定；

a4、待钛合金钢板固定牢固后，用弯钳将一根直径1mm的线锯从股骨后侧穿过，调整位置在第二、三枚螺钉的中间部分进行截骨，造成横行骨折，线锯截骨时用棉球或纱布将线锯与周围肌肉组织分隔开，以免操作产生的高热损伤软组织；

a5、截骨后再次检查钛合金钢板螺钉稳定性，之后用生理盐水冲洗，纱布吸取手术区域液体，使手术区域干燥。

优选的，所述步骤S4中菌液的浓度为1×10⁹CFU/mL。

优选的，所述步骤S6中动物染菌模型的评价具体包括：

T1、动物体征：包括大鼠的饮食、体重、、活动情况、肢体肿胀程度以及伤口愈合情况；

T2、血液指标检测：对大鼠尾静脉取血，进行血常规、肝肾功能和IL-6等指标的检测；

T3、微生物学检测：实验大鼠均作骨折处周围软组织的细菌培养，将大鼠处死，无菌条件下取股骨标本骨折处周围软组织0.8-1.2g，然后将组织置于无菌生理盐水内，进行10倍浓度梯度稀释，取原液和稀释液进行血平板涂布，第二天进行细菌计数，之后将血平板生长的菌落挑取出来进行革兰氏染色和血浆凝固酶实验，分别鉴定细菌种类以及是否具有致病性；

T4、影像学检测：将取下股骨拍摄X射线正侧位照片，并进行Micro-CT扫描重建，观察骨膜反应、骨痂形成、皮质骨的破坏和吸收情况；

T5、病理组织观察：随机选取造模成功的动物，处死后取胫骨干骺端标本，置于4％体积浓度多聚甲醛溶液进行组织固定，固定一段时间后取出标本，再经流水冲洗，然后依次对标本进行脱钙、石蜡包埋、染色和观察评分。

优选的，所述步骤T5依次对标本进行脱钙、石蜡包埋、染色和观察评分，具体包括以下步骤：

b1、首先是以EDTA脱钙液处理样本，用石蜡包埋脱钙后的标本；

b2、粗修包埋后的样本，然后在切片机上制备组织薄片；

b3、将组织薄片贴片干燥，最后进行HE染色和Masson染色；

b4、在光学显微镜下观察，进行组织学评分。

(三)有益效果

本发明提供了模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法。与现有技术相比具备以下有益效果：

(1)、该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，使用的骨折内固定方案作用稳定，对照组大鼠的骨折在一个月的时候能够正常愈合，感染组的骨折端一个月时发生内固定松动，骨折愈合不良或不愈合，很好的模拟了人体感染导致骨愈合不良的疾病模型。

(2)、该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，使用的细菌感染局部效果确切，选取的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株采用局部种植制造感染病灶的方法，影像学和病理检测等实验结果表明制造内植物局部感染效果明确，显著影响骨折愈合，骨折端延迟愈合或不愈合，内固定出现松动的表现，大鼠局部组织细菌培养结果阳性明确了感染灶是由种植的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株导致。

(3)、该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，使用的局部种植细菌导致全身感染症状轻，选取的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株局部种植后，动物的全身情况例如体温、体重、饮食及活动等没有显著改变，实验室检测全身炎症指标稍高，符合人体内植物低毒感染的临床表现，避免使用金黄色葡萄球菌，造成局部乃至全身的急性化脓性感染的情况发生，能够很好的用于模拟体内的慢性以及低毒内植物感染。

(4)、该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，提供了一个骨折内固定感染耐药的模型。生物膜的形成是细菌定植在假体表面产生耐药特性的重要机制之一，体外实验结果表明，本发明使用的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株具有很强的生成生物膜的能力，动物实验对细菌污染的钛合金钢板进行检测，发现钛合金钢板表面存在细菌生物膜，表明本发明制造的内固定感染模型通过细菌生物膜的机制产生对抗菌素耐药的作用。

(5)、该模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，提供了一种骨折内固定合并低毒感染的动物模型，目前国内的专利中未有报道，该实验方法设计严谨，极大程度地模拟骨折内固定合并低毒感染，该方法切实可行能够为骨折内固定合并低毒感染提供治疗模板和检测指标，造模后大鼠适合长期饲养，减少因为动物中途死亡造成的经济和时间上的损失。

附图说明

图1为本发明的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：模拟大鼠骨折内固定合并低毒感染的动物模型构建方法，具体包括以下步骤：

S1、动物的选择及饲养条件：挑选大鼠在室温通风条件下饲养与实验，大鼠为SD大鼠，雄性，体重为300±20g；

S2、菌种的选择及培养：首先用接种环轻挑斜面表皮葡萄球菌加入到营养肉汤培养基培养，至细菌达到中等浓度，然后在无菌条件下通过划线方法接种于营养琼脂板上，再用接种环挑取单个菌落，接种于新的营养肉汤培养基中，将菌管放入恒温摇床中培养，此时细菌处于稳定生长期，次日，采用麦氏比浊法，用新鲜营养肉汤培养基调节细菌浓度，表皮葡萄球菌品种为RP62A，购于美国模式培养物集存库(ATCC)，且培养条件是在32-37℃之间置于100-300rpm的恒温摇床中培养，菌管放入恒温摇床中培养的时间为1-12h，且接种于营养琼脂板上的时间为15-24h；

S3、动物麻醉和大鼠骨折内固定模型建立：用1％-4％浓度的异氟烷给大鼠吸入，术中持续给药，之后依次进行备皮、消毒、铺巾、暴露大鼠股骨、安装内固定器械和线锯截骨操作；

具体操作如下：

a1、用异氟烷1％-4％给大鼠吸入，术中持续给药，麻醉剂量需要根据手术时间、术中情况、动物个体差异进行调整，待动物麻醉起效后，使用剃毛刀对手术部位进行备皮，在用聚维酮碘(安尔碘)进行皮肤消毒后，带灭菌手套，铺无菌洞巾，用手触摸确定股骨位置，沿股骨干方向在股骨中段做一约2-4cm长的外侧切口；

a2、分离皮下组织、浅筋膜，可见一条明显白线，为肌筋膜形成的肌间隔，沿肌间隙钝性分离可直接暴露至股骨干，钝性分离股骨干周围肌肉组织，然后将小腿内翻，带动股骨外旋，即可将股骨干前方充分暴露在术野中；

a3、根据股骨干前弓角度适度折弯钛合金钢板，将预弯的钛合金钢板用PBS磷酸缓冲液冲洗3遍，然后置入股骨干前方平整处，若钛合金钢板与骨面较为贴合，则用1mm钻头进行攻丝，然后拧入4枚1.1mm螺钉进行固定；

a4、待钛合金钢板固定牢固后，用弯钳将一根直径1mm的线锯从股骨后侧穿过，调整位置在第二、三枚螺钉的中间部分进行截骨，造成横行骨折，线锯截骨时用棉球或纱布将线锯与周围肌肉组织分隔开，以免操作产生的高热损伤软组织；

a5、截骨操作在钛合金钢板固定之后，避免了骨折断端在股骨周围肌肉的牵拉下移位，导致复位困难，增加手术难度和手术时间，截骨后再次检查钛合金钢板螺钉稳定性，之后用生理盐水冲洗，纱布吸取手术区域液体，使手术区域干燥；

S4、低毒感染的模拟：将30mL的表皮葡萄球菌液用注射器注射于骨髓腔、骨折断端和内固定器械上，然后用丝线逐层闭合伤口，并采用聚维酮碘(安尔碘)消毒表皮，菌液的浓度为1×10⁹CFU/mL；

S5、术后动物观察：待实验大鼠麻醉清醒后单笼饲养，笼内自由活动空间合适，饲养标准均统一，术后不使用任何抗菌药物；

S6、动物染菌模型的评价：观察大鼠的体征情况，分别进行血液常规指标检测、微生物学检测、影像学检测和病理组织观察。

动物染菌模型的评价具体包括：

T1、动物体征：包括大鼠的饮食、体重、、活动情况、肢体肿胀程度以及伤口愈合情况；

T2、血液指标检测：对大鼠尾静脉取血，进行血常规、肝肾功能和IL-6等指标的检测；

T3、微生物学检测：实验大鼠均作骨折处周围软组织的细菌培养，将大鼠处死，无菌条件下取股骨标本骨折处周围软组织0.8-1.2g，然后将组织置于无菌生理盐水内，进行10倍浓度梯度稀释，取原液和稀释液进行血平板涂布，第二天进行细菌计数，之后将血平板生长的菌落挑取出来进行革兰氏染色和血浆凝固酶实验，分别鉴定细菌种类以及是否具有致病性；

T4、影像学检测：将取下股骨拍摄X射线正侧位照片，并进行Micro-CT扫描重建，观察骨膜反应、骨痂形成、皮质骨的破坏和吸收情况；

T5、病理组织观察：随机选取造模成功的动物，处死后取胫骨干骺端标本，置于4％体积浓度多聚甲醛溶液进行组织固定，固定一段时间后取出标本，再经流水冲洗，然后依次对标本进行脱钙、石蜡包埋、染色和观察评分，具体包括以下步骤：

b1、首先是以EDTA脱钙液处理样本，用石蜡包埋脱钙后的标本；

b2、粗修包埋后的样本，然后在切片机上制备组织薄片；

b3、将组织薄片贴片干燥，最后进行HE染色和Masson染色；

b4、在光学显微镜下观察，进行组织学评分。

实验结果表明：自骨髓外周结缔组织及骨组织至骨髓内，均见大量中性嗜酸性细胞呈弥散性浸润，成骨与破骨细胞均大量分布，破骨细胞周围有大量深紫色的炎症细胞，骨小梁明显减少，死骨形成。

综上，本发明使用的骨折内固定方案作用稳定，对照组大鼠的骨折在一个月的时候能够正常愈合，感染组的骨折端一个月时发生内固定松动，骨折愈合不良或不愈合，很好的模拟了人体感染导致骨愈合不良的疾病模型。

本发明使用的细菌感染局部效果确切，选取的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株采用局部种植制造感染病灶的方法，影像学和病理检测等实验结果表明制造内植物局部感染效果明确，显著影响骨折愈合，骨折端延迟愈合或不愈合，内固定出现松动的表现，大鼠局部组织细菌培养结果阳性明确了感染灶是由种植的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株导致。

本发明使用的局部种植细菌导致全身感染症状轻，选取的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株局部种植后，动物的全身情况例如体温、体重、饮食及活动等没有显著改变，实验室检测全身炎症指标稍高，符合人体内植物低毒感染的临床表现，避免使用金黄色葡萄球菌，造成局部乃至全身的急性化脓性感染的情况发生，能够很好的用于模拟体内的急性以及重度内植物感染。

本发明提供了一个骨折内固定感染耐药的模型，生物膜的形成是细菌定植在假体表面产生耐药特性的重要机制之一，体外实验结果表明，本发明使用的表皮葡萄球菌(RP62A)菌株具有很强的生成生物膜的能力，动物实验对细菌污染的钛合金钢板进行检测，发现钛合金钢板表面存在细菌生物膜，表明本发明制造的内固定感染模型通过细菌生物膜产生对抗菌素耐药的作用。

本发明提供了一种骨折内固定合并低毒感染的动物模型，目前国内的专利中未有报道，该实验方法设计严谨，极大程度地模拟骨折内固定合并低毒感染，该方法切实可行能够为骨折内固定合并低毒感染提供治疗模板和检测指标，造模后大鼠适合长期饲养，减少因为动物中途死亡造成的经济和时间上的损失。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。