阅读说明：本技术 一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用 (Probe for capturing hirudin polypeptide and application thereof ) 是由 曹秀君 国锦琳 聂应 罗莎杰 张佳斌 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种捕获水蛭素类多肽的生物识别探针的制备方法及应用。本发明通过在磁性固相载体表面修饰配基,间接固定凝血酶,极大程度保留其生物活性,所获得的探针可结合多种检测器实现水蛭素类多肽的提取和测定,具有选择性高、快速灵敏、稳定性好、适用性广、干扰小、重复利用率高和环境友好等优势。(The invention discloses a preparation method and application of a biological recognition probe for capturing hirudin polypeptides. According to the invention, the biological activity of thrombin is retained to a great extent by modifying the aglucon on the surface of the magnetic solid phase carrier and indirectly fixing the thrombin, and the obtained probe can be combined with various detectors to realize the extraction and determination of hirudin polypeptides, and has the advantages of high selectivity, rapidness, sensitivity, good stability, wide applicability, small interference, high repeated utilization rate, environmental friendliness and the like.)

一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用

技术领域

本发明属于多肽检测领域。

背景技术

水蛭素类多肽是具有与天然水蛭素相同或相似的化学结构，分子量为5～7kDa的二价直接凝血酶抑制剂，可同时作用于凝血酶的活性部位和底物识别部位。水蛭素是从水蛭唾液中分离纯化的一种由65～66个氨基酸组成的单链多肽化合物，包含HV 1，HV 2，HV 3三种变异体，是迄今最有效的凝血酶天然特异性抑制剂，类似的还有从菲牛蛭中提取的菲牛蛭素和从山蛭中分离的山蛭素。天然水蛭素产量较少，不利于临床的推广，通过基因工程技术生产的重组水蛭素，如来匹卢定、地西卢定等在临床中起到理想的疗效。研究表明，水蛭素类多肽抗凝抗栓作用强于肝素，在处理诸如心脑血管疾病、肿瘤、眼科疾病、妇科疾病、周围神经损伤等病例方面显示出巨大的优势。

现阶段，水蛭素类多肽的含量测定基本上采用生物活性法，主要有凝血酶滴定法、生色底物法、光散射法、纤维蛋白原平板法、凝血酶时间法，从药物质控模式的适用性来看，生物检测技术由于与安全性和有效性关联密切，往往比化学成分检测更具实际价值，但也有自身的缺陷：a)定量灵敏度低，当目标多肽浓度很低时，滴定法、时间法难以检出；b)定量重复性差，测定结果易受游离凝血酶活力、环境温度和底物浓度等因素的影响。c)前处理过程繁复，自动化程度不高。也有采用色谱质谱联用技术，但杂质干扰大，且无法评价水蛭素类的抗凝血活性。

免疫磁珠富集技术，是以磁珠(有时也称为“磁性微球”或“磁微粒”)作为固相载体，结合特定抗体(或抗原)，从液相环境分离目的物质的技术。磁珠可分为2部分：1)核心部分是磁性物质，如γ-Fe₂O₃、Fe₃O₄和MeFe₂O₃；2)外层由生物大分子或环氧树脂、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸或琼脂糖等大分子包裹，保证磁性的密封性良好，不易出现漏磁现象。磁珠外表还分布有特殊的活性基团，常见的活性基团有羧基或活化羧基、氨基、巯基、甲苯磺酸基和环氧基等，能通过共价或非共价方式结合抗体(或抗原)。

免疫磁珠富集技术不仅纯度高，且对样品活性几乎无损坏。目前免疫磁珠富集技术已广泛应用于特定细胞、微生物、蛋白和核酸片段的分离与检测。将其用于水蛭素类多肽的分离与检测，具有良好前景。

针对目的物质制备合适的磁珠，是达到有效富集的关键，也是难点。一般来说，制备免疫磁珠过程需要关注磁珠的大小、表面活性基团的选择、配基的选择、偶联量、封闭物、封闭方法、保存等等多个方面。有报道将凝血酶偶联到带有氨基末端的磁性微粒，从水蛭干品浸出液中分离纯化水蛭素(应用凝血酶偶联磁微粒技术对水蛭类药材中抗凝血酶活性的检测，中国医学生物技术应用杂志，2002)，但该方法存在明显的缺点：即凝血酶与氨基末端的连接是通过共价键(一般为-CO-NH-)连接，前者与水蛭素结合的位点可能被封闭或半封闭于磁性微粒的氨基末端，进而结合水蛭素的效率较低。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种捕获水蛭素类多肽效率高的探针。

本发明的技术方案如下：

一种捕获水蛭素类多肽的探针，所述探针由磁性固相载体、凝血酶配基和凝血酶组成；

其中磁珠与配基通过位于磁性固相载体表面的活性基团进行共价或非共价化学连接；

凝血酶配基与凝血酶进行非共价化学连接。

如前述的探针，所述配基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6任一所示，或在SEQ IDNO.1～6的3’或5’末端添加6～18个T碱基。

优选的，所述配基的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或8所示。

SEQ ID NO.1～8与序列的对应关系如下：

SEQ ID NO.1	5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’
		SEQ ID NO.2	5’-TGGTTGGTGTGGTTGG-3’
SEQ ID NO.3	5’-TGGTTGGTGTGGTTGGT-3’
		SEQ ID NO.4	5’-GGTTGGTGTGGTTGGT-3’
SEQ ID NO.5	5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’
		SEQ ID NO.6	5’-TAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’
SEQ ID NO.7	5’-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’
		SEQ ID NO.8	5’-TTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’

如前述的探针，所述磁性固相载体为以磁性物质为核心，外层包覆了聚合物或生物大分子的磁珠；

优选的，所述磁性固相载体为：聚苯乙烯磁珠、琼脂糖磁珠、二氧化硅磁珠、MOF金磁珠、MOF汞磁珠或MOF铅磁珠。

如前述的探针，所述活性基团是羧基或活化羧基、氨基、巯基、甲苯磺酸基或环氧基；

或，所述活性基团为链霉亲和素、生物素或吡啶二硫化物。

如前述的探针，所述磁性固相载体的直径为0.2-25μm。

如前述的探针，所述水蛭素类多肽为水蛭素、山蛭素、菲牛蛭素或重组水蛭素。

一种分离水蛭素类多肽的方法，它是使用前述探针从溶液中分离水蛭素类多肽的方法。

如前述的方法，包括如下步骤：

1)前述探针与水蛭素类多肽接触；

2)将探针与溶液分离；

3)使用三氟乙酸溶液洗脱探针上的水蛭素类多肽。

如前述的方法，步骤3)的三氟乙酸溶液浓度为0.01M。

一种水蛭素类多肽的检测方法，包括如下步骤：取待检样品，再用前述的分离方法对水蛭素类多肽进行分离，再使用色谱法、色谱质谱联用法、凝血酶滴定法、生色底物法、光散射法、纤维蛋白原平板法或凝血酶时间法等方法进行检测。

术语“活化”指：对基团进行化学修饰，使其能够直接与其他基团相连接。例如，本领域常见的羧基活化方式：用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)联用，活化羧基得到活性基团，后者可直接与游离氨基生成酰胺键。

有益效果：

本发明的探针，通过在磁性固相载体表面修饰配基，间接固定凝血酶，极大程度保留了凝血酶的生物活性，结合水蛭素类多肽的效率高，能应用于痕量水蛭素类多肽的检测，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1探针示意图。

图2 3μm聚苯乙烯羧基磁珠扫描电镜图。

图3 10μm琼脂糖羧基磁珠扫描电镜图。

图4 25μm琼脂糖NHS磁珠扫描电镜图。

图5重组水蛭素r-HV 2的捕获效果对比图。

具体实施方式

说明：下述实施例中的试剂、磁珠均为市售品。

实施例1探针的制备(3μm聚苯乙烯羧基-配基-牛凝血酶)

步骤1：偶联链霉亲和素。50mg聚苯乙烯羧基磁珠(3μm，图1)、5mgEDC与1mg链霉亲和素分散至1mL MES缓冲溶液中，30℃下旋转混合，反应6小时，用磁铁分离出反应产物，重新分散至0.1％的BSA溶液中，封闭6个小时后，用PBS缓冲液清洗5遍，制备得3μm链霉亲和素修饰的聚苯乙烯磁珠。

所述的聚苯乙烯磁珠，指的是核心为多孔聚苯乙烯微球，磁性颗粒嵌在孔内，外层包覆聚丙烯酸的磁珠，表面分布羧基。

步骤2：修饰凝血酶配基。将步骤1制备的磁珠与配基以50mg∶1μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到3μm配基修饰的聚苯乙烯磁珠。

所述凝血酶配基如下：5’biotin-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)。

步骤3：固定凝血酶。将上述50mg磁珠和5μg牛凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得3μm聚苯乙烯羧基-配基-牛凝血酶探针。

实施例2探针的制备(10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶)

步骤1：偶联链霉亲和素。100mg琼脂糖羧基磁珠(10μm，图2)、5mg EDC与2mg链霉亲和素分散至1mL MES缓冲溶液中，30℃下旋转混合，反应6小时，用磁铁分离出反应产物，重新分散至0.1％的BSA溶液中，封闭6个小时后，用PBS缓冲液清洗5遍，制备得10μm链霉亲和素修饰的琼脂糖磁珠。

所述琼脂糖羧基磁珠，是指由琼脂糖封闭磁性物质，带有羧基的磁珠。

步骤2：修饰凝血酶配基。将步骤1制备的磁珠与配基以100mg∶2μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到10μm配基修饰的琼脂糖磁珠。

所述凝血酶配基如下：5’biotin-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)。

步骤3：固定凝血酶。将上述100mg磁珠和10μg牛凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶探针。

实施例3探针的制备(25μm琼脂糖NHS-配基-牛凝血酶)

步骤1：偶联链霉亲和素。100mg琼脂糖NHS磁珠(25μm，图3)与2mg链霉亲和素分散至1mL MES缓冲溶液中，30℃下旋转混合，反应6小时，用磁铁分离出反应产物，重新分散至0.1％的BSA溶液中，封闭6个小时后，用PBS缓冲液清洗5遍，制备得25μm链霉亲和素修饰的琼脂糖磁珠。

所述琼脂糖NHS磁珠，是指由琼脂糖封闭磁性物质，带有NHS基团(属于活化的羧基)的磁珠。

步骤2：修饰凝血酶配基。将步骤1制备的磁珠与配基以100mg∶2μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到25μm配基修饰的琼脂糖磁珠。

所述凝血酶配基如下：5’biotin-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)。

步骤3：固定凝血酶。将上述100mg磁珠和10μg牛凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得25μm琼脂糖NHS-配基-牛凝血酶探针。

实施例4探针的制备(1μm聚苯乙烯SA-配基-人凝血酶磁珠)

步骤1：修饰凝血酶配基。将1μm聚苯乙烯SA磁珠与配基以100mg∶2μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到1μm配基修饰的聚苯乙烯磁珠。

所述的聚苯乙烯磁珠，指的是核心为多孔聚苯乙烯微球，磁性颗粒嵌在孔内，外层包覆聚丙烯酸，表面的羧基偶联了SA(链霉亲和素)的磁珠。

所述凝血酶配基如下：5’biotin-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)。

步骤2：固定凝血酶。将上述100mg磁珠和10μg人凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得1μm聚苯乙烯SA-配基-人凝血酶探针。

实施例5探针的制备(2μm聚苯乙烯氨基-配基-人凝血酶磁珠)

步骤1：修饰凝血酶配基。将2μm聚苯乙烯氨基磁珠与配基以100mg∶2μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到2μm配基修饰的聚苯乙烯磁珠。

所述的聚苯乙烯磁珠，指的是核心为多孔聚苯乙烯微球，磁性颗粒嵌在孔内，外层包覆聚丙烯酰胺的磁珠，表面分布氨基。

所述凝血酶配基如下：5’-CHO-TTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.7)。

步骤2：固定凝血酶。将上述100mg磁珠和10μg人凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得2μm聚苯乙烯氨基-配基-人凝血酶探针。

实施例6探针的制备(200nm MOF金-配基-人凝血酶磁珠)

步骤1：修饰凝血酶配基，将200nm MOF金磁珠与配基以100mg∶2μmol比例混合，分散在PBS缓冲液中，常温下震摇1小时，产物用去离子水清洗5遍，得到200nm配基修饰的MOF金磁珠。

所述MOF金磁珠是由聚多巴胺封闭磁性物质，外层由刚性有机配体和金属构筑三维金属有机骨架(MOF)，通过原位还原，将金固定在MOF中的磁珠。

所述凝血酶配基如下：

5’-SH-TTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGGT-3’(SEQ ID NO.8)。

步骤2：固定凝血酶，将上述100mg磁珠和10μg人凝血酶分散于Tris-HCl缓冲液中，30℃下旋转混合，反应30分钟，用Tris-HCl缓冲液清洗5遍，最终得200nm MOF金-配基-人凝血酶探针。

实施例7重组水蛭素r-HV 2的捕获(10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶，血清样本)

步骤1：样本加标，取血清样本0.1mL，用Tris-HCl缓冲液稀释为1mL，加入重组水蛭素r-HV 2标样100μg。

步骤2：磁性固相萃取，在步骤1的加标溶液中，投入10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶磁珠10mg，30℃下旋转混合，吸附60分钟，利用磁铁将磁珠与溶液分离，弃去溶液。将磁珠用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，然后加入0.01M三氟乙酸溶液0.1mL，30℃下旋转混合，洗脱60分钟，取出上清液，待测。

实施例8重组水蛭素r-HV 2的捕获(25μm琼脂糖NHS-配基-牛凝血酶，唾液样本)

步骤1：样本加标，取唾液样本0.1mL，用Tris-HCl缓冲液稀释为1mL，加入重组水蛭素r-HV 2标样100μg。

步骤2：磁性固相萃取，在步骤1的加标溶液中，投入25μm琼脂糖NHS-配基-牛凝血酶磁珠10mg，30℃下旋转混合，吸附60分钟，利用磁铁将磁珠与溶液分离，弃去溶液。将磁珠用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，然后加入0.01M三氟乙酸溶液0.1mL，30℃下旋转混合，洗脱60分钟，取出上清液，待测。

实施例9重组水蛭素来匹卢定的捕获(10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶，血清样本)

步骤1：样本加标，取血清样本0.1mL，用Tris-HCl缓冲液稀释为1mL，加入重组水蛭素来匹卢定标样100μg。

步骤2：磁性固相萃取，在步骤1的加标溶液中，投入10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶磁珠10mg，30℃下旋转混合，吸附60分钟，利用磁铁将磁珠与溶液分离，弃去溶液。将磁珠用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，然后加入0.01M三氟乙酸溶液0.1mL，30℃下旋转混合，洗脱60分钟，取出上清液，待测。

实施例10重组水蛭素r-HV 2的捕获对比例(10μm琼脂糖羧基-配基-牛凝血酶与10μm琼脂糖羧基-牛凝血酶)

步骤1：样本加标，取去离子水0.1mL，用Tris-HCl缓冲液稀释为1mL，加入重组水蛭素r-HV 2标样100μg。

步骤2：磁性固相萃取，在步骤1的加标溶液中，投入A探针或B探针10mg，30℃下旋转混合，吸附60分钟，利用磁铁将磁珠与溶液分离，弃去溶液。将磁珠用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，然后加入0.01M三氟乙酸溶液0.1mL，30℃下旋转混合，洗脱60分钟，取出上清液，HPLC检测。

说明：

A探针：10μm琼脂糖羧基磁珠-配基-牛凝血酶(以实施例2的方法制备)；

B探针：10μm琼脂糖羧基磁珠-牛凝血酶。

HPLC检测参数：

色谱柱：C4(4.6×250mm，5μm，300A)；流动相：A为乙腈/水/三氟乙酸＝10/90/0.1，B为乙腈/水/三氟乙酸＝50/50/0.1；梯度程序：0～2min，B为0％，2～35min，B为0～100％，35～40min，B为100％；检测波长：250nm。

检测结果见图5，通过A探针吸附，洗提液中出现了r-HV 2的色谱峰，通过B探针吸附，洗提液中未出现r-HV 2的色谱峰，说明了凝血酶直接固定于磁珠上，对低浓度的水蛭素吸附能力有限，在HPLC中不能检出。

本实施例表明，本发明的探针通过引入配基，显著提高了探针对水蛭素类多肽的捕获效率。

综上，本发明的探针对水蛭素的结合效率高，能检测痕量水蛭素，应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都中医药大学

<120> 一种捕获水蛭素类多肽的探针及其应用

<130> GY041-2020P019641CC

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggttggtgtg gttgg 15

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<400> 8

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