阅读说明：本技术 人抗体IgG的CH2片段突变体及应用 (CH2 fragment mutant of human antibody IgG and application ) 是由 龚睿 于 2020-03-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人抗体IgG的CH2片段突变体及应用,包括CS-20-1、CS-20-2。新的CH2骨架在单克隆抗体、Fc融合蛋白或者直接以该骨架开发抗体的研发和临床使用上具有重要意义,包括提高其稳定性后有利于降低生产、纯化成本,有利于降低单抗聚集引发的免疫原性等。(The invention discloses a CH2 fragment mutant of human antibody IgG and application thereof, which comprises CS-20-1 and CS-20-2. The new CH2 skeleton has important significance in the research and development and clinical use of monoclonal antibody, Fc fusion protein or antibody developed directly with the skeleton, including raising its stability, lowering production and purification cost, reducing immunogenicity caused by aggregation of monoclonal antibody, etc.)

人抗体IgG的CH2片段突变体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种人抗体IgG的CH2片段突变体及应用。

背景技术

抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。同时，基于CH2片段开发的小型化抗体以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，可以识别全长抗体难以识别的表位。

然而，以野生型CH2片段为骨架开发的抗体存在自身局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种人抗体IgG的CH2片段突变体及应用。本发明以CH2为骨架，对其进行修饰改造，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的新克隆，命名为CS-20-1，CS-20-2。

为实现上述目的，本发明提供了一种人抗体IgG的CH2片段突变体，其氨基酸序列如SEQ No.2所示，其核酸序列如SEQ No.1所示，命名为CS-20-1。

本发明还提供了一种人抗体IgG的CH2片段突变体，其氨基酸序列如SEQ No.4所示，其核酸序列如SEQ No.3所示，命名为CS-20-2。

CS-20-1、CS-20-2可用于开发Fc融合蛋白和单克隆抗体。

本发明提供的CS-20-1，CS-20-2骨架，是通过以下方法得到：首先，构建CH2的易聚集区氨基酸随机突变噬菌体展示文库。随后利用特异性抗CH2抗体对该噬菌体展示文库进行筛选，获得候选克隆。最后，经过鉴定得到CS-20-1，CS-20-2。

CS-20-1、CS-20-2相对于CH2在N末端(EU编号，231-237)七个氨基酸(APELLGG)被删除，同时CS-20-1进行了六个点突变(F241L，L242C，V264K，N276K，V395K和K334C)，CS-20-2进行了七个点突变(F241L，L242C，F243L，V264K，N276K，V395K和K334C)。氨基酸截短突变和引入L242C，K334C是基于之前的研究而引入的突变，其余突变是经过本专利中建库筛选的方法获得的，这些点突变可以减少蛋白易聚集区而提升蛋白的抗聚集能力。

本发明的有益效果：

新的CH2骨架在单克隆抗体、Fc融合蛋白或者直接以该骨架开发抗体的研发和临床使用上具有重要意义，包括提高其稳定性后有利于降低生产、纯化成本，有利于降低单抗聚集引发的免疫原性等。

附图说明

图1为m01s，CS-20-1和CS-20-2蛋白易聚集区域预测图。

图2为CS-20-1，CS-20-2蛋白与CH2蛋白的存在形式分析(单体、二聚体等)。

图3为圆二色谱分析CS-20-1、CS-20-2分子构象的分析图。

图4为CS-20-1、CS-20-2与CH2蛋白的抗聚集性比较图。

图5为CS-20-1、CS-20-2和CH2蛋白与识别CH2结构域的anti-CH2单抗的亲和力比较图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1:候选克隆筛选

候选克隆筛选之前需要构建CH2的C末端噬菌体展示文库，构建方法同现有中国专利申请文献(201810525234.6)，CH2的序列也在此专利中有公开。

1.Panning实验

1)接TG1菌5管，各2mL。约4h可摇到OD₆₀₀＝0.6。

2)噬菌体库先经过80℃加热10min，然后在室温放置20min。

3)封闭Panning孔板

a)吸出包被的蛋白，用PBS洗一遍孔板；

b)在BSA孔中加入噬菌体，5个孔共10¹²个，牛奶终浓度为2％，每孔100μL。在anti-CH2孔加入3％牛奶，每孔200μL；

c)封闭1h，37℃。

4)结合

BSA孔噬菌体转移到anti-CH2孔，2h，37℃。

5)洗脱

弃噬菌体液，PBST洗10遍(每进行一轮加5遍洗涤次数，共筛选4轮)。

6)感染

在超净台中，Panning孔板每孔加入100μL的TG1菌液，共5个孔，放37℃，15min，吸出菌液转移到新的管中，共4轮，2mL菌液。

7)涂平板

将感染后的2mL菌液混匀，从中取出20μL菌液，加入到480μL培养基中，得到10³稀释菌液，再从中取50μL到450μL培养基中，得到10⁴稀释菌液，以此类推，稀释10⁴、10⁵、10⁶和10⁷，涂10⁵、10⁶和10⁷平板。

8)37℃活化30min。

9)扩增

将感染后，取过样的菌液加入100μL的40％葡萄糖使菌液葡萄糖终浓度为2％，加入2μL氨苄抗生素，37℃摇菌3h。

10)加入M13KO7辅助噬菌体20μL，37℃放置45min，每15min摇一摇。

11)5000rpm，10min收菌，10mL的2×YT重悬，加入10μL的氨苄和卡纳抗生素，30℃摇过夜。

12)第二天沉淀噬菌体，确定浓度，供下一轮Panning实验使用。

13)筛选完成后，挑取单克隆用于单克隆Phage ELISA实验。

2.单克隆Phage ELISA

1)包被anti-CH2抗体4℃过夜。

2)配3％牛奶。

3)包被的平板将包被蛋白甩干，用PBS洗一遍，加入100μL的3％牛奶封闭1h。

4)甩掉封闭液，拍干。

5)加入一抗，每孔加入50μL，37℃温育1h。

6)甩干一抗，PBST手洗一遍，每孔100μL；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。

7)二抗为anti-M13KO7抗体，1:5000稀释，15mL，牛奶浓度为1％(但是这一次没有加入牛奶)，37℃温育1h。

8)甩干二抗，PBST手洗一遍，每孔100μL；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。

9)每孔加入50μL的HRP显色液。

10)显色。

11)读数较高为我们筛选到的候选克隆，随后送测序。

我们筛选出两个较好的克隆，命名为CS-20-1和CS-20-2，测序结果：CS-20-1，其核酸序列如SEQ No.1所示，其氨基酸序列如SEQ No.2所示。CS-20-2，其核酸序列如SEQ No.3所示，其氨基酸序列如SEQ No.4所示。

基于蛋白质易聚集区域预测软件Tango，我们对m01s，CS-20-1和CS-20-2蛋白的易聚集区进行预测，发现m01s蛋白上有三个明显的易聚集区，突变后获得的CS-20-1和CS-20-2蛋白的易聚集区明显减少，如图1所示。

实施例2：CS-20-1、CS-20-2分子构象与存在形式(单体、二聚体等)

AKTA分析CS-20-1、CS-20-2存在形式：将纯化后的CS-20-1、CS-20-2蛋白浓缩到1mg/mL，PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液，过Column Superdex75 Increase 10/300GL，其中，流速为1mL/min，进而对其存在形式进行检测。

结果如图2所示，CS-20-1、CS-20-2及CH2蛋白浓度为1mg/mL，通过ColumnSuperdex75 Increase 10/300GL(GE公司)进行分析，对照标准曲线可以发现，蛋白分子量均约为14kDa，结果表明它们以单聚体形式存在。

CD检测蛋白分子构象：将CS-20-1与CS-20-2蛋白稀释到0.3mg/mL，PBS(pH7.4)为对照，在近紫外端(波长λ＝190nm～260nm)不同波长条件下检测其圆二色性，进而分析蛋白二级结构。

结果如图3所示，CS-20-1、CS-20-2蛋白浓度为0.3mg/mL，在近紫外端(波长λ＝190nm～260nm)不同波长条件下检测其平均摩尔椭圆度，在λ＝218nm处有一个明显波谷，表明上述蛋白二级结构为β-折叠，与CH2基本一致。

实施例3：CH2与CS-20-1、CS-20-2稳定性与抗聚集性比较

抗聚集性分析：将CH2与CS-20-1、CS-20-2蛋白终浓度调整为1mg/mL，在50℃水浴锅处理，每隔一定时间取样，在λ＝320nm处检测吸光度并记录数据。

比较与CH2蛋白的抗聚集性强弱，从图4中可以发现CS-20-1、CS-20-2信号上升趋势较缓，表明其抗聚集能力更好。

实施例4：ELISA测定CH2和CS-20-1、CS-20-2与anti-CH2的结合力

1)包被anti-CH2抗体，4℃过夜。

2)配3％牛奶。

3)包被的平板将包被蛋白甩干，用PBS洗一遍，加入100μL的3％牛奶封闭1h。

4)甩掉封闭液，拍干。

5)CS-20-1、CS-20-2和CH2以1μM为起点，三倍倍比稀释，稀释6个稀释度，作为一抗。

6)加入一抗，每孔加入50μL，37℃温育1h。

7)甩干一抗，PBST手洗一遍，每孔100μL；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。

8)二抗为HRP-anti-His抗体，1:5000稀释，15mL，牛奶浓度为1％，37℃温育1h。

9)甩干二抗，PBST手洗一遍，每孔100μL；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。

10)每孔加入50μL的HRP显色液。

11)显色。

通过ELISA分析anti-CH2单抗分别与CS-20-1、CS-20-2和CH2亲和力，从图5中可以发现经过改造后的CS-20-1、CS-20-2与anti-CH2单抗亲和力与CH2几乎相同，证明其构象未发生改变。

序列表

<110> 武汉班科生物技术股份有限公司

<120> 人抗体IgG的CH2片段突变体及应用

<130> 20200306

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 309

<212> DNA

<213> CS-20-1 DNA(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgtcagtct tgtgcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60

gaggtcacat gcgtggtgaa agacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaaatgg 120

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180

agcacgtacc gtgtggtcag caaactcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagtg caccatctcc 300

aaagccaaa 309

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> CS-20-1 PRT(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Ser Val Leu Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Lys Asp Val Ser His Glu

20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

50 55 60

Val Val Ser Lys Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

85 90 95

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> CS-20-2 DNA(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgtcagtct tgtgcctgcc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60

gaggtcacct gcgtggtgag cgacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaaatgg 120

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 180

agcacgtacc gtgtggtcag caaactcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 240

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagtg caccatctcc 300

aaagccaaa 309

<210> 4

<211> 103

<212> PRT

<213> CS-20-2 PRT(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Ser Val Leu Cys Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

1 5 10 15

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ser Asp Val Ser His Glu

20 25 30

Asp Pro Glu Val Lys Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

35 40 45

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

50 55 60

Val Val Ser Lys Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

85 90 95

Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100