一种比伐卢定粗品的hplc纯化方法
阅读说明：本技术 一种比伐卢定粗品的hplc纯化方法 (HPLC purification method of bivalirudin crude product ) 是由 陈艳明 韦怀福 南志远 于 2018-06-26 设计创作，主要内容包括：本发明描述了一种比伐卢定HPLC纯化方法,主要提供比伐卢定粗品HPLC纯化方法,目前比伐卢定纯化的纯度及收率较低,难以符合用于制备比伐卢定制剂的原料标准。本发明的技术方案是,通过优化比伐卢定粗品的浓度、HPLC流动相组成及梯度等纯化条件,最后得到了高纯度的比伐卢定,同时收率大大提高。(The invention describes a bivalirudin HPLC purification method, and mainly provides a bivalirudin crude product HPLC purification method. According to the technical scheme, purification conditions such as concentration of a bivalirudin crude product, HPLC mobile phase composition and gradient are optimized, so that high-purity bivalirudin is obtained finally, and meanwhile, the yield is greatly improved.)
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种比伐卢定HPLC纯化方法，具体为利用乙腈-水-三 氟乙酸系统，结合反相色谱填料纯化制备比伐卢定，收集主峰进行后处理减压浓缩、冷冻干 燥得到高纯度的比伐卢定。
背景技术
比伐卢定(Bivalirudin，商品名Angiomax)是人工合成抗凝药物，由美国Medicines公 司申请，2000年12月经FDA批准在美国上市，比伐卢定属于凝血酶直接抑制剂，其抗凝成 分为水蛭素衍生物C端20个氨基酸残基肽，通过结合催化剂位点和循环及凝血酶血块的阴 离子输出位点而直接抑制凝血酶。早期的临床研究显示，比伐卢定抗凝疗效确切，且出血事 件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比更为安全，对于接受经皮冠状动脉介入治疗 (PCI)的患者，比伐卢定可用于替代肝素，并且随着对比伐卢定临床试验的不断研究，其在 别的适应症方面亦表现出了不错的治疗效果，因此比伐卢定的未来应用前景极为广阔。
关于比伐卢定的制备方法，国内外已有大量报道。合成方法包括了固相合成、液相合成、 固液相合成，但是针对比伐卢定粗品的HPLC纯化系统完整的方法，文献报道较少。根据已 公开文献显示，比伐卢定的产品纯度仅能达到98.5％，按照国家药品标准YBH02852011中有 关物质不得超过1.5％的规定，制备的比伐卢定API已经接近杂质限度，在有效期2年内，长 时间存储很容易造成有关物质检查项不合格。针对上述比伐卢定原料纯化工艺存在的问题， 本发明提供一种比伐卢定的HPLC纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种比伐卢定的HPLC纯化方法。该纯化制备方法解决了目前纯 化比伐卢定API纯度低，收率不高的问题。
本发明包括比伐卢定粗品纯化前几种不同浓度的调整，而浓度的不同对纯化效率及比伐 卢定纯度不同；本发明在于流动相中三氟乙酸浓度的优化，三氟乙酸浓度为0.01％～0.1％时 收率明显提高；本发明在于梯度洗脱方法优化后，收率和纯度大幅提高，纯度可达99.5％以 上。
具体的，本发明所述的纯化方法，包括以下步骤：
(1)粗品用纯化水、30％～50％乙腈溶解，过滤，制成粗品溶液，随后将粗品溶液注入 高效液相色谱仪。
(2)纯化条件：流动相A为0.01％～0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为流动相为0.01％～ 0.1％三氟乙酸乙腈溶液，色谱柱为YMC-Actas Triart Prep。
(3)洗脱液经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到比伐卢定API。
其中，步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用纯化水配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，型号：Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度＞99.0％。
或步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用30％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测其纯度＞99.0％。
或步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用纯化水配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度＞99.5％。
或步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.01％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.01％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度＞99.0％。
其中，步骤(2)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.03％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.03％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度＞99.0％。
其中，步骤(2)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.05％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度99.0％。
或步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度大于99.8％。
或步骤(1)中高效液相色谱条件：
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
步骤(2)中：
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：40ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度＞99.0％。
附图说明
图1：比伐卢定粗品有关物质检测结果
图2：实施例1纯化后比伐卢定有关物质检测结果
图3：实施例2纯化后比伐卢定有关物质检测结果
图4：实施例4纯化后比伐卢定有关物质检测结果
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅用于说明本说明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
粗品溶液：用纯化水配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，型号：Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度98.5％，附图2。
实施例2
粗品溶液：用30％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测其纯度99.6％。附图3。
实施例3
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的比伐卢定粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：40ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度99.5％。
实施例4
粗品溶液：用50％乙腈配制2mg/ml的粗品溶液
仪器：waters制备型高效液相色谱仪，Waters 2545
色谱柱：YMC-Actus Triart Prep C18-s，规格250×30mm，S-10μm，12nm，
流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，
流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，
监控波长：215nm
流速：20ml/min
洗脱梯度：
进样量：50mg/针
收集主峰洗脱液，检测纯度100％，附图4。
小结：本发明所描述了比伐卢定粗品HPLC纯化的方法，通过对比伐卢定粗品纯化前不同 浓度、HPLC纯化时不同流动相配比的优化，使纯化后的比伐卢定纯度大大提高，收率增加， 从而降低其生产成本，进而会直接影响到该药物的市场价格，惠及用药患者。