阅读说明：本技术 免疫检测方法 (Immunoassay method ) 是由 施志欣 吴和晋 李政亮 许纯渊 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种免疫检测方法,其包含：提供碟片；提供捕获抗体于基板上；添加样品于分流槽；施加第一转速,以从分流槽传送包含抗原的样品至反应槽；施加第二转速,以沉降样品于基板,使样品中的抗原与捕获抗体结合而获得第一复合物；利用毛细作用力,使样品从反应槽流出并填满流道；施加第三转速,以将样品从流道传送至废液槽；提供侦测抗体于基板上,使侦测抗体与第一复合物结合而获得第二复合物；以及检测第二复合物的来自局域性表面等离子体共振的光谱信号。(The invention provides an immunodetection method, which comprises the following steps: providing a disc; providing a capture antibody on a substrate; adding a sample into the shunting groove; applying a first rotational speed to transfer the sample comprising the antigen from the split channel to the reaction channel; applying a second rotation speed to settle the sample on the substrate, so that the antigen in the sample is combined with the capture antibody to obtain a first complex; enabling the sample to flow out of the reaction tank and fill the flow channel by using capillary force; applying a third rotational speed to transfer the sample from the flow channel to the waste reservoir; providing a detection antibody on the substrate, and enabling the detection antibody to be combined with the first compound to obtain a second compound; and detecting a spectral signal from the localized surface plasmon resonance of the second complex.)

免疫检测方法

技术领域

本发明是关于一种免疫检测方法，特别是关于一种能够简化注入试剂的步骤的局域性表面等离子体共振的免疫检测方法。

背景技术

由于医疗科技的进步，人们的寿命得以延长。在各式医疗科技中，提供用以协助诊断的医学数据的检测技术极为重要。目前，检测技术与仪器集中于大型医院，造成受试者需特地前往医院并经历漫长的检测流程，导致受试者的检测意愿降低。

因此能够使检验更快速的完成的重点照护检验(Point-of-Care Testing)因应而生。其中，又以能将各种检测仪器微小化、容易携带、检验辨识度高且操作方便的微流体碟片(microfluidic disk)为主流产品。同时，微流体碟片还能搭配离心平台以减少反应时间。

举例而言，结合酵素连结免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及微流体碟片的碟片式ELISA(CD ELISA)能够通过液体依序释放及是统微小化的优点，来减少整体检测时间。然而碟片式ELISA 存在灵敏度不足及注入试剂的步骤繁琐等缺点。是故，仍需提供一种能够简化注入试剂步骤的免疫检测方法。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的为提供一种免疫检测方法，结合免疫分析法、微流体碟片、能够放大光学信号的局域性表面等离子体共振 (Localized surface plasmonresonance，LSPR)技术，并以微流体功能搭配程序自动化控制马达转速，达到简化注入试剂的步骤、自动化注液与移液。除此之外，在公知技术是将微孔盘放置于大型离心机中旋转，利用离心沉降的方式增加试剂与基材的反应效率，然而却需要额外的设备与特殊的旋转台机构。本发明的方法只需要单一马达即可完成包含离心沉降的所有检测流程，不须外加的设备，能降低成本并提高产品竞争力。

本发明的目的是为提供一种免疫检测方法，其包含：提供碟片，所述碟片包含分流槽及复数个碟片单元，各碟片单元包含以流道连接至废液槽的反应槽、以及设置于反应槽内的基板，基板包埋复数个第一纳米粒子；提供捕获抗体(capture antibody)于基板上；添加样品于分流槽；施加第一转速，以从分流槽传送包含抗原(antigen)的样品至反应槽；施加第二转速，以沉降样品于基板，使样品中的抗原与捕获抗体结合而获得第一复合物；利用毛细作用力，使样品从反应槽流出并填满流道；施加第三转速，以将样品从流道传送至废液槽；提供侦测抗体(detection antibody) 于基板上，以结合侦测抗体与第一复合物为第二复合物；以及检测第二复合物的来自局域性表面等离子体共振的光谱信号，复数个第一纳米粒子震动而产生局域性表面等离子体共振。其中，第二转速大于第一转速。

本发明的免疫检测方法具有下述优点：

(1)本发明的方法通过改变离心力与毛细作用力的平衡，有效且可调地注入试剂，相较于需以人力重复注入多种试剂于微滴定盘的方法，能够简化制程、缩短检测时间与降低人力操作误差及成本。同时，公知的碟片设计中，反应槽与碟片单元设置于同平面上，但是易存在空气排出不良的问题。然本发明的反应槽则沿径向凸出设置，因此能有效地通过立体结构排除空气。本发明亦通过调整平面上的碟片单元与反应槽之间的连接流道宽度，以使碟片兼顾排气顺畅与试剂所需体积较小的优点。

(2)本发明的方法利用马达控制转速将反应槽中的液体完整移出并清洗，且利用离心力与毛细作用力排空液体的方法使得基板表面维持于接近干燥的状态，使后续光学检测时，能获得正确且稳定的数据。

附图说明

图1为本发明的优选实施例的碟片示意图。

图2为本发明的优选实施例的碟片局部放大图。

图3为本发明的优选实施例的碟片态样图。

图4为本发明的优选实施例的碟片示意图。

图5为本发明的优选实施例的碟片清洗流程示意图。

图6为本发明的优选实施例的反应流程示意图。

图7为本发明的优选实施例的等分试样示意图。

图8为本发明的等分试样的分析图。

图9为本发明的等分试样的分析图。

图10为本发明的等分试样的角速度分析图。

图11为本发明的等分试样的变异系数分析图。

图12为本发明的等分试样的定量装置示意图。

图13为本发明的填充液体的流道示意图。

图14为本发明的填充液体的转速分析图。

图15为本发明的填充液体的流态影像图。

图16为本发明的填充液体的反应槽影像图。

图17为本发明的液体排空的流道示意图。

图18为本发明的液体排空的分析图。

图19为本发明的虹吸流道的设置示意图。

图20为本发明的虹吸流道的关键转速分析图。

图21为本发明的虹吸流道的残留水分的影像图。

图22为本发明的虹吸流道的残留水分的分析图。

图23为本发明的侦测面积范围的示意图。

图24为本发明的培育转速的分析图。

图25为本发明的培育转速的分析图。

图26为本发明的清洗次数的分析图。

图27为本发明的精准度的分析图。

符号说明：

S51～S58、S601～S624：步骤

1：碟片

100、400：碟片单元

110、410：分流槽

110a：圆心

120、420、2020：反应槽

121：基板

122：反应区

130、430、2030：废液槽

140、440：储存槽

150：流道

160：端部

2401：水膜

2601、2602：部份

401：等分盘

402：毛细管

450：虹吸通道

451：计量通道

452：连接通道

453：排气通道

701：捕获抗体

702：牛血清蛋白

703：抗原

704：侦测抗体

D、L：长度

h、H：宽度

具体实施方式

为使上述目的、技术特征及实际实施后的效益更易于使本领域普通技术人员理解，将于下文中以实施例搭配图式更详细地说明。

在一实施例中，可提供碟片，碟片可包含分流槽及复数个碟片单元。碟片单元的数量可大于等于8个。各碟片单元可包含以流道连接至废液槽的反应槽以及设置于反应槽内的基板。各碟片单元可包含储存槽。基板上可设置复数个第一纳米粒子。复数个第一纳米粒子可为纳米金粒子或纳米银粒子。与废液槽连接的流道的第一部分的延伸方向通过碟片的圆心。可提供捕获抗体于基板上。

在一实施例中，可施加第一转速，利用第一转速产生的离心力驱动碟片时的离心压力与样品的表面张力的压差阻力，以使样品从分流槽传送至反应槽。样品可包含抗原。可施加第二转速，利用第二转速产生的离心力沉降样品于基板上，使样品与捕获抗体接触，并使样品中的抗原与捕获抗体特异性结合为第一复合物。可利用毛细作用力，使样品从反应槽流出并填满流道，然而样品并未溢出流道，亦即尚未被传送至废液槽。可施加第三转速，以利用第三转速所造成的角速度的欧拉力，将样品从流道传送至废液槽。

在一实施例中，可提供侦测抗体于基板上，以特异性结合侦测抗体与第一复合物为第二复合物可检测第二复合物的局域性表面等离子体共振的光谱信号。复数个第一纳米粒子可震动而产生局域性表面等离子体共振。侦测抗体可包含复数个第二纳米粒子，复数个第一纳米粒子与复数个第二纳米粒子可震动以偏移光谱信号的波长，进而放大光谱信号，以增进光谱信号的灵敏度。

可于传送捕获抗体、样品或侦测抗体后，传送清洗液，以将残余液体移除，进而增进检验方法的精准度。

在一实施例中，在提供捕获抗体于基板上的步骤与提供侦测抗体于基板上的步骤之间，可包含提供阻隔剂于基板上的步骤。捕获抗体、抗原、侦测抗体、清洗液以及阻隔剂可为所属技术领域中具有通常知识者为公知的捕获抗体、抗原、侦测抗体、清洗液以及阻隔剂。

在本发明的优选实施例中，所选用的免疫检测药剂如下：

(A)单株小鼠抗心肌钙蛋白I(Monoclonal mouse anti-cardiac troponin I，HyTest/19C7)，浓度：3.6mg/ml。

(B)重组人类心肌钙蛋白I(Recombinant human cardiac troponin I， HyTest/8RTI7)，浓度：0.9mg/ml。

(C)单株小鼠抗心肌钙蛋白I(Monoclonal mouse anti-cardiac troponin I，HyTest/16A11)，浓度：8.3mg/ml。

(D)磷酸盐缓冲液(BSA buffer)。

(E)10X磷酸盐缓冲液(10X PBS)，其包含：80g/L NaCl、2g/L KCl、14.4g/L NaHPO4与2.4g/L KH2PO4。

(F)界面活性剂Tween-20

(G)含有磷酸盐缓冲液界面活性剂Tween-20(Phosphate Buffered SalineTween-20，PBST)，其包含1X PBS与Tween-20。

(H)食用色素。

在本发明的优选实施例中，所选用的微流体碟片材料如下：

(A)生物性兼容胶带(3M，美国)。

(B)聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)扇形检测片(昆良工业股份有限公司，台湾地区)。

(C)带有纳米金粒子玻璃基材(希华晶体科技股份有限公司，台湾地区)。

(D)微滴定盘(希华晶体科技股份有限公司，台湾地区)。

在本发明的优选实施例中，详细操作步骤如下。

配制与合成

选用面积为0.07cm²的圆形玻璃片作为基板，选用捕获抗体的浓度为 3000ng/cm²。另，将抗原浓度序列稀释为0、64、320、1600、8000、40000、200000pg/mL。取1mM，20mL四氯金酸溶液加热至沸腾后，快速加入 38.8mM，2mL的柠檬酸钠溶液，加热至溶液颜色为红色，获得金纳米粒子(Au NPs)。将每100μL的AuNPs与浓度为1mg/ml，1uL的辣根过氧化物酶(SA-HRP)混合，获得辣根过氧化物酶-金纳米粒子([email protected] NPs)。

碟片设计

参照图1，碟片1具有设置于碟片中心的分流槽110以及8个碟片单元 100。碟片1为圆形时，碟片具有圆心110A。分流槽110连接所有碟片单元 100以等分试剂(aliquoting)。碟片单元100具有反应槽120、废液槽130、储存槽140及流道150。反应槽120内设置涂布金纳米粒子的基板。首先，试剂会暂存于储存槽140，而后藉离心力使各试剂于反应槽120内反应，并藉毛细现象使试剂流出反应槽并填满流道150，再利用离心力使试剂传送至废液槽130。因此，使用者仅需单次注入试剂，便能使试剂自动等量分配至多个反应槽120中，以保留试剂于反应槽120中培育，使试剂披覆在基板。

参照图2，(A)是反应槽的正视图，(B)及(C)是反应槽的侧视图。长度 L为可在离心平台上旋转侦测的最小长度，长度D为侦测面积的直径。长度L可为1mm以上，若小于1mm时，无法做旋转侦测；若大于10mm时，产生使用试剂体积用量大的负面效果。反应槽120内设置有基板121，以形成反应区122。

参照图3，由于基板能设置于反应槽内的不同处，故分别以Type A、 Type B与TypeC的三种态样比较设置处对于检测的影响，结果如表1所示。

表1

	Type A	Type B	Type C
				试剂所需体积	多	少	少
排除试剂的效果	无残留液体	有残留液体	无残留液体
				检测结果	有趋势	无明显趋势	有趋势

参照表1，可知Type C的设置方法所需的试剂体积少、容易排除试剂而不易使试剂残留，检验结果具有趋势。因此，选用Type C。

接续上述，提供以雕刻机加工的PMMA，使PMMA上存在流道，即获得碟片单元。参照图4，(A)是碟片示意图，(B)是碟片单元示意图，(C) 是碟片单元局部放大示意图，(D)是碟片单元的实品图。

如(A)所示，碟片包含等分盘401和8个碟片单元400。等分盘401包含中心分流槽410，等分盘401的外围设置8个毛细管402，毛细管402连接碟片单元400并将等分的液体输送到碟片单元400。如(B)所示，碟片单元400 包含沿轴向突出的平面微流体结构与反应槽420。平面微流体结构包括储存槽440、连接反应槽的连接信道452、计量信道451、虹吸信道450、排气信道453与废液槽430。如(C)所示，径向设置的反应槽420包括涂有金纳米粒子的玻璃基板421与塑料帽423。

比较例

使用已批覆纳米金粒子的玻璃基板取代微滴定盘底部的透明塑材的微滴定盘，并进行免疫吸附反应，如下所述：

(1)以60W微波30分钟，使捕获抗体披覆于带有纳米金粒子的玻璃上，移除试剂并清洗4次。

(2)于微滴定盘内依序加入牛血清蛋白(BSA)、抗原、金纳米粒子标定的侦测抗体，通过2700rpm高转速旋转20分钟以沉积于孔盘底部的玻璃上，并于沉积后移除试剂并清洗4次。

(3)将孔盘翻转180度，透过高速离心将液体甩干，以减少表面水渍，并以波长550nm进行光学量测。

实例

将LSPR技术结合至微流体离心式平台，在平台上进行试剂的离心、沉降与移除，再于光学仪器中检测，详细步骤如下所述：

(1)披覆步骤

将捕获抗体以1000rpm的低转速传送至反应槽，以60W微波30分钟，使其批覆于带有纳米金粒子的玻璃上。提高转速至2700rpm以移除未结合的捕获抗体至废液槽。再于储存槽加入作为清洗液的PBST，以1000rpm 的低转速驱动试剂至反应槽进行清洗，清洗完毕后，使PBST通过虹吸流道。最后提高转速至2700rpm，使PBST排至废液槽。

(2)培育与清洗步骤：

将牛血清蛋白以1000rpm离心而传送至反应槽，以2700rpm离心20 分钟沉降其于玻璃上。结束后提高转速至2700rpm将未结合的牛血清蛋白排至废液槽。再于储存槽加入PBST，以1000rpm的低转速驱动PBST至反应槽清洗，清洗完毕后，使PBST通过虹吸流道。最后，提高转速至2700 rpm，使PBST排至废液槽。利用相同的离心速度、离心时间与离心次数，分别再将抗原以及[email protected] NPs沉降。

(3)检测步骤：

将碟片于光学仪器上以波长550nm检测。

参照图5与图6。步骤S51～S54是注入试剂后使试剂填满，再使试剂爬升以排空试剂，步骤S55～58是注入清洗液使清洗液填满，再使清洗液爬升以排空清洗液。

步骤S601～S603，在反应槽620中将捕获抗体结合于基板。步骤S604～S606用清洗液将未结合于基板上的捕获抗体移除。步骤S607～S609 提供阻隔剂在基板上。步骤S610～S612，用清洗液将未结合于基板上的阻隔剂移除。步骤S613～S615，结合抗原与捕获抗体。步骤S616～S618，用清洗液将未结合于捕获抗体上的抗原移除。步骤S619～S621，结合侦测抗体与抗原，形成侦测抗体-抗原-捕获抗体的三明治结构。步骤S622～S624，用清洗液将未结合于抗原上的侦测抗体移除。

接续上述，进行比较例与实例的分析。

分析一、等分试样

参照图7，其是本发明的优选实施例的等分试样示意图。代表一种试剂只需注入一次，可减少检验的整体注入次数以大幅节省时间与人力。选用不同直径的信道时，液体突破信道的时间不一，而误差源自θ方向的填充。角加速度越大，液体填满槽体且突破通道的时间差较小，液体体积量变异小。

参照图8，(A)是角加速度对液体分流的分析图，(B)是角加速度对突破时间差的分析图。如(A)所示，可知槽体深度0.5mm时，深度较小所以阻力较大，填满中心分流槽的时间较长，而变异系数高。如(B)所示，可知在槽体深度足够的情况，填满中心分流槽体所需的时间较短。

接续上述，选用直径为0.2、0.4与0.8mm的通道进行流量的误差分析，其结果如图9所示。可知，以越小的通道连接时，在第一个信道和最后一个信道流出的体积量的误差小。因此固定通道管径为0.2mm，分析突破时间差、流量与变异系数，其结果如第10与11图所示。

参照图10，(A)是各角加速度的突破时间差的分析图，(B)是各角加速度的流量的分析图。

参照图11，其是本发明的等分试样的变异系数分析图，各角加速度下得到的Δt和Qr相乘的数值与变异系数C.V.相关。提高马达加速时的角加速度能缩减填满中央分流槽的时间，使液体迅速填满针头前端且突破流出，同时若使用较窄的通道，能使液体的分流的等量分配变异系数可控制于3～5％。

参照图12，(A)与(B)是分别为具有及不具有定量装置的碟片。由于等分存在误差，可能造成全部的试剂排至废液槽。因此将反应槽旁增加定量装置，将多余的试剂流至废液槽。

分析二、填充液体

若入口流道设计较为宽深，流道阻力小而流量增加，液体迅速往反应槽流入，堵塞排气通道致无法排气，难以完整填充反应槽，产生液体累积，造成液体在流道的高度高于虹吸流道，使全部的液体排入废液槽。因此，本发明利用如图4(C)所示的径向凸出的反应槽423以及液体宽度h 与连接通道的宽度H的比值来克服排除空气的问题。

参照图13，从入口流道流出的液体宽度定为宽度h，连接通道宽度为宽度H，不同转速下有不同的比值(h/H)。其中，连接通道宽度H代表反应槽的入口宽度。

固定液体流入反应槽的入口流道的水力直径为0.4mm，改变转速为 1000、2000、3000、4000与5000rpm，h/H为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mm，且探讨各转速下的流量，其结果如图14所示。

可知进入反应槽的体积流量在填充过程中极为重要。在低体积流速 (Q<300)，液体完全充满反应槽，排气良好，过量的液体通过计量通道溢流到废液槽。在中等体积流速(300<Q<900)，反应室因空气排出不良，没有完全充满液体，液体流过毛细管顶部并进入废液槽，同时过量的液体也通过计量通道流入废液槽。在高体积流速(900<Q)，连接通道中观察到阻止液体流入反应槽的大气泡，大部分液体流入废液槽，反应室未被填充。可知，填充效果是根据流体设计变化，另外还与比值(h/H)有关。若比值(h/H)小于0.3，则可成功填充。

参照图15，(A)、(B)与(C)是分别为转速为1000rpm、转速为2000 rpm～4000rpm以及5000rpm下的流態影像图。

如(A)所示，液体顺利排气而成功保留。如(B)所示，连续的液体将气泡占用应填入的液体体积，使液体因为虹吸而排至废液槽。如(C)所示，排气孔阀堵住，导致反应槽无法填满液体，填充反应槽失效，液体排至废液槽。

参照图16，(A)与(B)是分别为转速1000rpm下的反应槽的俯视图与侧视图，且(C)与(D)是分别为转速5000rpm下的反应槽的俯视图与侧视图。当转速为1000rpm时，液体顺利充填反应槽，而当转速提升至5000rpm时，液体无法充填反应槽。

分析三、液体排空

参照图17，(A)是经亲水表面处理的液体排空示意图，(B)是未经亲水表面处理的液体排空示意图，(C)部分是液体排空的流道示意图。

如(A)所示，液体自动通过虹吸作用通过虹吸流道的最高点并至废液槽前，再提高马达转速，反应槽内的液体会跟着连接通道内的液体一并带至废液槽。惟，表面处理的效果随着时间失效。如(B)所示，为避免试剂直接通过虹吸通道进入废液槽，反应槽与虹吸通道的溢流点之间存在径向差ΔR。径向差ΔR定义为离心后水位平衡处到虹吸最高点的差。依据径向差ΔR设定安全的累积高度，以避免液体通过虹吸通道直接进入废液槽，并使液体驱动。液体通过表面不改质流道的抬升的移动距离随马达角加速度和流道水力直径d_H而变化，通过改变转速使液体受动量而抬升。如(C)所示，流道的长度在高转速(ω_H>2000rpm)时须高于反应槽的液面，宽度与深度皆为0.4mm。当马达转至高转速时，液体将因离心力驱动而进入反应槽中；再将马达转速降至低转速(ω_L<10rpm)，此时离心力小于毛细管力，因此流道中的液体将因毛细管力驱动而填满流道；最后将马达提升至高转速，反应槽中的液体因虹吸现象而排至废液槽。

设定转速4000rpm，再将转速降至0rpm，设定10000、40000、70000、 100000rpm/s的角加速度，并设定倾角为15、30、45度，观察液体抬升的高度，其结果如图18所示。

参照图18，(A)是角加速度分析图，(B)是倾角分析图。可知较高的角加速度产生较大的欧拉力，液体抬升的高度随的增加。当水力直径愈大，阻力愈小，液体抬升高度愈大，反之亦然。同时，倾角的角度影响抬升所需的角加速度，可知倾角的角度愈大，液体抬升高度愈大，反之亦然。

即使让液体通过虹吸通道的最高点而将液体排至废液槽，但若施加的转速未达关键转速，仍会有液体残留于连接废液槽前端的流道内，导致后续注入并离心液体后，会直接将液体排至废液槽，无法保留液体作离心沉降的培育。是故，针对虹吸流道的设置方式进行分析。

参照图19，(A)与(B)分别为虹吸流道的设计1与设计2，进行分析的结果如图20所示，液体排空的虹吸通流道的水力直径愈大时，会因阻力较小，使液体排空的关键转速下降；反之亦然。同时，可知设计2的虹吸通道，其延伸方向为离心方向，亦即与废液槽130连接的流道150的端部160 的延伸方向，通过碟片的圆心110A，因此关键转速相较于设计1的虹吸通道更低。

由于进行LSPR感测时，玻璃表面须为干燥。因此在本发明中，利用上述的液体排空方式，使反应槽中的液体通过虹吸通道排至废液槽。

参照图21，可知玻璃表面存在残余水分造成水膜2401。接着，对存在水膜与完全干燥的基板进行分析，结果如图22所示，虽水膜仅使信号略为增加，与完全干燥的结果相近。

分析三、试剂的体积

Anti [email protected] NPs的吸光值(O.D.)固定，STD相同浓度下，STD 体积加入量越多，最后数据越高，实验与垂直沉积于底部感测玻璃的试剂的高度有关，其结果如图23所示。

参照图23，(A)表示试剂的培育高度为高度H1，(B)表示本发明的实例的具体大小，其中离心平台上旋转侦测的最小长度的长度L是为10mm，侦测面积的直径的长度D为3mm，且试剂的培育高度的高度H1是为3mm。其中，所需试剂的体积V_total是为反应槽体积V_chamber、连接通道体积V_channel以及流道体积V_{disk channel}的总和。反应槽体积V_chamber为圆形面积再乘以厚度，原设计(如(C)所示)的直径的长度D为6；而新设计(如(D)所示)的长度 D为3。连接通道体积V_channel为长方形面积再乘以厚度，原设计与新设计的长度L皆为10，且厚度为4。流道体积V_{disk channel}则为部份2601与部分2602 的体积总和(如(E)所示)，部份2601的体积为长乘以宽，再乘以深；部份 2602的体积则为虹吸流道的体积，其体积设定为1。本发明的实例能有效减少试剂用量。

同时，将比较例与实例所需至试剂体积进行分析，其结果如表2所示。

表2

试剂体积(μL)	比较例	实例
			捕获抗体	100	71
阻隔剂	100	71
			抗原	100	71
侦测抗体	100	71
			清洗液	1600	284

如表2所示，可知本发明的实例能够大幅减少使用试剂的体积。

分析五、试剂的培育转速和时间

选用培育时间为20分钟，选用转速2700rpm作为最佳的离心沉降培育转速。将抗原浓度序列稀释为0、64、320、1600、8000、40000、200000 pg/mL在离心式免疫分析仪上做检测，其结果如图24所示，可知比较例与实例的吸光值仍存在差异。为了提升实例的侦测信号，提升培育转速，其结果如图25所示。

参照图25，可知增加转速能提升信号。当以转速5000rpm离心沉降培育时，无论培育时间为10分钟或20分钟，信号并未再加以提升，因此，选用转速5000rpm作离心沉降培育10分钟。

分析六、反应的清洗次數

由于免疫吸附法反应检测需要经过多次的清洗，以避免非特異性的蛋白吸附或残留于反应槽。是故，分析清洗次數的影响。于沉降后移除试剂并分别以清洗液PBST清洗1次和4次，结果如图26所示。可知清洗1 次的信号略大于清洗4次的信号，然而差异不大。

分析七、精准度

进行本发明的实例与比较例的分析，其结果如图27所示。可知本发明的实例与比较例趋势相似，因此实例的分析能力与微滴定盘相近。

综上所述，虽然本发明已以上述实施例及实例具体描述本发明的免疫检测方法，然而本发明本领域普通技术人员应理解的是，可在不违背本发明的技术原理及精神下，对实施例作修改与变化。因此本发明的权利保护范围应如权利要求所述。