阅读说明：本技术 用于光学葡萄糖测定物的经改性的葡聚糖 (Modified dextrans for optical glucose assays ) 是由 特里·T·丹格 瑟伦·奥斯莫 杰斯帕·斯文宁·克里斯滕森 约瑟夫·汉纳 罗伯特·麦金利 于 2018-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及竞争性葡萄糖结合亲和力测定物,该竞争性葡萄糖结合亲和力测定物包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体(通常为甘露聚糖结合凝集素)和用参考荧光团标记的经改性的葡萄糖类似物(通常为葡聚糖)。在某些实施方案中,葡萄糖类似物是葡聚糖并且偶联到参考荧光团和猝灭剂染料(例如六甲氧基结晶紫-1)两者。任选地,参考荧光团相对于测定荧光团蓝移。(The present invention relates to a competitive glucose binding affinity assay comprising a glucose receptor (typically mannan-binding lectin) labeled with an assay fluorophore and a modified glucose analog (typically dextran) labeled with a reference fluorophore. In certain embodiments, the glucose analog is dextran and is coupled to both the reference fluorophore and a quencher dye (e.g., hexamethoxy crystal violet-1). Optionally, the reference fluorophore is blue-shifted relative to the assay fluorophore.)

用于光学葡萄糖测定物的经改性的葡聚糖

相关申请的交叉引用

本申请依据美国专利法第120条要求2017年4月28日提交的美国专利申请序列号15/581,416的优先权，该美国专利申请的内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及光学分析物测定物，尤其涉及用于感测葡萄糖的荧光竞争性结合测定物。

背景技术

保持体内正常葡萄糖水平是糖尿病患者可以避免与糖尿病相关的长期问题如视网膜病变、循环问题和其他后遗症的关键方式。为此，糖尿病患者定期监测其血糖水平，以例如优化胰岛素给药。在这种情况下，已经开发出用于监测血糖水平的多种系统和方法。一种策略使用荧光化合物来检测葡萄糖水平，例如通过竞争性结合测定物来检测，在该测定物中，葡萄糖和荧光团标记的葡萄糖配体/类似物竞争葡萄糖受体的结合位点，并且所产生的荧光变化被转化成葡萄糖浓度。

在某些竞争性葡萄糖结合测定物中，将葡聚糖用作可置换的葡萄糖配体。在此类测定物中，葡聚糖可用亲脂性(和阳离子)染料如六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)标记。然而，大量(例如大于10个)偶联到葡聚糖的柔性聚-(1,6)-葡萄糖主链上的亲脂性染料分子的存在可导致此类标记的葡聚糖分子呈水溶性较低的构象，这可导致这些分子沉淀。此外，此类染料诱导的构象变化可促使经标记的葡聚糖处于更亲脂的状态，这可导致葡聚糖与葡萄糖受体的结合能力的不良改变以及影响其福斯特共振能量转移( Resonance EnergyTransfer,FRET)效率。此外，在常规系统中，染料可分子内屏蔽在葡聚糖上，这种现象可导致测定物的校准随着时间的推移而变化，从而在测定中引入不稳定性。

参考染料也用在某些荧光测定物中，以便跟踪实验装置的变化，例如光源波动、光路(将光耦合到光导中)的变化、机械扰动(如弯曲)、温度变化等。传统上，光学感测系统或基于荧光的感测系统已利用相对于测定荧光团红移的参考荧光团。然而，通过使用具有比所需能量更多能量的较低波长的光来激发荧光团，荧光分子中的电子将从电子基态(S0)跃迁到第二激发态(S2)而不是跃迁到第一电子激发态(S1)的风险增大。处于S2的分子比处于S1的相同分子发生分解的可能性要高得多。因此，如果荧光团被激发至S2而不仅是S1，则将发生更快的光漂白。

因此，本领域需要利用经选择用于提高测定稳定性的试剂和材料的光学葡萄糖测定物。本文所公开的发明例如通过使用被设计成包括多重标记的葡萄糖类似物/配体(例如，用促进亲水性的试剂偶联/标记的葡聚糖)和/或蓝移参考荧光团的测定物来满足这种需要。如下所讨论，被设计成包括多重标记的葡萄糖类似物和/或蓝移参考荧光团的葡萄糖测定物表现出诸如测定稳定性的材料特性的改善。

发明内容

本发明提供了用于葡萄糖测定物的优化材料和方法。如下文所详细讨论的，可以选择和/或改性某些荧光葡萄糖测定物中的成分，以便例如优化用于形成测定复合物的成分群的亲水-疏水平衡。这样做时，产生了改善的测定物，在这些测定物中，随着时间的推移，较少发生测定物成分的不期望构象变化。葡萄糖测定复合物的例示性改性包括通过将葡聚糖与经选择以防止葡聚糖变得不当地带负电荷或带正电荷的试剂偶联而对该分子进行改性的那些。此类改性产生比其未改性的等同物更稳定的测定物。另外，在参考荧光团被选择用于亲水性/疏水性特征和/或相对于测定荧光团或指示荧光团蓝移(而不是可能由于低波长激发而变得对光不稳定的典型的红移参考荧光团)的实施方案中，可以提高参考荧光团和测定复合物的整体稳定性。

本发明的实施方案包括竞争性葡萄糖结合亲和力测定物，以及制备和使用这些测定物的方法。通常，该测定物包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体以及用参考荧光团和猝灭剂染料两者标记的葡萄糖类似物。在本发明的实施方案中，葡萄糖受体可选自由以下项组成的组：甘露聚糖结合凝集素(MBL)、伴刀豆球蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸。在典型的实施方案中，葡萄糖受体是甘露聚糖结合凝集素。在例示性实施方案中，葡萄糖类似物是葡聚糖，测定荧光团和参考荧光团是Alexa Fluors^TM，并且猝灭剂染料是六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)。在一些实施方案中，测定荧光团和参考荧光团各自选自由以下项组成的组：Alexa Fluor^TM 647(AF647)和Alexa Fluor^TM 700(AF700)，并且测定荧光团和参考荧光团是不同的。通常，在此类实施方案中，复合物的一种或多种成分(例如葡聚糖)与被选择成具有一定的电荷和/或亲水性/疏水性特征的试剂偶联或用该试剂标记，该电荷和/或亲水性/疏水性特征有助于该试剂在复合物内的稳定性，并因而有助于葡萄糖感测复合物的整体稳定性。本发明的实施方案还包括制备和使用这些改善的葡萄糖测定物的方法。

在本发明的其他实施方案中，该测定物包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体和用参考荧光团标记的葡萄糖类似物，其中参考荧光团相对于测定荧光团蓝移。在一些实施方案中，葡萄糖类似物还用猝灭剂染料(例如六甲氧基结晶紫-1，HMCV1)标记。葡萄糖受体可选自由以下项组成的组：甘露聚糖结合凝集素(MBL)、伴刀豆球蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸。在一个实例中，葡萄糖受体是甘露聚糖结合凝集素。通常，葡萄糖类似物是葡聚糖，并且测定荧光团和参考荧光团是Alexa Fluors^TM。通常，荧光团和猝灭剂染料形成福斯特共振能量转移(FRET)对。荧光团和/或猝灭剂染料通常也是水溶性的。在一个典型的实施方案中，测定荧光团和参考荧光团各自选自由以下项组成的组：Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 647(AF647)和Alexa Fluor 700(AF700)，其中参考荧光团具有比测定荧光团更短的波长。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的一些实施方案，但是它们是以例示而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，并且本发明包括所有这些修改。

附图说明

现在参见附图，在附图中相同的参考标号通篇表示对应的部分：

图1A-C示出了根据本发明的一个或多个实施方案的具有荧光配体的PreciSense^TM光学传感器(PreciSense^TM Optical)。图1A示出了猝灭剂从染料变成荧光团并且省略了参考荧光团。图1B是示出了吸光度和发射光谱的变化的曲线图。图1C是示出了葡萄糖浓度测量值和传感器剂量反应损失(DR损失)的曲线图。

图2A-C示出了根据本发明的一个或多个实施方案的具有组合配体的PreciSense^TM光学传感器。图2A示出了标记到与染料猝灭剂相同的配体上的参考荧光团，从而消除了对参考载体的需要。图2B是示出了吸光度和发射光谱的变化的曲线图。图2C是示出了葡萄糖浓度测量值和传感器剂量反应损失(DR损失)的曲线图。

图3是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的AF594-MBL/AF647-dex测定物的ORS SITS数据的曲线图。

图4是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的AF594-MBL/AF647-HMCV1-dex测定物的ORS SITS数据的曲线图。该测定物用于如下面的图5-7所示的大鼠实验76和77。

图5是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自大鼠研究76：大鼠#1，ORS传感器#2的数据的曲线图。传感器在低-高过渡期间校准，第一钳夹。

图6A-D示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自大鼠研究76：对应于钳夹1(图6A)、钳夹2(图6B)和钳夹3(图6C)的大鼠#1，ORS传感器#2的数据。图6D为外植体的图片。

图7A-B示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自大鼠研究77的数据。图7A示出了测定荧光团和参考荧光团的基线。注意稳定的测定基线和参考基线。图7B示出了来自大鼠研究77的葡萄糖浓度测量值。

图8是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自AF594/AF647测定物的数据的曲线图。

图9是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自AF594MBL/AF647-Dex和AF594/AF647-HMCV1-Dex测定物：AF594与AF647荧光之间的最佳比率的数据的曲线图。

图10是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的来自用于AF594-MBL/647-Dex和AF594-MBL/AF647-HMCV1-Dex测定物的滤波器配置的数据的曲线图。

图11示出了根据本发明的一个或多个实施方案的用于AF594/647测定物的滤波器配置。

图12A-C提供了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖(MLD)的标记度(DOL)测定的实例。图12A是示出了HMCV1和AF647的归一化吸光度光谱的曲线图。图12B是示出了缀合物#478(HMCV1 X5和AF647 X15)和#479(HMCV1 X15和AF647 X5)的吸光度光谱的曲线图。图12C是示出了缀合物479(HMCV1 X15和AF647 X5)光谱以及HMCV1和AF647吸光度光谱的线性组合的曲线图。携带HMCV1和AF647的MLD缀合物的DOL包括：DOL#472(X10/X10)＝5.7/4.1；DOL#478(X5/X15)＝3.6/9.4；以及DOL#479(X15/X5)＝8.1/2.1。

图13是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的单标记葡聚糖性能的曲线图。该曲线图显示了五组传感器的剂量反应(DR)发展，所有传感器均在葡萄糖响应测定物中使用单标记的葡聚糖来构建。DR计算为相对于400mg/dL葡萄糖下的归一化强度而言，在40mg/dL葡萄糖与40mg/dL葡萄糖下的归一化强度之间的差值。相对于起始DR的DR损失在每天3％至6％之间。用HMCV1标记的葡聚糖仅表现出大剂量反应(DR)损失。

图14是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖性能(HMCV1-AF647-葡聚糖)的曲线图。

图15是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖性能(HMCV1-AF700-葡聚糖)的曲线图。

图16是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖性能(HMCV1-HMCV3-葡聚糖)的曲线图。

图17是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的多重标记的葡聚糖性能(HMCV1-葡聚糖-琥珀酰化)的曲线图。

图18是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的囊型传感器中不同染料和荧光团的归一化吸收和发射光谱的曲线图。

图19是示出了根据本发明的一个或多个实施方案的在囊型传感器中的具有不同DOL值、它们的DR和强度水平的组合配体的表格。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有专门术语、符号和其他科学词语或术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的存在实质性差异。本文描述或引用的许多技术和程序是很好理解的，并且常常由本领域的技术人员使用常规方法来采用。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请据此全文以引用方式并入本文。在典型实施方案的描述中，可以参考附图，附图形成该描述的一部分，并且在附图中，通过图示的方式示出了可以实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并可以进行结构改变。

血糖通常由糖尿病患者通过使用可商购获得的量热测试条或电化学生物传感器(例如酶电极)来监测，这两者均需要在每次进行测量时定期使用采血针式的器械来抽取适量的血液。这在经济方面以及在疼痛和不适方面给糖尿病患者带来了相当大的负担，尤其是在长期糖尿病患者中，这些患者必须定期使用采血针从指尖抽取血液。因此，已经提出了许多关于不需要从患者抽取血液的葡萄糖测量技术的建议。已观察到皮下体液中分析物的浓度与血液中分析物的浓度相关联，因此已经有关于使用位于皮下位置的葡萄糖监测装置的若干报道。对可以远程询问的用于葡萄糖的竞争性结合测定物的使用尤其受人关注。

测定竞争性结合的典型方法是使用基于接近度的信号产生部分/信号调制部分对(参见例如美国专利号6,232,120)，它通常是能量转移供体-受体对(包括能量供体部分和能量受体部分)。能量供体部分为光致发光的(通常为荧光的)。在此类方法中，使能量转移供体-受体对与待分析的样品(诸如皮下体液)接触。然后照射样品并检测所产生的发射。供体-受体对的能量供体部分或能量受体部分结合到受体载体上，而供体-受体对的另一部分(结合到配体载体上)和所存在的任何分析物竞争受体载体上的结合位点。当供体与受体合在一起时，能量转移在供体与受体之间发生，这产生能量供体部分的荧光的可检测寿命变化(降低)。另外，一定比例的由能量供体部分发射的荧光信号被猝灭。寿命变化因对分析物的竞争性结合而降低或甚至消除。因此，通过测量表观发光寿命，例如通过相位调制荧光测定法或时间分辨荧光测定法(参见Lakowicz，荧光光谱学原理(Principles ofFluorescence Spectroscopy),Plenum Press,1983，第3章)，可以测定物样品中分析物的量。

除了激发态的寿命之外，发射的荧光的强度也与葡萄糖浓度相关。与寿命测量形成对比，所测得的发射荧光强度受光源的强度以及测定物与光学系统之间的耦合的影响。因此，强度测量需要将内部参考荧光团结合到测定物中。参考荧光团必须与测定荧光团不同，不同的方式使得来自测定物的发射荧光和来自参考的发射荧光可以例如因具有不同的吸收光谱或发射光谱而彼此分开。参考荧光团可以是例如标记到人血清白蛋白(HSA)或基本上不结合到葡萄糖受体的另一大分子上的Alexa Fluor^TM 594(AF594)。Alexa Fluor^TM700(AF700)可与AF594同时被激发，因为它们的吸收光谱在光谱上重叠。AF594的发射光谱相对于AF700略微蓝移，这使得有可能在单独的波长区中检测它们各自的荧光发射。当它们同时被相同的光源激发时，光源强度的任何变化将等同地缩放来自AF594和AF700的荧光。因此，源自光源强度变化的任何影响可被抵消。对测定物和参考的发射荧光的激发和检测遵循从光学系统到测定物的相同一光学路径。因此，从参考中检测到的信号用作对光学询问系统与测定物之间的光学耦合的量度。源自光学耦合(例如准直)的变化的任何影响可被抵消。

当一个荧光团(即供体)的激发电子的能量传递到附近的受体染料即猝灭剂(非发射发色团)或具有与供体的发射光谱重叠的激发光谱的另一荧光团上时，发生称为福斯特共振能量转移(FRET)的特殊荧光特性。能量转移在没有光子出现的情况下发生，并且是供体与受体之间的长程偶极-偶极相互作用的结果。FRET的重要特征在于它发生在与生物大分子的尺寸相当的距离上。FRET效率为50％的距离(称为福斯特距离)通常在的范围内。范围从20至的福斯特距离便于进行竞争性结合研究。WO91/09312描述了采用基于葡萄糖的亲和力测定物(结合了能量转移供体-受体对)的皮下方法和装置，该测定物由光学装置远程询问。实例WO1997/19188、WO2000/02048、WO2003/006992和WO2002/30275各自描述了通过能量转移进行的葡萄糖感测，能量转移产生可以远程读取的光信号。

本文所公开的发明整体涉及光学测定物或基于荧光的测定物和分析物感测组合物。在本发明的例示性实施方案中，本发明的测定物、组合物、系统和方法是参考葡萄糖作为要测定其水平/浓度的分析物来描述的。然而，这仅是举例说明而非限制，因为本发明的原理、装置、系统和方法可用于感测和/或测定多种其他生理参数、试剂、特性和/或组合物的水平。

如本文所述，本发明的实施方案提供了传感器，这些传感器被设计成包括设置在传感器的特定区域中的组合物，以便为传感器提供增强的功能和/或材料特性。本公开还提供了制备和使用此类传感器的方法。本文所述的本发明的实施方案，诸如下面紧接着的段落中所讨论的那些实施方案，可适应于具有感测复合物的传感器中的多种成分并与这些成分一起实施，所述感测复合物产生可与分析物如葡萄糖的浓度相关联的光信号。许多这样的传感器和成分在例如美国专利号6,6761,527、7,228,159、7,884,338、7,567,347、8,305,580和8,691,517，以及美国专利申请公布号2008/0188723、2009/0221891、2009/018708、2009/0131773、2013/0060105和2014/0200336中有所公开，这些专利各自的内容以引用方式并入本文。

本文公开的发明具有许多实施方案。一个例示性实施方案是葡萄糖感测复合物，其包括参考荧光团、偶联到测定荧光团的甘露聚糖结合配体(例如，Alexa Fluor 647(AF647)或Alexa Fluor 700(AF700))；在测定物中用作葡萄糖类似物并偶联到参考荧光团的葡聚糖、增强葡聚糖亲水性的试剂，以及猝灭剂(例如六甲氧基结晶紫-1(HMCV1))。在该实施方案中，测定荧光团和猝灭剂形成福斯特共振能量转移(FRET)对。通常，荧光团和/或猝灭剂染料是水溶性的。任选地，荧光团的标记度(DOL)为至少4.1，并且猝灭剂染料的DOL为至少5.7。在本发明的一些实施方案中，增强葡聚糖亲水性的试剂为猝灭剂。任选地，葡聚糖由酸酐化合物改性(例如，以便将葡聚糖偶联到调节葡聚糖亲水性的部分)。通常，葡聚糖包括少于1500个葡萄糖单元。在本发明的一些实施方案中，葡萄糖感测测定复合物表现出每天小于2.5％的传感器剂量反应(DR)损失。

本发明的实施方案可包括竞争性葡萄糖结合亲和力测定物，该测定物包括用测定荧光团标记的葡萄糖受体，以及用参考荧光团(例如，Alexa Fluor 647(AF647)或AlexaFluor 700(AF700))和猝灭剂染料两者标记的葡萄糖类似物。在本发明的某些实施方案中，葡萄糖受体选自由以下项组成的组：甘露聚糖结合凝集素(MBL)、伴刀豆球蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸，葡萄糖类似物是葡聚糖，测定荧光团和参考荧光团是AlexaFluor，并且猝灭剂染料是六甲氧基结晶紫化合物。在典型的实施方案中，葡聚糖偶联到增强其亲水性的化合物或由化合物改性。

感测溶液(例如间质液或血液)中的葡萄糖的方法的另一个实施方案包括使溶液与葡萄糖感测复合物接触，该葡萄糖感测复合物包括参考荧光团、偶联到测定荧光团的甘露聚糖结合配体、被选择成在测定物中用作葡萄糖类似物并且进一步偶联到参考荧光团的葡聚糖。该复合物还包括增强葡聚糖亲水性的试剂，和猝灭剂。任选地，增强葡聚糖亲水性的试剂为猝灭剂。在该实施方案中，测定荧光团和猝灭剂形成福斯特共振能量转移(FRET)对。该方法包括观察葡萄糖感测复合物的指示葡萄糖存在的信号，然后将观察到的信号与葡萄糖浓度相关联。

本发明的又一个实施方案是葡萄糖感测复合物，该复合物包括偶联到测定荧光团的葡萄糖结合剂(例如甘露聚糖结合凝集素)和偶联到参考荧光团的葡萄糖类似物。在该实施方案中，被选择用于该复合物的参考荧光团相对于测定荧光团蓝移。通常，参考荧光团具有比测定荧光团低的波长。任选地，测定荧光团表现出比参考荧光团的波长大至少50纳米的波长。任选地，葡萄糖类似物进一步偶联到猝灭剂(例如六甲氧基结晶紫化合物)。在某些实施方案中，葡萄糖受体选自由以下项组成的组：甘露聚糖结合凝集素(MBL)、伴刀豆球蛋白A、葡萄糖半乳糖结合蛋白、抗体和硼酸；和/或葡萄糖类似物为葡聚糖(例如分子量在90kDa-110kDa之间的葡聚糖)。在某些实施方案中，测定荧光团和参考荧光团各自选自由以下项组成的组：Alexa Fluor 594(AF594)、Alexa Fluor 647(AF647)和Alexa Fluor 700(AF700)。通常，参考荧光团和猝灭剂是水溶性的，形成福斯特共振能量转移(FRET)对。

本发明的另一个实施方案是制备葡萄糖感测复合物的方法，该方法包括通过将葡萄糖结合剂(例如甘露聚糖结合凝集素(MBL))偶联到测定荧光团并将葡萄糖类似物(例如葡聚糖)偶联到参考荧光团来形成葡萄糖感测复合物。在该实施方案中，选择参考荧光团和测定荧光团，使得参考荧光团以相对于由测定荧光团发射的光蓝移的波长发射光。通常，测定荧光团表现出比参考荧光团的波长大至少50纳米的波长。通常，测定荧光团表现出与参考荧光团的波长相比不超过100纳米的波长。在某些情况下，进一步用琥珀酸酐处理葡萄糖类似物。通常，葡聚糖为约100kDa。在某些实施方案中，组合物表现出每天小于2.5％的传感器剂量反应(DR)损失。在一个实例中，荧光团的标记度(DOL)为至少4.1，并且猝灭剂染料的DOL为至少5.7。

本发明的另一个实施方案是一种感测溶液(例如间质液或血液)中的葡萄糖的方法，该方法包括使溶液与葡萄糖感测复合物接触，该葡萄糖感测复合物具有偶联到测定荧光团的葡萄糖结合剂和偶联到参考荧光团的葡萄糖类似物，其中参考荧光团被选择成相对于测定荧光团蓝移。该方法包括观察葡萄糖感测复合物的指示葡萄糖存在的信号，并将观察到的信号与葡萄糖浓度相关联。任选地，该方法包括用两种不同的光源激发参考荧光团和测定荧光团。通常，测定荧光团表现出与参考荧光团的波长相比不超过100纳米的波长，并且测定荧光团表现出比参考荧光团的波长大至少50纳米的波长。

本发明有多种变换。如本文所述，分析物受体通常为凝集素，它包括任何碳水化合物结合蛋白。在典型的实施方案中，葡萄糖受体是荧光团标记的甘露聚糖结合凝集素(MBL，也称为甘露糖/甘露聚糖结合蛋白，Sheriff等人，Structural Biology,1:789-794(1994)；Dumestre-Perard等人，Molecular Immunology,39:465-473(2002))。通常，凝集素在测定物中提供稳定的信号持续至少10天，更典型地持续至少14天。尤其优选的是，当将传感器植入人体中时，提供稳定的信号。令人惊讶的是，已发现MBL在葡萄糖测定物中稳定至少17天。

其他分析物受体或分析物结合部分也可以用在本文所述的测定物和传感器系统中。例如，分析物受体可以是来源于人体的人凝集素，包括人肺表面活性物质蛋白A(SP-A，Allen等人，Infection and Immunity,67:4563-4569(1999))、人肺表面活性物质蛋白D(SP-D，Persson等人，The Journal of Biological Chemistry,265:5755-5760(1990))或CL-43(人血清蛋白)。另选地，凝集素可以是以重组方式制造的凝集素或人源化动物凝集素，例如人源化牛凝集素。凝集素可以另选地是动物凝集素、鸟凝集素、鱼凝集素、脊椎动物凝集素、无脊椎动物凝集素(例如昆虫凝集素)或植物凝集素。合适的动物凝集素包括共凝集素、胶原凝集素-43(例如牛CL-43)、肺表面活性物质蛋白(肺胶原凝集素)、PC-凝集素(US2003/0216300、US 2004/0265898)、CTL-1(US 2010/179528)、角质细胞膜凝集素(Parfuemerie und Kosmetik 74,164-80)、CD94(Eur J Immunol 25,2433-7)、P35(同义词：人L-纤维胶凝蛋白，一组凝集素)(Immunol Lett 67,109-12)、ERGIC-53(同义词：MR60)(Mol Biol Cell,7,483-93)、HIP/PAP(Eur J Biochem 267,1665-71)、CLECSF8(Eur JImmunol 34,210-20)、DCL(一组凝集素)(申请号00231996/US)和GLUT家族蛋白，尤其是GLUT1、GLUT4和GLUT11(PNAS 97,1125-30)。另外的合适的动物凝集素在“Handbook ofAnimal Lectins:Properties and Biomedical Applications”，David C.Kilpatrick,Wiley 2000的附录A、B和C中示出。合适的植物凝集素或植物血凝素(PHA)包括伴刀豆球蛋白A和衍生自豌豆(pisum sativum)、甜豌豆(lathyrus odoratus)、兵豆(lensculinaris)、水仙花(narcissus pseudonarcissus)、蚕豆(vicia faba)和野豌豆(viciasativa)的那些。分析物受体也可以是周质葡萄糖/半乳糖结合受体、针对葡萄糖样分子产生的抗体、或硼酸。

如本文所述，分析物类似物可以包括结合到分析物受体的结合位点的多个碳水化合物部分或碳水化合物模拟部分。分析物类似物应具有足够高的分子量以防止从传感器逃逸，但又足够低，使得当分析物类似物结合到分析物受体时不会发生沉淀。分析物类似物可具有在25至250kDa范围内，更典型地介于90至120kDa之间的重量。在葡萄糖为分析物的典型实施方案中，葡聚糖用作可置换的葡萄糖类似物/配体。葡聚糖是由至多1500个葡萄糖单元组成的柔性大分子。在某些情况下，葡聚糖由大约600个葡萄糖单元(～100kDa)组成，或由500-700个葡萄糖单元组成。

其他分析物类似物和配体也可用在本文所述的例性示测定物和传感器系统中。分析物类似物可以是包括对MBL和类似凝集素具有不同亲和力的不同碳水化合物部分或碳水化合物模拟部分的合成聚合物。另选地，分析物类似物可以是碳水化合物-蛋白缀合物或碳水化合物-树状大分子缀合物。用于此类缀合物的合适碳水化合物的实例是单糖和低聚糖。合适的单糖是任选衍生化的四糖、戊糖、己糖、庚糖或更高级的同源醛糖或酮糖，例如任选衍生化的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、L-岩藻糖、D-果糖、D-塔格糖或D-山梨醇。合适的低聚物可以是直链或支链的均聚低聚物或混合低聚物，例如含有2至50个碳水化合物单元。

如本文所述，荧光团或荧色物是能够吸收特定波长的光能并在较长波长下重新发射光能的化学化合物。荧光团也可用于猝灭其他荧光染料的荧光或以甚至更长的波长传递它们的荧光(FRET)。通常，将Alexa Fluor^TM(AF)594、647和/或700用作用于分别标记葡萄糖类似物和葡萄糖受体的参考荧光团和测定荧光团。本领域的技术人员将理解，也可以使用适于光学葡萄糖测定物的其他荧光团，例如香豆素、罗丹明、呫吨、花菁和覆盖其他激发及发射波长的Alexa Fluor(例如AF350、AF405、AF488、AF532、AF546、AF555、AF568、AF594、AF680、AF750)。

不发射荧光的能量受体被称为猝灭部分。WO05/059037中描述的HMCV染料是适用于本发明的能量受体部分。这些染料是稳定化的羧碳正离子。在典型的实施方案中，将六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)用作猝灭剂/受体染料。另选地，QSY 21可用作能量受体部分，而AF594作为能量供体部分。

产生光信号的结合测定物通常应是可逆的，以使得可实现对分析物波动水平的连续监测。这种可逆性是使用不消耗测定物的组分的结合测定形式的特定优点。通常，传感器适于检测或测量体液(例如皮下体液)中的葡萄糖。期望传感器适合在体内使用。通常，该测定物能够测量在0至35mM葡萄糖范围的至少一部分内，通常在2至10mM葡萄糖范围内的血糖浓度。合适的检测技术包括FRET、荧光能量转移、荧光偏振、荧光猝灭、磷光、发光增强、发光猝灭、衍射或等离子体共振。通常，本发明的传感器结合了使用FRET技术产生光学读出的测定物。

如上所讨论，本领域需要具有增强的稳定性并且需要较低的光学传感器校准频率的光学测定物或基于荧光的测定物。在本发明的一个方面，提供了具有显著改善的稳定性和溶解度的分析物感测组合物。该分析物感测组合物包括用荧光团和猝灭剂染料两者标记的分析物类似物。在典型的实施方案中，该分析物感测组合物是葡萄糖感测组合物，该葡萄糖感测组合物包括用荧光团(例如，Alexa Fluor^TM 647、Alexa Fluor^TM 700)和猝灭剂染料(例如六甲氧基结晶紫-1，HMCV1)两者标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如葡聚糖)。

在本发明的另一方面，提供了基于该分析物感测组合物的竞争性分析物结合亲和力测定物。该竞争性分析物结合亲和力测定物包括用测定荧光团标记的分析物受体以及用参考荧光团和猝灭剂染料两者标记的分析物类似物。在某些情况下，参考荧光团相对于测定荧光团或指示荧光团蓝移，这提高了测定物的稳定性，并且更具体地讲是参考荧光团的稳定性。在典型的实施方案中，竞争性分析物结合亲和力测定物是竞争性葡萄糖结合亲和力测定物，该测定物包括用测定荧光团(Alexa Fluor^TM 647，AF647)标记的葡萄糖受体/凝集素(例如甘露聚糖结合凝集素，MBL)以及用参考荧光团(例如，Alexa Fluor^TM 594，AF594)和猝灭剂染料(例如HMCV1)标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如葡聚糖)。

在本发明的实施方案中，MBL与葡萄糖样分子(例如葡聚糖)之间的结合是可逆的。当不存在葡萄糖时，MBL和葡聚糖将主要结合在一起。当将葡萄糖加入测定物中时，葡萄糖将与葡聚糖群体的一部分竞争，使得测定物进入新的平衡状态。该平衡状态始终与葡萄糖浓度相对应。为了确定该平衡状态，将MBL用荧光团(例如AF647、AF700)标记，并将葡聚糖用猝灭剂染料(例如HMCV1)和参考荧光团(例如AF594)进行多重标记。供体测定荧光团和受体猝灭剂染料一起形成福斯特共振能量转移(FRET)对，即，测定荧光团的发射光谱和猝灭剂染料的吸收光谱重叠。应当指出的是，荧光团和染料通常是水溶性的，因为它们将在含水环境中起作用。

多重标记的分析物类似物

本发明的实施方案包括包括作为葡萄糖类似物的葡聚糖的葡萄糖测定复合物。葡聚糖是由至多1500个葡萄糖单元构成的柔性大分子。在某些典型的情况下，葡聚糖由大约600个葡萄糖单元(～100kDa)构成。葡聚糖可在基于甘露聚糖结合凝集素(MBL)的葡萄糖响应竞争性光学测定物中用作可置换的分析物类似物/配体。为了在福斯特共振能量转移(FRET)测定物中起作用，葡聚糖通常(大量)用亲脂性(和阳离子)染料如六甲氧基结晶紫-1(HMCV1)标记。在葡聚糖的柔性聚-(1,6)-葡萄糖主链上存在大量(大于10个)亲脂性染料可导致HMCV1标记的葡聚糖折叠成较低溶解性的构象，并因而产生沉淀。染料诱导的构象变化使HMCV1标记的葡聚糖变成更亲脂性的状态，这引起各种问题，包括葡聚糖与葡萄糖受体结合能力的不利变化以及影响其福斯特共振能量转移(FRET)效率。由于染料被分子内屏蔽在葡聚糖上，也会发生内部过滤效应，这导致测定物的校准发生变化，即在该过程期间，测定物的表现不稳定。

在本发明的一个方面，葡聚糖用典型的猝灭剂(例如HMCV1)以及染料或具有更亲水特性的其他组分共取代，这可实现更好的亲水-疏水平衡，其中随着时间的推移，葡萄糖配体/类似物的构型较少变化。共取代还可包括带正电荷和负电荷的取代基，这些取代基防止葡聚糖变成完全带负电或正电。例示性实验已表明，这些因素可以实现用于光学传感器的显著更稳定的测定物。

在一个实施方案中，如图1A中，将猝灭剂从染料变成荧光团，并省略参考荧光团。这通过改善配体的溶解度而改善测定物的溶解度。它还降低了测定物的复杂性，因为AF647标记的葡聚糖同时充当受体和参考。另外，这通过激发参考荧光团而改善测定物的光稳定性。在这种情况下，使参考荧光团朝向激发源蓝移将防止荧光团激发至第二激发态，这种现象可导致染料降解。通过使染料朝向光源激发波长偏移，可以获得更少的光漂白(紫外光对可见染料的漂白比可见光更多)。可用于本发明实施方案的蓝移参考染料(取决于例如激发滤光器、和光源的波长宽度)包括Alexa Fluor(AF)546、AF555、AF568、AF594以及Cy3、Cy3B和Cy3.5。这些是与AF647供体和HMCV1受体FRET系统相容的蓝移参考染料。

可将多种其他试剂偶联到葡聚糖以改善其构象和/或亲水-疏水平衡，通常用于增强亲水性。例示性试剂包括环状酸酐(例如邻苯二甲酸酐)、酒石酸酐衍生物(例如O,O-二乙酰基-L-酒石酸酐)，以及下表1中所示的试剂：

在另一个实施方案中，如图2A所示，将参考荧光团标记/偶联到与染料猝灭剂相同的配体上，从而消除对参考载体的需要。这通过改善配体的溶解度而改善测定物的溶解度。这已经显示出比荧光配体甚至更好的稳定性。它还降低了测定物的复杂性，因为AF647标记的葡聚糖同时充当受体和参考。另外，这通过激发参考(此时它吸收更多)来改善测定物的光稳定性。它还能够实现进一步的剂量反应优化。

已发现，当使用仅用荧光团(例如AF647-100Dex(d))标记的配体时，在测定物中增加(AF647-100Dex(d))浓度导致较高的参考(REF)信号(使REF饱和的风险)以及向测定物(ASY)通道中的更多溢出(bleed-over)，这降低了传感器剂量反应(DR)。由于上述问题，对纯AF647配体的(dex)浓度和标记度(DOL)存在限制。高DOL HMCV1-dex存在溶解度问题，并且AF647-dex似乎更易溶于Tris或水。将HCMV1添加到AF647配体中降低了REF信号和溢出而不降低猝灭能力。将AF647添加到HMCV1配体中增加了溶解度。因此，本发明的具体实施方案向HMCV1-葡聚糖中添加AF647，从而形成具有改善的溶解度的AF647-HMCV1-Dex配体，这改善了测定稳定性。AF647可被AF700取代。可以将组合配体以及仅HMCV1-Dex配体稍微琥珀酰化，以进一步改善测定稳定性。

在本发明的另一方面，提供了制备多重标记的/组合葡萄糖类似物/配体的方法。在典型的实施方案中，该组合配体是携带猝灭剂染料和荧光团两者(例如HMCV1和AF647两者)的葡聚糖。将两种染料同时染色到葡聚糖上。在一个实例中，将10X的HMCV1-SE和10X的AF647-SE添加到100Dex(d)中。这通常跟随着纯化、渗析或穿过小凝胶渗透色谱(GPC)柱。

多重标记的葡聚糖(MLD)上的各种染料的标记度(DOL)通过紫外可见光谱测定。使两种染料的DOL变化以获得最佳拟合。来自葡聚糖上的两种染料的所得光谱是各种染料和的光谱以及相应染料浓度(Dyex)的线性组合。通过对三个记录的光谱中的所有λ求解下列方程(使用HMCV1和AF647为例)来确定染料浓度。

ε_HMCV1(λ_max)＝42000M^-1cm^-1

ε_AF647(λ_max)＝270000M^-1cm^-1

作为对传感器的性能评估，使用以下公式计算传感器剂量反应(DR)：

其中I₄₀₀和I₄₀是400mg/dL和40mg/dL葡萄糖下的归一化强度。传感器剂量反应的损失(DR损失)使用以下公式计算：

或根据DR对时间的线性回归来计算(Excel函数斜率)：

相对DR损失被用作评估传感器质量的关键参数。在历史上，该术语是DR损失，因此DR的负发展变为正损失，因此“斜率”公式中为(-1)乘法。对基线漂移进行评估，但其漂移要小得多。在例示性实验中，如图13-17所示，单标记的葡聚糖表现出每天3％至6％之间的相对DR损失，而多重标记的葡聚糖出乎意料地仅在0.5％与2.5％之间漂移。

蓝移参考染料

本发明的实施方案包括由于波长分布而被选择用于一起使用的一组不同的荧光染料(例如，参考荧光团和测定荧光团)。在(强度)荧光测定物中需要参考染料以便跟踪实验装置的变化，例如光源波动、光路(将光耦合到光导中)的变化、机械扰动(如弯曲)、温度变化等。传统上，光学感测系统或基于荧光的感测系统已选择相对于测定荧光团红移的参考荧光团。使用具有比所需能量更多能量的较低波长的光来激发荧光团，荧光分子中的电子将从电子基态(S0)跃迁到第二激发态(S2)而不是跃迁到第一电子激发态(S1)的风险增大。处于S2的分子比处于S1的相同分子发生分解的可能性要高得多，因此如果激发到S2，则获得的光漂白比仅占据S1时获得的光漂白更快。由于参考染料必须非常稳定，因此使用相对于测定荧光团红移的参考荧光团可能是次优选择。

代替由于低波长激发而可能显得光不稳定的通常红移的参考荧光团，本发明的某些实施方案使用相对于测定荧光团或指示荧光团蓝移的参考荧光团。换句话讲，参考荧光团具有比测定荧光团更短的波长/增加的频率。在可见光中，参考荧光团更靠近光谱的蓝端，而测定荧光团更靠近红端。这改善了参考荧光团的稳定性，这是提供准确的测定测量值的关键特性。在一个或多个实施方案中，竞争性葡萄糖结合亲和力测定物包括用测定荧光团(Alexa Fluor^TM 647)标记的葡萄糖受体/凝集素(例如甘露聚糖结合凝集素)以及用参考荧光团(例如，Alexa Fluor^TM 594)和猝灭剂染料(例如六甲氧基结晶紫-1)标记的多重标记的葡萄糖类似物(例如葡聚糖)，其中参考荧光团相对于测定荧光团蓝移。

如本领域已知的，利用此类系统，光谱和可用光源决定荧光团的选择和光学装置的设计。有多种可与本发明的实施方案一起使用的半导体光源(LED)，诸如存在于MIGHTEXSYSTEMS LED波长组合(MIGHTEX SYSTEMS LED Wavelength Portfolio)中的那些。此外，在本发明的实施方案中，可以对连续光源(具有激光特性的白色光源)进行过滤以选择用于激发的特定波长范围以提供任意波长(范围)。

通常，对于红移参考而言，参考的浓度可原则上增加以降低测定荧光团“红”尾溢出效应，并且必须分开约50nm以避免参考荧光团“蓝”尾溢出到测定荧光团并因而降低剂量反应。对于蓝移参考而言，荧光团通常必须蓝移约50nm以避免参考测定“蓝”尾溢出到参考荧光团并因而使参考对测定荧光团荧光水平不敏感。在这种情况下，可以降低参考荧光团浓度，以便避免因参考“红”尾溢出到测定荧光团发射中而降低剂量反应。对于大多数荧光团对，通常难以将荧光团分开超过100nm并且仍然能够在蓝移的同时激发最红移的荧光团。一种避免这种情况的方式是利用两个不同的光源来激发，并增加光学系统的复杂性，因为需要监测光源的输出以补偿输出的变化。

命名

如本文和附图中所述，不同的葡聚糖缀合物具有以下通用命名：

Dye1-Dye2-XXXDex(Y)succ(a/b/Xc)

如本文和附图中所述，不同的MBL缀合物具有以下通用命名：

Dye1-zMBL(a)

Dye1和Dye2是染料名称的缩写；

XXX是葡聚糖的分子量，单位为kDa；

Y是氨基葡聚糖的离子交换色谱(IEX)级分；

对于重组MBL而言Z为“r”，对于血浆MBL而言Z为“p”，对于超高纯化的MBL而言Z为“UHP”；

succ表示是否用摩尔过量“c”的琥珀酸酐处理葡聚糖。如果未说明succ，则仅用一种或多种染料对葡聚糖染色；和

(a/b/Xc)表示染料的标记度(DOL)和所用的过量琥珀酸酐。“a”是Dye1的DOL，“b”是DOL或Dye2，并且“Xc”所用的摩尔过量的琥珀酸酐。DOL定义为每个葡聚糖的染料数，即无量纲数。

例示性实例如下：

HMCV1-AF647-100Dex(d)(5.2/3.9)

该缀合物是用DOL分别为5.2和3.9的HMCV1和AF647标记的100kDa葡聚糖IEX峰-d。

HMCV1-100Dex(c)succ(12.1/X10)

该缀合物是用HMCV1和DOL为12.1的琥珀酸酐以及10倍摩尔过量的用于改性的琥珀酸酐标记的100kDa葡聚糖IEX峰-c。

AF647-rMBL(0.51)

该缀合物是用DOL为0.51的AF647标记的重组MBL。

测定物被描述为MBL和来自相同命名的参考缀合物(当需要时)以及在方括号中的各个缀合物的浓度(PP；DD；RR)，其中PP是以μM表示的MBL(rMBL)的浓度，DD是以μM表示的配体葡聚糖浓度(Dex)，并且RR是以μM表示的参考葡聚糖浓度。

在以下实施例中公开了本发明的其他方面和实施方案。

实施例

实施例1：所生成的例示性多重标记的葡聚糖

HMCV1-AF647-葡聚糖

携带HMCV1猝灭剂染料和AF647荧光团两者的葡聚糖。在葡萄糖感测测定物中，HMCV1和AF647均充当AF594供体的猝灭剂。AF647也用作系统中的参考。来自光源的直接激发所发射的荧光远大于源自系统中的FRET的葡萄糖依赖性荧光。

HMCV1-AF700-葡聚糖

携带HMCV1猝灭剂染料和AF700荧光团两者的葡聚糖。HMCV1在葡萄糖感测测定物中充当AF594供体的猝灭剂。AF700在系统中用作参考。

HMCV1-HMCV3-葡聚糖

携带HMCV1猝灭剂染料和HMCV3猝灭剂染料两者的葡聚糖。HMCV3是带负电荷形式的HMCV1(带正电荷)。在葡萄糖感测测定物中，HMCV1和HMCV3均充当AF594供体的猝灭剂。在系统中需要参考，例如重度琥珀酰化的AF700-葡聚糖。

HMCV1-葡聚糖-琥珀酰化

携带HMCV1猝灭剂染料并进一步用低过量的琥珀酸酐处理的葡聚糖。HMCV1在葡萄糖感测测定物中充当AF594供体的猝灭剂。低琥珀酰化程度防止葡聚糖快速获得亲脂性结构。在系统中需要参考，例如重度琥珀酰化的AF700-葡聚糖。

实施例2：采用蓝移参考荧光团的实验

在葡萄糖响应测定物中，测定物传统上由两个或三个缀合物构建。使用红移参考的选项1(三个配体)：AF594-rMBL、HMCV1-100Dex(d)、AF700-100Dex(a)succ；非结合性Dex(a)succ上的AF700充当参考。使用红移参考的选项2(两个配体)：AF594-rMBL、HMCV1-AF647-100Dex(d)；结合性Dex(d)上的AF647将充当参考，因为来自直接激发的荧光比源自FRET的荧光强得多。将系统更改为蓝移参考变为：AF647-rMBL和HMCV1-AF594-100Dex(d)，从而导致光学传感器更好的稳定性和更低的校准频率。

已经构建了测定物，但遗憾的是，HMCV1-AF594-100Dex(d)(6.0/6.3)的AF594-DOL太大(SITS6017)。这导致测试期间在REF和ASY两个通道中的完全饱和。制备了新的测定物，但未进行测试(实验中心关闭)。选项1：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-100Dex(d)succ(17.1/X5)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)；(10:40:1)和(10:40:0.5)。选项2：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-70Dex(d)succ(13.8/X5)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:80:1)。选项3：AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-HMCV3-100Dex(d)succ(14.2)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:40:0.1)。AF647-rMBL(0.24)/HMCV1-HMCV3-100Dex(d)succ(18.6)/AF594-100Dex(a)succ(2.0)(10:40:1)和(10:40:0.1)。

结论

本节结束对本发明的典型实施方案的描述。已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的一个或多个实施方案的前述描述。其并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。根据上述教导，许多修改形式和变型形式是可能的。