基因编码的钾离子指示剂
阅读说明：本技术 基因编码的钾离子指示剂 (Gene-encoded potassium ion indicators ) 是由 E.埃罗格鲁 H.比斯科夫 W.格莱尔 R.马利 M.沃尔德克-韦尔迈尔 于 2018-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含至少一个信号传导结构域和钾传感器的多肽,所述多肽能够结合K<Sup>+</Sup>,并且当K<Sup>+</Sup>与钾传感器结合后,第一信号传导结构域能够生成可检测的信号。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸以及多肽在用于检测K<Sup>+</Sup>的多种应用中的用途。(The present invention relates to a polypeptide comprising at least one signalling domain and a potassium sensor, said polypeptide being capable of binding to K + And when K is + Upon binding to the potassium sensor, the first signaling domain is capable of generating a detectable signal. The invention also relates to polynucleotides encoding said polypeptides and the use of the polypeptides for detecting K + To a variety of applications.)
背景技术
钾离子(K+)对于所有细胞类型的正常工作都是必要的。跨质膜和细胞器膜的电化学K+梯度驱使K+流动以控制多种细胞功能。众所周知胞外和胞内K+浓度的波动控制肌肉收缩、神经递质和激素释放、神经元兴奋性、细胞体积、细胞增殖和细胞死亡。因此，并不奇怪的是，K+稳态的失衡在细胞和生物体水平上均具有深远影响，并且与许多病理学状况相关，包括神经病症、心血管病症、肾脏病症、免疫病症、肌肉病症和代谢病症以及癌症。跨生物膜的K+流动和运输通过许多选择性K+-通道、交换器和泵来实现，这些已成为治疗许多疾病的有希望的治疗药物靶标。然而，由于缺乏以高时空分辨率研究K+动力学的合适探针，我们目前对胞内和胞外K+波动的理解是非常有限的。
令人惊讶的是，新出现的证据表明，细胞中的K+浓度控制关键信号事件，而且与其对膜电位的影响无关。
在最近的研究中，显示了增加的胞内K+水平能增强T-细胞中磷酸酶PP2A的活性(Eil et al.,Nature 537,539–543(22September 2016))。因此Akt-mTOR复合物是低度磷酸化的，并且抑制T-细胞效应子功能。该研究揭示了K+离子是如何紧密控制基本细胞功能，而与其对膜电位的贡献无关。此外，迄今尚未全面研究K+在细胞器中的分布以及在某些生理学和病理学条件下如何动态和强有力地影响内部细胞器K+浓度。我们在这方面的知识是非常匮乏的，这主要是因为缺少允许在个体细胞和细胞器水平上实时量化K+流动的合适方法和工具。目前，通常使用K+敏感电极来测量胞外K+波动，并且通常需要至少1ml的相对大的样品体积。这些电极对于K+是高选择性的，但是它们很难用于检测K+波动和胞内K+信号的时空动态。已开发了若干小型化学荧光K+传感器以对胞外K+波动或细胞内的K+变化成像。然而，这些荧光离子指示剂有许多限制，因为它们通常对K+的选择性较差，显示低动态范围，在非生理范围范围内是K+敏感性的，难以加载到细胞和细胞器中，并且一些情况下难以获得。
由于对荧光K+探针的这么多严重限制，目前不可能使用荧光显微镜和/或荧光计进行有意义的定量K+成像。
Ashraf等人公开了钾结合蛋白(Kbp)可在体内用作细胞质钾传感器，其是大肠杆菌在高K+浓度下正常生长所需要的(Structure 2016,May 3；24(5)741-9)。
WO 01/04623 A1公开了荧光-标记的环状酯肽(缩肽)和及其用于光学测定样品中钾离子浓度的用途。
US 2013/244891 A1公开了包含通过连接子连接到与分析物相互作用的环境敏感性供体的可激活受体荧光团的生物传感器。
WO 2012/112440 A2公开了可用作钾离子传感器的荧光共聚物。
US 2003/119195 A1公开了作为钾传感器的基于荧光蒽(anthrazene)的亲离子荧光团。
鉴于该现有技术，仍需要提供其它K+传感器。开发这样的传感器是有挑战性的，因为例如基于附近的探针的构造是有挑战性的。迄今为止，尚不能可靠地预测因配体结合导致的基因编码的传感器中的空间效应是否能诱导可通过例如荧光猝灭或
因此，本发明的一个目的是提供适合用于检测K+的新试剂。
此外，本发明的另一个目的是提供用于检测样品中K+的新方法。
通过一种多肽解决了本发明的目的，所述多肽包括：
a)第一信号传导结构域，和
b)钾传感器，包含：
b1)钾传感器的第一结构域，其包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少70％同一性的氨基酸序列；和
b2)钾传感器的第二结构域，其包含与SEQ ID NO:2的序列显示至少70％同一性的氨基酸序列；
其中钾传感器能够结合带正电荷的钾离子，并且第一信号传导结构域在带正电荷的钾离子与钾传感器结合之后能够生成可检测的信号。
在一个方面，本发明涉及一种编码适合用于检测K+的多肽的多核苷酸。
在一个方面，本发明涉及一种适合用于真核或原核基因表达的编码本发明的多肽的载体。
在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的多核苷酸、载体或多肽的细胞。
在进一步的方面，本发明涉及一种检测样品中带正电荷的钾离子的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供本发明的多肽；
b)使本发明的多肽与样品接触；
c)测量由第一信号传导结构域生成的信号；和/或
d)测量由第一信号传导结构域和第二信号传导结构域共同生成的信号；
其中与样品接触后信号强度改变表明在样品中存在钾离子。
在进一步的方面，本发明涉及根据本发明的多肽用于检测样品中带正电荷的钾离子的用途。
在另一个方面，本发明涉及一种用于检测带正电荷的钾离子的试剂盒。
附图简述
图1显示了当K+与BON结构域结合后多肽中构象变化的示意图，所述构象变化增加了可检测的FRET信号。
图2显示了根据本发明的基于FRET的多肽，特别是(a)被称为GEPII 1.0和R-GEPII1.0的两种多肽的示意图，(b)R-GEPII 1.0的预期3D结构，(c)表达GEPII 1.0(左侧两图)或R-GEPII 1.0(右侧两图)的HeLa细胞。比例尺代表10μm，(d)当添加和去除不同K+浓度后，随时间变化的GEPII 1.0的ECFP、FRET信号(左图)和FRET比率信号(中间图)。右图显示了透性化(permeabilized)(3μM毛地黄皂苷+2μM缬氨霉素)的HeLa细胞中GEPII 1.0的浓度响应曲线；EC50＝2.04(1.716至2.413)mM；N＝10。(e)在缬氨霉素(10μM)处理的HeLa细胞中，代表性的随时间变化的R-GEPII 1.0的FRET比率-(左图)、Clover-(中间图)和FRET信号(右图)。
图3说明了与K+结合的BON结构域(a,b)的预期3-D结构，其中突出显示了酸性氨基酸。在(c)下，图3显示了两个最接近的酸性氨基酸之间的距离。在(d)下，图3显示了带有K+离子的预期孔径，然后在(e)下显示了有或没有水合的K+离子半径。
图4显示了在没有和有不同靶标序列的HeLa细胞中表达的GEPII 1.0变体的共聚焦图像，图a中的比例尺表示10μm：(a)显示了没有任何靶标序列的GEPII 1.0，(b)具有核输出序列NES的GEPII 1.0，(c)具有核前导序列NLS的GEPII 1.0，(d)具有线粒体靶标序列(COX8的串联二聚重复)的GEPII 1.0，(e)具有ER靶标序列(来自N末端上的钙网蛋白)+C-末端上的KDEL滞留序列的GEPII，(f)GPI-锚定的GEPII 1.0，(g)通过将其融合到伊默菌素(emerin)的C-末端而靶向细胞核周的GEPII 1.0，和(h)监控质膜区域中的CAAX-GEPII1.0。图像显示多肽位于细胞的靶标细胞器或亚结构域(sub-domain)中。
图5显示了纯化的GEPII 1.0分别响应于3mM K+、Na+、Ca2+、Rb+或Cs的最大ΔFRET-比率信号。K+获得最高比率。Na+和Ca2+显示了最低比率。使用CLARIOstar荧光微板读数器(BMG LabtECh,Germany)进行实验。在不存在或存在3mM KCl、NaCl、CaCl2、RbCl或CsCl的情况下分析在包含0.05％triton X 100的HEPES缓冲溶液(pH：7.3)中的200nM纯化GEPII。将80μl包含GEPII的溶液转移到多孔板(96孔用于荧光分析，Greiner Bio-One,Kremsmünster,Austria)中，并在430nm±10nm下照射。分别收集475nm±10nm和525nm±10nm下的发射。计算FRET比率值(F525/F475)，并将其与不存在一价和二价离子时GEPII的各自FRET比率值相关联。
图6说明了本发明多肽的可能用途。可用无K+的缓冲液稀释小型生物样品(例如，人或小鼠样品)中的钾浓度，随后添加本发明的多肽，并通过FRET检测钾离子浓度，例如，在多孔板中(A)。使用纯化的GEPII检测小型血液样品(～30μl)中的K+血清浓度，所述小型血液样品是在不处死动物的情况下从实验室小鼠的面部静脉或眼眶(B)采集的。使用图C中所示的线性校准拟合从相应的GEPII FRET比率值确定K+血清水平。如所示的，使用在HEPES缓冲溶液中的6个定义的K+浓度获得校准曲线。将小鼠血清用HEPES缓冲液进行1:12.5的稀释，并在96孔中与GEPII溶液混合，得到1:25的最终稀释度。使用CLARIOstar荧光微板读数器(BMG LabtECh,Germany)测量这些样品的FRET比率信号。(D)使用纯化的GEPII 1.0在4只不同小鼠中测定的K+血清值(以mM计)，从所述四只不同小鼠的面部静脉(红色圆圈)或眼眶(蓝色方块)采集血液。采血方式不影响K+值。(E)图D中所示的结果是根据采血方式绘制的。(F)在采血之后不久、之后2小时和4小时使用GEPII 1.0在5只不同小鼠血清中测定的K+值。该数据显示GEPII 1.0在小鼠血清中可保持功能数小时。(G)图F中所示的结果是根据采血后FRET测量的时间绘制的。
图7的图A示意性地说明了使用纯化的GEPII动态地记录(多孔)细胞培养板中的胞外K+浓度随时间的变化，以此作为细胞活力的有效量度。供给有底物(诸如，葡萄糖)的细胞存活并保持～5mM K+的胞外和～130mM K+的胞内生理K+梯度。在这些条件下，仅极少数细胞死亡并释放K+。相反，用毒性抗代谢物(诸如2-去氧葡萄糖(2-DG))处理的细胞死亡并释放K+，因此其在上清液中增加。(B)使用纯化的GEPII 1.0(c＝500nM)在96孔板中测量的胞外基质的K+浓度随时间的变化。克隆的胰腺β细胞(INS-1)在10mM葡萄糖(蓝色曲线，对照)或10mM 2-DG(红色曲线)存在下保存。如所指出的，在14小时的时间点上用50μM毛地黄皂苷处理对照细胞，这最大程度地释放了细胞K+。如上所述使用CLARIOstar荧光微板读数器(BMGLabtECh,Germany)测定GEPII FRET比率信号。
详细描述
在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些是可变的。还要理解本文所用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
尽管在本说明书的全文中引用了若干文件，并且这些文件通过引用一起整体并入本文，但本文中的任何内容均不得被解释为承认由于在先发明而使本发明无权限于这种公开。
K+结合蛋白(Kbp)(也称为YgaU)是一种来自大肠杆菌的可溶性6-kDa胞浆蛋白。其是高度特异性的K+结合蛋白，并且是高水平的外部K+存在下正常生长所需的。钾离子专有地结合到BON结构域(SEQ ID NO:1)，所述BON结构域在结合后经历构象变化。Kbp进一步包含LysM结构域(SEQ ID NO:2)，所述LysN结构域可与BON结构域相互作用。
下面在表1中示出了BON结构域、LysM结构域以及全长Kbp的氨基酸序列。
表1.KbP的BON结构域和LysM结构域的序列
惊奇地发现，K+可通过如下的融合蛋白检测，所述融合蛋白包含：
a)第一信号传导结构域，和
b)钾传感器包含
b1)钾传感器的第一结构域，其包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少70％同一性的氨基酸序列；和
b2)钾传感器的第二结构域，其包含与SEQ ID NO:2的序列显示至少70％同一性的氨基酸序列；
其中钾传感器能够结合带正电荷的钾离子，并且当带正电荷的钾离子与钾传感器结合后，第一信号传导结构域能够生成可检测的信号。
K+与钾传感器的结合可诱导所述钾传感器中的构象变化，随后可经由信号传导结构域检测这种构象变化。在图1中针对本发明的一种多肽对这种原理进行说明。根据本发明的多肽在本文中也称为基因编码的钾离子指示剂(GEPII)。
在优选实施方式中，第一信号传导结构域是荧光蛋白结构域。甚至更优选的是，第一信号传导结构域是青色荧光蛋白，优选可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与根据SEQID NO:6的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的青色荧光蛋白。
在优选实施方式中，第一信号传导结构域是荧光蛋白结构域。不受限于理论，第一信号生成的可检测信号可为荧光蛋白结构域的荧光信号的猝灭。在一个优选实施方式中，本发明多肽的氨基酸序列包含从N-末端到C-末端的：
i)钾传感器的第一结构域；
ii)第一信号传导结构域；和
iii)钾传感器的第二结构域。
第一信号传导结构域可任选地在连接序列之后和/或之前。
在另一个优选实施方式中，本发明多肽的氨基酸序列从N-末端到C-末端包括：i)钾传感器的第一结构域；
i)钾传感器的第二结构域；
ii)第一信号传导结构域；和
iii)钾传感器的第一结构域。
第一信号传导结构域可任选地在连接序列之后和/或之前。
钾传感器的第一结构域基于Kbp的BON结构域。
在优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少75％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少85％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ IDNO:1的序列显示至少95％同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少100％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，钾传感器的第一结构域包含具有至少一个氨基酸置换的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。优选地，SEQ ID NO:1的氨基酸序列包含约1至约11个置换。在优选实施方式中，至少一个氨基酸置换选自下组：D41N、D43N、D51N、D59N、E64Q、D83N、D84N、Q26R、N35Q、N75Q或G52D。在特别优选的实施方式中，钾传感器包含具有以下置换的SEQ ID NO:1的钾传感器的第一结构域的氨基酸序列：Q26R、N35Q、N75Q、G52D(SEQ ID NO:5)。
钾传感器的第二结构域基于Kbp的LysM结构域。
在优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ ID NO:2的序列显示至少75％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ ID NO:2的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ ID NO:2的序列显示至少85％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ ID NO:2的序列显示至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ IDNO:2的序列显示至少95％同一性的氨基酸序列。在另一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含与根据SEQ ID NO:2的序列显示至少100％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含具有至少一个氨基酸置换的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器的第二结构域包含含有约1至约11个置换的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在优选实施方式中，至少一个氨基酸置换选自下组：D104N、E125Q、D135N、N116Q、N118Q、N121Q和N127Q。在特别优选的实施方式中，钾传感器包含具有以下置换的SEQ ID NO:2的钾传感器的第二结构域的氨基酸序列：D104N、E125Q、D135N(SEQ ID NO:4)。序列中氨基酸的编码基于Kbp的野生型序列(SEQ ID NO:3)。
表2总结了Kbp以及BON和Lys结构域变体的相应氨基酸序列。
表2：Kbp以及BON和Lys结构域变体
本发明还涉及一种多肽，其包含：
a)第一信号传导结构域，和
b)钾传感器，所述钾传感器包含
b1)钾传感器的第一结构域，其包含与根据SEQ ID NO:1的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；和
b2)钾传感器的第二结构域，其包含与根据SEQ ID NO:2的序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；和
c)第二信号传导结构域,
其中钾传感器能够结合带正电荷的钾离子，并且当带正电荷的钾离子与钾传感器结合后，第一信号传导结构域和第二信号传导结构域能够共同生成可检测的信号。优选地，可在K+与钾传感器结合后生成可检测的信号。K+的结合可例如诱导钾传感器中的构象变化，并且随后使第一信号传导结构域和第二信号传导结构域彼此更接近或进一步远离，从而至少有助于生成可检测的信号。在优选实施方式中，第一信号传导结构域和第二信号传导结构域共同选自下组：FRET-供体-受体对、***酶对或***荧光蛋白对，其中第一信号传导结构域和第二信号传导结构域是一对的相应部分(例如，***酶的两半部分或***荧光蛋白的两半部分)。优选地，K+与钾传感器的结合可诱导多肽中的构象变化，并且第一信号传导结构域和第二信号传导结构域随后能够生成可检测的信号，例如，FRET-供体-受体对可生成可检测的FRET信号，***酶的两半部分可为功能性的并且催化可生成可检测的信号的反应，或者如果用具有合适范围内的波长的光激发，***荧光蛋白的两半部分将能够发射具有特定波长的光作为可检测的信号。
在优选实施方式中，第一信号传导结构域和第二信号传导结构域是FRET-供体-受体对。优选地，供体可以是青色荧光蛋白(CFP)结构域，并且受体可以是黄色荧光蛋白(YFP)结构域。更优选地，第一信号传导结构域可为供体并且第二信号传导结构域可为受体。在甚至更优选的实施方式中，第一信号传导结构域是供体CFP结构域并且第二信号传导结构域是受体YFP结构域。还优选地，CFP结构域可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与根据SEQ IDNO:6的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列，其中激发波长和荧光发射波长相同或基本相同于根据SEQ ID NO:6的CFP结构域，即具有在约436nm波长处的激发峰和在约477nm波长处的发射峰。优选地，YFP结构域可为环状排列的venus(CPV)蛋白，其甚至更优选包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与根据SEQ ID NO:7的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列，其中激发波长和荧光发射波长相同或基本相同于根据SEQ ID NO:7的YFP结构域,即在约514nm波长处的激发峰和约527nm处的发射峰。
在另一个优选实施方式中，供体可以是Clover结构域并且受体可以是mRuby2结构域。更优选第一信号传导结构域可为供体并且第二信号传导结构域可为受体。还优选Clover结构域可包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与根据SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列，其中激发波长和荧光发射波长相同或基本相同于根据SEQ ID NO:8的Clover结构域，即具有在约505nm波长处的激发峰和在约515nm波长处的发射峰。优选地，mRuby 2结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与根据SEQ ID NO:9的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列，其中激发波长和荧光发射波长相同或基本相同于根据SEQ ID NO:9的mRuby2结构域，即波长约559nm处的激发峰和约600nm处的发射峰。
表3显示了SEQ ID NO:6至9的氨基酸序列。
表3：信号传导结构域的氨基酸序列
在另一个优选实施方式中，根据本发明的多肽包含GEPII 1.0(SEQ ID NO:13)或R-GEPII 1.0(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，第一信号传导结构域和第二信号传导结构域包含翻译后修饰，例如缀合的荧光素分子或其他小分子荧光团或可检测部分，这可有助于在K+与钾传感器结合后，第一信号传导结构域与第二信号共同生成可检测的信号。
在另一个优选实施方式中，钾传感器包含Kbp的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少75％同一性的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少85％同一性的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少90％同一性的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少95％同一性的氨基酸序列。在优选实施方式中，钾传感器包含与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少100％同一性的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，本发明多肽的氨基酸序列从N-末端到C-末端包括：
i)第一信号传导结构域；
ii)钾传感器，其中优选钾传感器的第一结构域在钾传感器的第二结构域之前；和
iii)第二信号传导结构域。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的多肽可进一步包含至少一个连接序列。连接子优选具有柔性的、即非刚性的结构，其可改变可检测信号的灵敏度。接头氨基酸序列可位于以下中任何两个之间的多肽的氨基酸序列中：第一信号基团，钾传感器的第一结构域，钾传感器的第二结构域，和第二信号传导结构域。在优选实施方式中，接头氨基酸序列在钾传感器的第一结构域的氨基酸序列之后并且在钾传感器的第二结构域之前。然而，显然还可以是连接结构域位于钾传感器与第一信号传导结构域之间或位于钾传感器和第二信号传导结构域之间。
在一个实施方式中，连接子包含氨基酸序列–GGGG-。
在优选实施方式中，多肽进一步包含至少一个式(I)的接头氨基酸序列：
-(GGS)x(GGGGS)y(GG)z- (I)
其中
x是0或1的整数，
y是1-6的整数，
z是0或1的整数。
在优选实施方式中，y不是4。
在一个优选实施方式中，y是2、3或5。
在一个优选实施方式中，x是0，y是1，z是1。在该实施方式中进一步优选的是，多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，x是0，y是2或3，z是0。在该实施方式中进一步优选的是，多肽包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在仍然另一个优选实施方式中，x是0，y是4，z是1。在该实施方式中进一步优选的是，多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在另一个优选实施方式中，x是1，y是5，z是0。在该实施方式中进一步优选的是，多肽包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
已知生理体系中的胞外K+水平通常在约1mM至约10mM范围内。与此不同，胞内胞质和细胞器K+浓度通常在约100mM至300mM范围内。如将从实施例中明显可见的，本发明的多肽可提供对K+的不同敏感性，这可取决于如上所述的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2中连接序列或氨基酸置换的存在。需要理解的是技术人员因此将针对相应的用途使用具有合适敏感性的根据本发明的多肽。例如，技术人员可能会使用具有相对低EC50值(即至多20mM，优选至多10mM，更优选约5mM)的多肽来测量胞外K+水平和使用使用具有较高EC50值(即约10至约300mM，优选约50至约150mM)的根据本发明的多肽来测量胞内K+浓度。这里所引用的EC50值是通过实施例4中所述方法获得的EC50值。
因此，在优选实施方式中，本发明的多肽提供了约10至约300mM的EC50值。这种多肽可特别适合用于检测胞内K+。
在另一个优选实施方式中，本发明的多肽提供了约至多20mM的EC50值，优选约5mM，以测量胞外K+。
在另一个优选实施方式中，多肽进一步包含靶向序列。靶向序列是将多肽引导至细胞或胞外分泌的靶标细胞器或亚结构域的氨基酸序列。
靶向的细胞器和亚结构域可例如包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、细胞表面、核膜和质膜下区域。靶向序列可位于多肽的N-末端或C-末端。向多肽的C-末端添加核输出序列(例如氨基酸序列LPPLERLTL)可导致多肽仅定位于胞液中。添加C-末端核前导序列(KRSWSMAFC)可导致靶向细胞核。可通过线粒体靶向序列(诸如COX8的串联二聚重复)来靶向线粒体。ER靶向序列的实例包括N-末端上的钙网蛋白的ER靶向序列以及本发明多肽C-末端上的KDEL保留序列。GPI-锚定序列可以例如将多肽引导至细胞表面。细胞核周靶向的序列的实例包括伊默菌素(Emerin)，其中本发明多肽的序列融合至伊默菌素的C-末端。质膜下区域的靶向序列的实例是GTP酶Kras同种型b的CAAX结构域，例如，具有融合至根据本发明的多肽的C-末端的序列MSKDVKKKKKKSKTKCVIM。
在优选实施方式中，本发明的多肽分离的多肽。
在另一方面，本发明涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，由于遗传密码的简并性，指定的根据本发明的多肽可以由不同的核苷酸序列编码。
在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有少于9000个核苷酸、少于8000个核苷酸、少于7000个核苷酸、少于6000个核苷酸、少于5000个核苷酸、少于4000个核苷酸、少于3000个核苷酸、少于2000个核苷酸、少于1000个核苷酸或少于500个核苷酸的长度。
在进一步优选的实施方式中，根据本发明的分离的多核苷酸具有至少24个至9000个核苷酸的长度，优选至少24个到8000个核苷酸，更优选至少24个到7000个核苷酸，更优选至少24个到6000个核苷酸，更优选至少24个到5000个核苷酸，甚至更优选至少24个到4000个核苷酸。在另一个优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有至少60个至9000个核苷酸的长度，优选至少60个至8000个核苷酸，更优选至少60个至7000个核苷酸，更优选至少60个至6000个核苷酸，更优选至少60个至5000个核苷酸，甚至更优选至少60个至4000个核苷酸。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有至少90个至9000个核苷酸的长度，优选至少90个至8000个核苷酸，更优选至少90个至7000个核苷酸，更优选至少90个至6000个核苷酸，更优选至少90个至5000个核苷酸，甚至更优选至少90个至4000个核苷酸。在仍然另一个优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有至少120个至9000个核苷酸的长度，优选至少120个至8000个核苷酸，更优选至少120个至7000个核苷酸，更优选至少120个至6000个核苷酸，更优选至少120个至5000个核苷酸，甚至更优选至少120个至4000个核苷酸。在仍然另一个优选实施方式中，根据本发明的分离的多核苷酸具有至少300个至9000个核苷酸的长度，优选至少300个至8000个核苷酸，更优选至少300个至7000个核苷酸，更优选至少300个至6000个核苷酸，更优选至少300个至5000个核苷酸，甚至更优选至少300个至4000个核苷酸。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少1000个核苷酸、至少2000个核苷酸或至少2500个核苷酸的长度。
在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少80％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少80％同一性的序列组成。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列组成。在特别优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少95％或甚至更优选至少98％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:10的序列显示至少85％、优选至少90％、更优选至少95％或甚至更优选至少98％同一性的序列组成。
在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:11的序列显示至少80％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:11的序列显示至少80％同一性的序列组成。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:11的序列显示至少85％、优选至少90％，更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:11的序列显示至少85％、优选至少90％，更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列组成。
在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:12的序列显示至少80％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:12的序列显示至少80％同一性的序列组成。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的多核苷酸包括与根据SEQ ID NO:12的序列显示显示至少85％、优选至少90％，更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列或由与根据SEQ ID NO:12的序列显示显示至少85％、优选至少90％，更优选至少91％、甚至更优选至少92％、甚至更优选至少93％、甚至更优选至少94％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、甚至更优选至少97％、甚至更优选至少98％或甚至更优选至少99％同一性的序列组成。
下面在表4中显示了SEQ ID NO:10-12的序列。
表4：编码BON结构域、LysM结构域和Kbp的核苷酸序列
根据本发明的多核苷酸可为单链或双链RNA或DNA分子。
在一些实施方式中，根据本发明的分离的多核苷酸可***到载体(诸如表达载体)中。表达载体可例如为原核或真核表达载体，诸如例如，分离的质粒、微型染色体、粘粒、噬菌体、逆转录病毒载体或本领域技术人员已知的任何其他载体。本领域技术人员将熟悉如何根据具体需求选择合适的载体。在优选实施方式中，表达载体是分离的质粒。
因此，本发明还涉及一种包含根据本发明的多核苷酸的表达载体。
在一个方面，本发明涉及一种细胞，其包含根据本发明的多肽、编码多肽的多核苷酸表达载体和/或质粒。所述细胞不是人胚胎干细胞。细胞的实例包括但不限于体外细胞培养细胞或真核细胞的细胞溶解物，诸如哺乳动物细胞、人类细胞或植物细胞或原核细胞，其中的每种可任选通过本领域技术人员普遍知晓的方法进行基因修饰，诸如通过所述细胞的转染或转化。
在一个方面，本发明涉及一种检测样品中带正电荷的钾离子的方法，上述方法包含以下步骤：
a)提供本发明所述的多肽；
b)接触本发明所述的多肽；
c)测量由第一信号传导结构域生成的信号；
其中与样品接触后信号强度改变表明在样品中钾离子的存在。
在一个方面，本发明涉及一种检测样品中带正电荷的钾离子的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供一种如本发明所述的多肽；
b)接触如本发明所述的多肽；
c)测量由第一信号传导结构域生成的信号；和/或
d)测量由第一信号传导结构域和第二信号传导结构域共同生成的信号；
其中与样品接触后信号强度的改变表明在样品中钾离子的存在。
提供多肽的步骤a)发生在人体外部。
在所述方法的一个实施方式中，与不存在样品时的多肽信号相比，与接触样品后信号强度的改变表明在样品中存在K+。
在另一个优选实施方式中，本发明所述的方法是(定量)活体成像方法。
在优选实施方式中，测量的信号是荧光信号、比色信号或FRET信号。优选地，可在K+与本发明所述的多肽的钾传感器结合之后生成信号。在优选实施方式中，可通过FRET-供体-受体对、***酶对或***荧光蛋白对生成信号。可通过本领域技术人员普遍知晓的方法进行检测。
在一个实施方式中，测量的信号是荧光信号。在优选实施方式中，荧光信号通过K+与钾传感器结构域的结合来猝灭。
在更优选的实施方式中，测得的可测量信号是FRET信号。优选地，通过第一信号传导结构域和第二信号传导结构域生成FRET信号。更优选通过FRET-供体-受体对生成FRET信号，优选YFP(诸如CPV)和CFP。本领域技术人员知晓如何测量FRET信号。优选地，在用波长在约420nm至约450nm范围内的光激发之后测量YFP和CFP之间的FRET。更优选在用约440nm的光激发之后进行测量。还优选在约525nm至约545nm范围内的波长下测量光发射，更优选约535nm。
在另一个优选实施方式中，FRET对是Clover和mRuby2，而不是YFP和CFP。在这种情况下，在用470nm至约490nm激发和/或约510nm至520nm范围内(发射1)和590nm至约610nm范围内(发射2)的光发射之后测量FRET信号。
在优选实施方式中，检测K+的方法的步骤a)，即提供本发明所述的多肽，可包含用编码本发明多肽的多核苷酸、质粒和/或表达载体转染人或动物体外的至少一个细胞。随后可通过所述细胞的蛋白质合成提供根据本发明的多肽。本发明的多肽随后可从细胞分离，被细胞分泌，或留在细胞内。在另一个优选实施方式中，可通过提供本发明所述的细胞而在根据本发明的方法的步骤a)中提供本发明所述的多肽。
在优选实施方式中，根据本发明的方法可检测任何种类样品中钾离子的存在。更优选样品选自下组：生物样品或液体样品或其组合。甚至更优选的样品是细胞培养物、细胞团块、细胞溶解物、人或动物的组织样品、含K+的血液或液体。在一个实施方式中，样品还可包括生物样品，诸如细胞培养物，包括细胞的单层培养物或3-D细胞培养物、细胞悬浊液、细胞团块、细胞溶解物、人或动物的组织样品以及含K+的液体样品。优选地，根据本发明的方法随后可用于通过检测K+的存在和/或分布并且任选地结合测定生物样品的其他相关参数(诸如细胞凋亡、细胞信号传导、细胞基因表达等)来表征K+对生物样品的影响。
因此，在一个方面，本发明的多肽可用于如上所述地检测样品中的K+。在优选实施方式中，根据本发明的用途包括根据本发明的多肽用于(定量)活体成像的用途。术语“活体成像”是指在人体外的活细胞中的成像，诸如分离的体外培养活细胞的显微镜检查。根据本发明的胞内多肽可表明胞液、质膜下区域、细胞核、内质网、核膜和线粒体中例如响应于明确刺激或压力的K+水平的变化。
在另一个优选实施方式中，可在合适的容器(例如多孔板)中将本发明的分离的多肽与生物样品基础，并且可例如使用板荧光读数器直接测量钾浓度。使用根据本发明的多肽的一个优点是，与使用电极测量钾浓度所需的生物样品量(通常需要约100-1000μl或者甚至更多体积以充分浸浴电极)相比，将需要少量样品(仅约5-10μl)。因此，通过使用这样的K+电极测定小型实验动物[其具有1.5-2.5ml的总血容量(体重的6-8％)]的血清K+浓度通常需要处死动物以得到最大的血液浓度。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的多肽可用于体外细胞死亡测定。事实上在所有细胞类型中，特别是在可激发细胞中，需要巨大的能量才能通过Na+/K+-ATP酶来维持跨质膜的Na+和K+梯度。在压力条件下，细胞不能获得足够的能量，因此它们将具有降低的活力并且最终经历细胞死亡。在本发明的这一实施方式中，根据本发明的分离的多肽被添加到培养细胞的培养基中，并且可用于监控培养基中K+浓度随时间的变化。当细胞活力降低或细胞死亡发生率增加时，培养基中的K+浓度将增加。因此随后可使用根据本发明的多肽来检测这一点。在该测定中使用根据本发明的多肽提供了以下优点：与其他现有技术的细胞死亡/活力测定(例如，MTT测定法或基于刃天青的测定法，诸如
在另一个实施方式中，根据本发明的多肽用于细胞生长测定。已知当细胞生长时K+浓度减少。当将根据本发明的分离的多肽添加到培养细胞的培养基时，可再次监控细胞生长的扩展。该测定法可例如用于区分生长中的细菌细胞培养物和主要包含不生长和复制的死细胞的细菌细胞培养物。这不能通过现有的标准方法测定以监控细菌生长，例如，通过测量细菌细胞培养物的光学密度(OD600)。
在另一个实施方式中，根据本发明的多肽可用作使用活体显微镜将活动物中的胞外K+波动(例如，大脑或肌肉的胞外K+波动)实时可视化的传感器。在本申请中，根据本发明的多肽可例如局部应用于动物。在该上下文中，根据本发明的多肽可例如用作研究癌症或神经疾病(诸如癫痫、偏头痛或颅脑床上)研究工具以用于动物模型研究。
在一个方面，本发明还涉及一种检测样品中K+的试剂盒，其包含以下中的至少一种：
a)本发明的多肽；
b)本发明的多核苷酸或本发明的载体；和/或
c)本发明的细胞。
这样的试剂盒的实例包括用于如上所述测定细胞死亡或细胞活力的试剂盒。除了本发明的多肽之外，这样的试剂盒可例如包含以下至少一种：
a)用于稀释样品的合适的无K+缓冲液；
b)作为阳性对照的具有已知K+浓度的至少一种标准溶液；
c)如果试剂盒包含多于一种溶液，则标准溶液可包含不同浓度的K+以便使用所述标准溶液获得校准曲线；或
d)用于稀释本发明的多肽的合适的缓冲液。
包含根据本发明的多核苷酸或载体的试剂盒可进一步包含编码信号传导结构域中的一种或两种或者仅编码钾传感器的质粒以生成对照样品。试剂盒可进一步包含用于稀释多核苷酸或载体的合适的缓冲液。
包含根据本发明的细胞的试剂盒可进一步包含用于细胞的合适培养基和/或冷冻保存培养基。
在仍然另一个实施方式中，根据本发明的多肽还可用于便携式K+快速检测试剂盒。在这样的测试中，根据本发明的多肽可在溶液中存在，优选无钾溶液，或者其可被固定在固相或珠粒上。
定义
引入以下定义。如本说明书和预期权利要求中所用，除非在上下文中另有明确规定，单数形式“一/一个/一种(a和an)”也包含相应的复数形式。
应理解术语"包括"及变化形式(诸如"包含"和"含有")不是限制性的。位于本发明，术语“由……组成”被认为是术语“包括/包含/含有”的优选形式。
如果在下文中组被定义为包含至少某些数量的实施方式，这意味着其还包含优选仅由这些实施方式组成的组。
术语“约”和“大致”或“基本相同”在本发明的上下文中是指本领域技术人员将会理解为仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确度间隔。该术语通常包含与所指示的值的±10％的偏差，优选±5％。
如本文所用，术语“结构域”是指多肽或融合蛋白的构件。因此术语结构域包含能够独立于多肽链或结构的剩余部分而折叠、发挥作用和/或存在的多肽部分。例如，当青色荧光蛋白是融合蛋白的一部分时，其被认为是结构域。此外，如本文所用，术语结构域还包含***酶或***荧光蛋白的每个部分，其中即使***酶或***荧光蛋白的两个结构域仅能共同折叠和发挥作用，每个部分也被认为是结构域。
如本文所用，术语"多肽"和"蛋白/蛋白质"在本文中可互换使用以描述可包含部分或全长蛋白的蛋白质分子。该术语包括"融合蛋白"，所述“融合蛋白”包含具有源自两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或多肽。融合蛋白还可包括原子单独的蛋白质的氨基酸部分之间的氨基酸连接区。
如本文所用，术语“可检测的信号”是指通常用于生物化学、化学、医学或诊断技术的技术领域中的信号的增加或减少。可检测的信号的实例包括但不限于电信号(例如，电容)、机械信号、光信号、声信号或热信号。优选地，光信号可以是荧光信号、FRET信号、比色信号或电化学发光信号。还优选信号可为可检测的，即信号和相应的信号变化可使用合适的技术设备来监控。优选地，可检测的信号可为以基于邻近的方式生成或改变的信号，例如，通过多肽的构象变化来诱导。
如本文所用，术语“FRET”是指分子间或分子内的荧光共振能量转移。在FRET方法中，一个荧光团能用作能量供体，并且另一个是能量受体。这些有时分别被称为报道剂和猝灭剂。可用特定波长的光来激发供体，在该特定波长的光下其通常将显示荧光发射波长。受体也可在一定波长下激发，使得其能通过多种距离相关性能量传递机制接收供体分子的发射能量。通常，当受体与供体处于近距离时，受体接收供体的发射能量。供体和受体可为不同分子或可为同一分子的不同部分，诸如多肽的两个不同结构域。FRET测量技术是本领域中公知的。
如本文所用，术语“FRET-供体-受体对”是指如上所述代表能量供体的荧光团和能够FRET的能量受体。在该上下文中，术语“荧光团”是指使分子发荧光的分子部分。其是吸收特定波长并以不同(但同样是特定的)波长再发射光的分子部分。发射的光的量和波长取决于异构体和异构体的化学环境。荧光团包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)(荧光素的反应性衍生物)、若丹明(TRITC)、香豆素、花青苷染料(Cy)(例如，花青苷3、花青苷5或花青苷7)、荧光蛋白(诸如来自维多利亚管发光水母或海肾的荧光蛋白(GFP)或其蛋白质变体，诸如黄色荧光蛋白(YFP)，包括Citrine、Venus和Ypet；蓝色荧光蛋白(BFP)，诸如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1；青色荧光蛋白(CFP)，诸如ECFP、Cerulean；CyPet；以及其它荧光蛋白，诸如UnaG、dsRed、mRuby2、Clover、eqFP611、Dronpa、TagRFPs、KFP、EosFP、Dendra、IrisFP、Clover、mRubby、mKOk和mKO2。小分子荧光团(诸如异硫氰酸荧光素(FITC)(荧光素的反应性衍生物)、若丹明(TRITC)、香豆素、花青苷(Cy))可被缀合至蛋白质并用作荧光团。可用作FRET-供体-受体对的荧光团的实例包括但不限于，CFP作为供体且YFP作为受体，EGFP作为供体且Cy3作为受体，或EGFP作为供体且YFP作为受体，或Clover作为供体且mRuby2作为受体，或cpEGFP作为供体且mKO2作为受体。
如本文所用，术语“***酶”是指***成至少两个具有至少降低的生物活性或没有生物活性的部分的生物活性酶。在该上下文中，术语“***酶对”是指至少两个至少部分失活的酶部分。当接近之后，酶部分相互作用形成生物活性酶，其可使用常规酶检测技术来检测。***酶技术也在WO 2005/094441A2中进一步描述。***酶的实例包括但不限于海肾荧光素酶，其可复原并经由生物荧光监控；互补的***β-半乳糖苷酶，其中可经由比色法化学发光或荧光检测来监控活性；***β-内酰胺酶，可通过水解后头孢硝噻吩的颜色改变或通过荧光经由CCF-2/AM来测定其互补；GTP酶(电荷改变)，过氧化物酶(色度)，核酶(内切和外切)，限制性内切酶(序列特异性内切)，蛋白酶(蛋白切割)，脂酶(连接的核酸低聚物)，以及硫醇-二硫化物氧化还原酶(通过二硫键的构象变化)。
如本文所用，术语“***荧光蛋白(SFP)对”是指荧光蛋白的至少两个部分。SFPs由单独无荧光但互补形成功能性应该分子的多个肽或多肽片段组成。例如，***绿色荧光蛋白(***GFP)是SFP。一些工程化的***GFP分子是自组装的。(见，例如，美国专利申请公开号2005/0221343和PCT公开号WO/2005/074436；Cabantous et al.,Nat.BiotEChnol.,23:102-107,2005；Cabantousand Waldo,Nat.Methods,3:845-854,2006)。US2012282643还描述了***黄色荧光蛋白变体和***青色荧光蛋白变体。
如本文所用，两个序列之间的“％同一性”的测定优选使用KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877的数学算法进行。这样的算法被例如并入到Altschul et al.(1990)J.MoI.Biol.215:403-410available at NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)的BLASTn and BLASTp程序中。
百分比同一性的测定优选使用BLASTn和BLASTp程序的标准参数进行。
BLAST多核苷酸检索优选使用BLASTn程序进行。
对于一般参数，“Max Target Sequencces”方框可设为100，“Short queries”方框可为勾选，“ExpECt Threshold”方框可设为10，并且“Word Size”方框可设为28。对于评分参数，“Match/mismatch Scocres”可设为1-2，并且“Gap Costs”方框可设为线性。对于过滤和掩蔽参数，“Low Complexity regions”方框可为不勾选，“SpECies-spECific repeats”方框可为不勾选，“Mask for lookup table only”方框可为勾选，“Mask lower caseletters”方框可为不勾选。
BLAST蛋白质检索优选使用BLASTp程序进行。
对于一般参数，“Max Target Sequences”方框可被设为100，“Short queries”方框可为勾选，“ExpECt threshold”方框可被设为10，并且“Word Size”方框可被设为“3”。对于评分参数，“Matrix”方框可被设为“BLOSUM62”，“Gap Costs”方框可被设为“Existence:11Extension:1”，“Compositional adjustments”方框可被设为“Conditionalcompositional score matrix adjustment”。对于过滤和掩蔽参数，“Lowcomplexityregions”方框可为不勾选，“Mask for lookup table only”方框可为不勾选，“Mask lowercase letters”方框可为不勾选。
百分比同一性是在相应参考序列的全长上测定的，即在根据相应上下文中所述的序列SEQ ID NO或SEQ ID NOs的序列的全长上测定。例如，与根据SEQ ID NO:1的序列显示至少80％同一性的氨基酸序列在SEQ ID NO:1的全长上显示与SEQ ID NO:1的至少80％同一性。在另一个实例中，与根据SEQ ID NO:3的序列显示至少80％同一性的序列在SEQ IDNO:3的全长上显示与SEQ ID NO:3的至少80％同一性。
在本发明的上下文中，术语“分离的”表示一种多肽或多核苷酸已被从其天然环境中移除和/或以并非其天然发现的形式存在。“分离的”多肽或“分离的”多核苷酸还可为在体外生成的一种多肽或多核苷酸。
如本文所用，术语“氨基酸置换”是指根据保守性或非保守性置换的氨基酸序列中的置换，优选保守性置换。在一些实施方式中，置换还包括将天然氨基酸交换为非天然氨基酸。保守性置换包括将氨基酸置换为与被置换的氨基酸具有相似化学特性的另一种氨基酸。优选地，保守性置换是选自下组的置换：
(i)将碱性氨基酸置换为另一种不同的碱性氨基酸；
(ii)将酸性氨基酸置换为另一种不同的酸性氨基酸；
(iii)将芳族氨基酸置换为另一种不同的芳族氨基酸；
(iv)将非极性脂族氨基酸置换为另一种不同的非极性脂族氨基酸；和
(v)将极性无电荷氨基酸置换为另一种不同的极性无电荷氨基酸。
碱性氨基酸优选选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸优选是天冬氨酸盐或谷氨酸盐。
芳族氨基酸优选选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性脂族氨基酸优选选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性无电荷氨基酸优选选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守性氨基酸置换不同，非保守性氨基酸置换是将氨基酸交换为不落入上面概述的保守性置换(i)至(v)中的任何氨基酸。
如本文所用，术语"生物样品"是指人或动物体外的组织(例如，组织活检)、器官、细胞溶解物或体液(血液、尿液、唾液、胆汁、血清、脑脊液等)的样品。此外，术语“生物样品”还包括体外细胞培养细胞或者真核细胞(诸如哺乳动物细胞、人类细胞或植物细胞)或原核细胞的细胞溶解物，所述真核细胞或原核细胞可任选地根据本领域技术人员普遍知晓的方法(包括转染和转化方法)进行基因修饰。
如本文所用，术语“结合”是指两分子之间的吸引相互作用，其导致分子彼此非常接近的稳定缔合。结合的结果有时是形成分子复合物，其中将各部分保持在一起的吸引力通常是非共价的，因此通常在能量上弱于共价键。
实施例
1.细胞培养，细胞转染，化学品，和缓冲液
HeLa细胞在Dulbeccosfs改良的Eagle培养基(DMEM,Sigma Aldrich)中生长，所述培养基包含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。在60–80％融合时，用1ml无血清和抗生素的培养基转染30-mm成像培养皿中的细胞，所述培养基已与1.5μg合适的质粒DNA和3μg TransFastTM转染试剂(Promega)混合。将细胞在湿润的温育器(37℃,5％CO2,95％空气)中保持16–20小时，随后改换回相应的培养基。所有实验在转染后进行24小时。缬氨霉素购买自Sigma Aldrich，并且以7μM的最终浓度使用。所用的实验缓冲液有以下组成(以g/L计)：8.0或7.6NaCl，1.44Na2HPO4，0.12NaH2PO4，使用含有0.4KCl或不含KCl的NaOH调节至pH 7.40。
2.活细胞成像
使用TiLL iMIC(Till Photonics,Graefelfing,Germany，一种数字广域荧光成像系统)进行荧光成像。在480nm下激发红移的基于FRET的R-GEPII，并且分别在510-540nm(Clover，FRET供体)和560-610nm(Clover到mRuby2的FRET)下捕获发射。在430nm下激发基于CFP/YFP的GEPII 1.0，并且分别在480nm和535nm下记录发射。使用现场采集软件2.0.0.12版(Till Photonics)进行数字荧光显微镜的数据获取和控制。
3.计算机建模
使用在线工具Phyre2(Protein Homology/analogy RECognition Engine V2.0；http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)预测BON结构域和全长Kbp的模型。使用软件PyMol viewer对预测的嵌合体3D结构进行进一步分析。使用在线工具PoreWalker 1.0(http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/PoreWalker/)进行通道预测。
4.通过FRET检测K+
使用经典克隆策略生成GEPII 1.0和R-GEPII 1.0多肽的质粒DNA编码(图2a和b)。GEPII 1.0包含优化的CFP/YFP(sECFP作为FRET供体，cpV作为FRET受体)FRET对(图2a，上图)。红移的R-GEPII 1.0包含Clover和mRuby2(图2a下图和b)，其分别是亮绿色和红色的FP变体，经优化以生成具有改进的动力学的向红FRET-基探针。两种探针均在用相应的质粒转染之后在表达CFP/YFP-基GEPII 1.0(图2c，左图s)或红移R-GEPII 1.0(图2c，右图)的HeLa细胞中检测。为控制胞液K+浓度([K+]cyto)，用洋地黄皂苷和K+离子载体缬氨霉素的混合物(图2d)或仅用缬氨霉素(图2e)将细胞透化。事实上，GEPIIs的FRET比率信号以浓度相关方式响应于K+增加而提高(图2d)，同时在去除K+之后FRET荧光立即降低(图2d和e)。这些实验证实了FP和kbp-基嵌合构建物的设计和生成得到了提供K+变化的实时读取的功能性FRET-基探针。
在原位，发现基于CFP/YFP的GEPII 1.0和相应的R-GEPII 1.0的半数最大最有效浓度(EC50)分别为2.04(1.72-2.41)mM(图2d，右图)和4.11(3.25-5.19)mM(n＝8)。为原位测定EC50值(培养的单一HeLa细胞)，将表达GEPIIs的细胞在无K+溶液中用5μM毛地黄皂苷透化10分钟。使用半自动灌流系统将毛地黄皂苷施加到显微镜上的细胞。使用随时间进行的连续FRET比率成像来研究探针的K+敏感性。经由灌流系统添加范围在0.01mM至100mM的不同K+浓度，直到FRET比率信号升高并保持稳定。将最大ΔFRET比率值相对于对数K+浓度绘图并使用Sigmoidal浓度相应方程拟合。使用GraphPad Prism 5软件进行数据分析。
5.多肽变体的合理设计
为控制GEPIIs的K+敏感性，我们基于序列分析和使用Phyre-2和PyMol软件进行的3D同源性建模，合理地重新设计了野生型kbp。我们的预测以及初步数据表明编码BON和LysM结构域中带电荷和极性氨基酸的突变显著降低了相应的FRET-基GEPIIs的K+敏感性。
在kbp的野生型K+结合的BON结构域中，可鉴定8个酸性氨基酸位置：D41、D43、D51、D59、E64、E67、D83和D84(图3a和b，红色区域)。有趣地，使用Phyre2和PyMol对BON结构域进行3-D建模预测了孔或通道样结构(图3a)。该孔中的两个酸性氨基酸的最小距离在680-800pm左右(图3c)。考虑到最小孔径在660pm左右(图3d)，接近孔和在孔中的酸性氨基酸可能会明显干扰和结合水合的K+离子(图3e)。
此外，序列分析结合BON结构域的3D建模(图3)预测，除了全部酸性氨基酸之外，还认为27位的Q(谷氨酰胺)、35位的N(天冬酰胺)、75位的N(天冬酰胺)和53位的G(甘氨酸)对于K+感知是重要的。
LysM结构域中的105位(D)、126位(E)和408位(D)的三个带负电荷的氨基酸被认为与K+结合的BON结构域相互作用，对K+结合后的蛋白构象变化也有显著作用。
6.使用多肽变体的FRET检测
使用定点突变生成编码GEPII 1.0突变体的质粒DNA。在这里，使用herculase II聚合酶(Agilent TEChnologies,Santa Clara,USA)将包含设计的单核苷酸多态性的引物相应的PCR。随后使用相应的限制性内切酶将相应的PCR产物随后亚克隆到pcDNA3.1(-)哺乳动物表达载体中。随后用相应的质粒DNA转染Hela细胞，并如上文中在实施例4中所述的那样测定EC50。相应的多肽变体的结果总结在表5中。
表5：具有氨基酸置换的GEPII 1.0变体的敏感性
7.在钾传感器的第一结构域和钾传感器的第二结构域之间使用不同的连接分子的多肽变体的FRET检测
使用设计的编码形成相应连接子的氨基酸的正向和反向引物对来生成编码包含含有甘氨酸和丝氨酸残基的连接序列的根据本发明的多肽的质粒。正向引物被设计为通过突出端延长PCR来延长具有5'突出端的野生型LysM结构域以形成连接子。反向引物对被设计为结合野生型BON结构域并在3'末端形成相同的连接子。这两种PCR产物随后通过另外的PCR融合，并亚克隆到侧翼分别为编码MSECfp和cpV的核苷酸序列的pcDNA3.1(-)载体中。最终的构建物编码在Kbp的BON和LysM结构域之间具有柔性连接子的新型CFP/YFP FRET-基GEPII变体。
随后用质粒DNA转染细胞，并如上文中在实施例4中所述的那样测定EC50。相应的多肽变体的结果总结在表6中。
表6：其中BON和LysM通过不同的连接序列连接的GEPII 1.0变体的敏感性
包含连接分子的多肽与GEPII 1.0相比显示了增加的EC50。
8.在BON和LysM结构域之间包含连接子的多肽变体的FRET检测
使用设计的编码形成相应连接子的氨基酸的正向和反向引物对生成编码包含氨基酸置换和连接序列的根据本发明的多肽的质粒。正向引物被设计为通过突出端延长PCR来延长具有5'突出端的ΔLysM结构域(见ΔLysM GEPII1.0)以形成连接子。反向引物对被设计为结合野生型BON结构域并在3'末端形成相同的连接子。这两种PCR产物随后通过另外的PCR融合并被亚克隆到侧翼分别为编码msECFP和cpV的核苷酸序列的pcDNA3.1(-)载体中。最终的构建物编码在BON和ΔLysM结构域之间具有柔性连接子的新型CFP/YFP FRET-基GEPII变体。
随后用质粒DNA转染细胞，并如上文中在实施例4中所述的那样测定EC50。相应的多肽变体的结果总结在表7中。
表7：包含氨基酸置换和连接序列的GEPII 1.0变体的敏感性
9.靶向表达本发明的多肽的细胞的细胞器和亚结构域
基因编码探针的一大优势是它们能精准地靶向细胞的细胞器和亚结构域。因此，靶向GEPIIs将使得能够以高时空分辨率来定量测量K+水平和动力学。由于缺少靶向性的K+探针，我们目前关于亚细胞K+流动的想法是非常模糊的。
使用技术人员已知的一般分子生物学方法来克隆编码具有N-末端或C-末端靶序列的GEPII 1.0的相应的DNA质粒。通过荧光显微镜来分析使GEPII1.0多肽(见图2)靶向细胞核(图4c)、线粒体(图4d)、内质网(ER，图4e)、细胞表面(图4f)、核膜(图4g)和质膜下区域(图4h)的实验。不具有任何靶向序列的GEPII 1.0定位在胞液和细胞核中(图4a)。将核输出序列(NES；LPPLERLTL)添加至GEPII 1.0的C-末端导致K+探针仅定位在胞液中(图4b)。靶标探针将允许亚细胞K+流动的缩时(time-lapse)荧光成像。
10.分离的多肽的表征
将不同的GEPII变体克隆到petM11细菌表达载体中。在将编码GEPIIs的细菌表达质粒转化到具有化学活性的DH5α细菌之后，将细胞在LB琼脂板上培养以接收单个菌落。将包含单个菌落的预培养物培养过夜，然后接种到37℃的1L新鲜LB培养基中。当观察到0.7的光学密度时，通过添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)至0.5mM的最终浓度来诱导表达，并在室温下进一步培养细胞。随后通过细胞溶解将表达的GEPIIs从细菌细胞中提取出来，并使用亲和色谱法进一步纯化。使用咪唑从柱上获得洗脱。将包含GEPII的洗脱液用包含triton X 100(0.05％)的HEPES缓冲溶液稀释。使用尺寸排阻色谱法进一步确认重组GEPII提取。在荧光板读数器上使用FRET测量进一步显示了重组多肽的FRET比率信号不收不受Na+和Ca2+影响。与此不同，相应于3mN相应离子的添加，K+相对于Rb+和Cs+提高了纯化GEPII的FRET比率信号(见图5)。
11.测定生物样品中的K+浓度
在一组初步试验中，我们使用了如上所述纯化的GEPII 1.0，以图6A中所示的实验设置，测定了小鼠血清中的K+。我们测定了血清K+浓度为6.63±0.34mM(SD；n＝5；图6)，这与公开数据非常吻合。重点是，与采血方式(面部静脉或眼眶)无关的再现性和可重复性以及小鼠血清中的GEPII稳定性非常高(图6)，表明生物探针中基于GEPII的K+测定显示了一种稳健和精确的方法。
12.细胞活力/死亡测定
此外，使用纯化的GEPII 1.0来动态地记录(多孔)细胞培养板中的胞外K+浓度，作为细胞活力和细胞死亡的量度。每小时测量定位于胞外的重组GEPII1.0的FRET比率信号，同时将细胞保持在含葡萄糖或2-去氧葡萄糖(2-DG)的培养基中。如图7中所示，在10nM葡萄糖存在下的对照细胞的上清液中的胞外K+浓度随时间保持恒定，直到用50μM洋地黄皂苷透化细胞。与此不同，如果用2-DG处理细胞，则纯化的GEPII 1.0的FRET比率信号随时间急剧增加，表明了迅速导致胞内K+流失的代谢危机。这些发现进一步强调了测量培养物中的K+释放代表对细胞活力的实时读取。
序列表
<110> 格拉茨医科大学
<120> 基因编码的钾离子指示剂
<130> M11159
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr
50 55 60
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys
1 5 10 15
Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn
20 25 30
Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu
35 40 45
Arg Ile
50
<210> 3
<211> 149
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 3
Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp
1 5 10 15
Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln
20 25 30
Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp Ala Asp Lys Val Asn Ile
35 40 45
Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr Gly Asp Gly Leu Ser Gln
50 55 60
Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val Gly Asn Ile Ser Gly Ile
65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys
100 105 110
Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn
115 120 125
Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu
130 135 140
Arg Ile Pro Glu Glu
145
<210> 4
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LysM D104N,E125Q,D135N
<400> 4
Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys
1 5 10 15
Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn
20 25 30
Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu
35 40 45
Arg Ile
50
<210> 5
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BON Q26R,N35Q, N75Q, G52D
<400> 5
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Asp Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Gln Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr
50 55 60
<210> 6
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mseCFP
<400> 6
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala
225
<210> 7
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cpV
<400> 7
Met Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro
1 5 10 15
Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr
20 25 30
Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
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Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu
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Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu
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Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
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Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr
100 105 110
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
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Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe
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Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
145 150 155 160
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp
165 170 175
Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
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Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
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Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr
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Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile
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Arg His Asn Ile Glu
245
<210> 8
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Glover
<400> 8
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
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Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
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Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
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Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
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Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
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Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
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Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
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Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
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Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu
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Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
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<210> 9
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mRuby2
<400> 9
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Arg Met Lys
1 5 10 15
Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe Lys Cys Thr Gly
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Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys
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Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr
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Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr Pro Lys Gly Ile
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Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg
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Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Met Gln Asp Thr
100 105 110
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Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Lys Gly Trp
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Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Arg Gly
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Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly His Leu Ser Cys
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180 185 190
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Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His Ala Val Ala Lys
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Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
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<210> 10
<211> 189
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 10
caggcgaaga aggtgcagga gcatctgaac aaaaccggta taccggatgc cgataaagtg 60
aatattcaaa ttgccgacgg caaagcgacg gtcactggtg acggcctgag tcaggaggcg 120
aaggagaaaa tccttgttgc ggtggggaat atttccggta ttgccagtgt cgatgatcag 180
gtgaaaacg 189
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
cagttttata ccgttaagtc tggcgacact ctgagtgcca tttccaaaca ggtctacggt 60
aacgctaatc tgtacaataa aatcttcgaa gcgaataaac cgatgctaaa aagcccggat 120
aaaatttatc cggggcaagt gttgcgtatt 150
<210> 12
<211> 447
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 12
atgggtctgt tcaattttgt gaaagatgcc ggagaaaaac tctgggacgc ggttacaggt 60
cagcacgata aagacgatca ggcgaagaag gtgcaggagc atctgaacaa aaccggtata 120
ccggatgccg ataaagtgaa tattcaaatt gccgacggca aagcgacggt cactggtgac 180
ggcctgagtc aggaggcgaa ggagaaaatc cttgttgcgg tggggaatat ttccggtatt 240
gccagtgtcg atgatcaggt gaaaacggcg acaccagcca ctgccagcca gttttatacc 300
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gggcaagtgt tgcgtattcc ggaagag 447
<210> 13
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEP II 1.0
<400> 13
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly
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Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
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Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
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Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Ile Asp Met Gly Leu Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala
225 230 235 240
Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr Gly Gln His Asp Lys Asp Asp
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr
325 330 335
Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn
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Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro Glu Glu Glu Phe Met Asp Gly
370 375 380
Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
385 390 395 400
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys
405 410 415
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
420 425 430
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
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Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
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Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
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Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
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500 505 510
Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr
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Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
530 535 540
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
545 550 555 560
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
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Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
580 585 590
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala
595 600 605
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
610 615 620
Ile Glu
625
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.7
<400> 14
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr
85 90 95
Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met
100 105 110
Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile
115 120 125
<210> 15
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.10
<400> 15
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys
85 90 95
Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn
100 105 110
Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu
115 120 125
Arg Ile
130
<210> 16
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.15
<400> 16
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu
85 90 95
Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys
100 105 110
Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr
115 120 125
Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile
130 135
<210> 17
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.22
<400> 17
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr Thr
85 90 95
Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly
100 105 110
Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu
115 120 125
Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile
130 135 140
<210> 18
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEP II 2.28
<400> 18
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Gln Phe Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile
100 105 110
Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln
130 135 140
Val Leu Arg Ile
145
<210> 19
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.4
<400> 19
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gln Phe Tyr Thr Val Lys
65 70 75 80
Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr Gly Asn Ala
85 90 95
Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met Leu Lys Ser
100 105 110
Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile
115 120
<210> 20
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEPII 2.7
<400> 20
Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp
1 5 10 15
Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys Glu Lys Ile Leu Val Ala Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala
50 55 60
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Gly Asn Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr
85 90 95
Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Gln Ala Asn Lys Pro Met
100 105 110
Leu Lys Ser Pro Asn Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile
115 120 125
<210> 21
<211> 641
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-GEPII 1.0
<400> 21
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Phe Gly Tyr Gly Val Ala Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser
225 230 235 240
Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys Ile Asp Met Gly Leu
245 250 255
Phe Asn Phe Val Lys Asp Ala Gly Glu Lys Leu Trp Asp Ala Val Thr
260 265 270
Gly Gln His Asp Lys Asp Asp Gln Ala Lys Lys Val Gln Glu His Leu
275 280 285
Asn Lys Thr Gly Ile Pro Asp Ala Asp Lys Val Asn Ile Gln Ile Ala
290 295 300
Asp Gly Lys Ala Thr Val Thr Gly Asp Gly Leu Ser Gln Glu Ala Lys
305 310 315 320
Glu Lys Ile Leu Val Ala Val Gly Asn Ile Ser Gly Ile Ala Ser Val
325 330 335
Asp Asp Gln Val Lys Thr Ala Thr Pro Ala Thr Ala Ser Gln Phe Tyr
340 345 350
Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Ser Ala Ile Ser Lys Gln Val Tyr
355 360 365
Gly Asn Ala Asn Leu Tyr Asn Lys Ile Phe Glu Ala Asn Lys Pro Met
370 375 380
Leu Lys Ser Pro Asp Lys Ile Tyr Pro Gly Gln Val Leu Arg Ile Pro
385 390 395 400
Glu Glu Glu Phe Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile Lys Glu Asn
405 410 415
Met Arg Met Lys Val Val Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Gln Phe
420 425 430
Lys Cys Thr Gly Glu Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Met Gly Thr Gln Thr
435 440 445
Met Arg Ile Lys Val Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp
450 455 460
Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile Lys Tyr
465 470 475 480
Pro Lys Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe
485 490 495
Thr Trp Glu Arg Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
500 505 510
Met Gln Asp Thr Ser Leu Glu Asp Gly Cys Leu Val Tyr His Val Gln
515 520 525
Val Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
530 535 540
Thr Lys Gly Trp Glu Pro Asn Thr Glu Met Met Tyr Pro Ala Asp Gly
545 550 555 560
Gly Leu Arg Gly Tyr Thr His Met Ala Leu Lys Val Asp Gly Gly Gly
565 570 575
His Leu Ser Cys Ser Phe Val Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Thr Val
580 585 590
Gly Asn Ile Lys Met Pro Gly Ile His Ala Val Asp His Arg Leu Glu
595 600 605
Arg Leu Glu Glu Ser Asp Asn Glu Met Phe Val Val Gln Arg Glu His
610 615 620
Ala Val Ala Lys Phe Ala Gly Leu Gly Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr
625 630 635 640
Lys
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