阅读说明：本技术 医用叶酸盐 (Folates for medical use ) 是由 M·乌尔曼 G·维斯勒 A·博登穆勒 M·米勒 于 2018-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及无定形叶酸盐。该盐由叶酸阴离子和有机阳离子组成。叶酸阴离子选自5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、(6S)-四氢叶酸、5,10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸及它们的氧化衍生物JK12A和Mefox,阳离子为选自精氨酸、胆碱、乙酰胆碱、1,1-二甲基-双胍、苯乙基-双胍、甜菜碱甲酯和二甲基氨基乙醇的有机化合物。阳离子是具有互补药理活性的有机化合物。(The present invention relates to amorphous folate. The salt consists of a folate anion and an organic cation. The folate anion is selected from the group consisting of 5-formyl- (6S) -tetrahydrofolic acid, 10-formyl- (6R) -tetrahydrofolic acid, 5-methyl- (6S) -tetrahydrofolic acid, 5, 10-methylene- (6R) -tetrahydrofolic acid and their oxidized derivatives JK12A and Mefox, and the cation is an organic compound selected from the group consisting of arginine, choline, acetylcholine, 1-dimethyl-biguanide, phenethyl-biguanide, betaine methyl ester and dimethylaminoethanol. The cation is an organic compound having complementary pharmacological activity.)

医用叶酸盐

技术领域

本发明涉及叶酸盐及其制备，以及包含叶酸盐的组合物。

背景技术

抑郁症和其他精神健康障碍例如痴呆症、自闭症、ADHD和阿尔茨海默氏病，以及慢性非传染性疾病(NCD)例如2型糖尿病、血管疾病和癌症，对患者和医疗系统来说，尤其是考虑到人口老龄化，是一个越来越大的负担。导致这些不同疾病的原因是多方面的；然而，作为一种常见的危险因素，在全身或特定组织中发现了次优的叶酸状态。

众所周知，B-复合体的维生素参与人体的许多代谢过程，例如碳水化合物转化为葡萄糖的过程，其中，葡萄糖被代谢产生能量。这些维生素在脂肪和蛋白质的分解中更为重要，在维持消化道内壁的肌张力和促进神经系统(如眼睛、皮肤、头发、肝脏)的健康方面发挥着重要作用。

此外，众所周知，叶酸在新细胞的生产和维持中是强制性的。在细胞快速分裂和生长的时期如婴儿期和妊娠期是尤其重要的。叶酸是复制DNA所必需的。因此，叶酸缺乏会阻碍DNA合成和细胞分裂，在临床上最影响骨髓(即，快速细胞更新的部位)。由于RNA和蛋白质的合成没有受到阻碍，故产生了大的红细胞(即，巨成红细胞)，从而导致巨细胞性贫血例如巨成红细胞性贫血，这在乳糜泻、营养性贫血、妊娠、婴儿或儿童期都可以看到。因此，成年人(特别是老年人)和儿童都需要叶酸来制造正常的红细胞和预防贫血。叶酸也有助于防止可能导致癌症的DNA改变。

叶酸衍生物例如各种四氢叶酸衍生物，也可用作药物或用作制备其他衍生物的基本物质。然而，众所周知，四氢叶酸及其衍生物具有极高的不稳定性，特别是由于它们对氧化的敏感性。特别地，5-甲酰四氢叶酸(亚叶酸(Folinic acid)，甲酰四氢叶酸(Leucovorin))作为主要在肿瘤学中的药物成分、作为甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶治疗的伴随疗法以及在与妊娠相关的叶酸缺乏性贫血的治疗、抗生素治疗等方面具有重要意义。在叶酸和还原叶酸中，钙盐可以说是最稳定的衍生物：US 5817659和US 6441168公开了5-甲基-(6R,S)-，(6S)-或(6R)-四氢叶酸的结晶盐(优选钙盐)，所述结晶盐具有每当量所述酸至少一当量的结晶水。5-甲基四氢叶酸是市场上唯一可以直接穿透血/脑屏障而无需进一步代谢的叶酸衍生物。天然存在的5-甲基四氢叶酸仅呈S型；R型被认为是生物化学上不活跃的，并通过肾脏排出。此外，已经报道了几种供人和动物食用的组合物，其包含叶酸和/或还原叶酸，以各种形式与维生素、精氨酸、赖氨酸、硫胺素和/或其他活性成分一起，作为营养补充剂或用于治疗和预防各种疾病，例如神经系统疾病、病理生理疾病、心血管疾病、关节炎和炎症。

各种叶酸盐是已知的。通常，这些盐包含叶酸和无机阳离子(如钙和镁)或有机阳离子(如葡萄糖胺或半乳糖胺)。这些碱土金属阳离子是惰性的，以至于它们本身对人体没有任何药理作用。已经广泛报道了这种盐在水溶液中的稀少溶解性。WO2009/103334描述了具有良好水溶性的5-甲基-四氢叶酸葡萄糖胺盐(5-MTHF-葡萄糖胺)。此外，叶酸盐在非极性溶剂中的溶解度也是非常有限的。例如，5-MTHF-葡萄糖胺被描述为乳白色至浅棕色粉末，极易溶于水(在25℃下)，可溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂(EFSA期刊2013；11(10)：3358)。已经公开了具有改进的叶酸溶解性和稳定性的水性组合物，例如在US9301922和US9642853中。此外，已经描述了许多叶酸的组合物，其包含叶酸和其他化合物例如维生素、赖氨酸、硫胺素和其他活性成分。然而，在水和非极性溶剂中具有良好溶解性的稳定的叶酸盐结合其他的活性化合物将允许更通用的药物组合物。

发明内容

本发明的目的是提供叶酸盐，其结合其他活性化合物并显示出良好的稳定性、在非极性溶剂中的高溶解度和良好的水溶性。

通过如本发明权利要求1所限定的叶酸盐来实现该目的。另外的优选实施方式以从属权利要求为准。

本发明的无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子和有机阳离子组成，其中该阴离子选自5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、(6S)-四氢叶酸、5,10-二甲酰基-(6S)-四氢叶酸、5-甲基-10-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、5,10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸及其氧化衍生物JK12A和Mefox。此外，阳离子为选自如下的有机化合物：精氨酸、胆碱、乙酰胆碱、1,1-二甲基-双胍、苯乙基双胍、甜菜碱甲酯和二甲基氨基乙醇。该叶酸盐在非极性溶剂中具有高溶解度，所述非极性溶剂与水相比具有0.82的相对极性。

特定的叶酸盐在特定的非极性溶剂中的溶解度大于5质量％(m/m)被认为是在非极性溶剂中的高溶解度。溶解度在20℃下测定。

Mefox的结构如下所示：

JK12A的结构如下所示：

Mefox和JK12A这两种化合物都是5-甲基-(6S)-四氢叶酸的氧化衍生物。

在一优选的实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子和有机阳离子组成。阴离子选自5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、(6S)-四氢叶酸、5,10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸及其氧化衍生物JK12A和Mefox。阳离子选自二-精氨酸、二-胆碱、二-乙酰胆碱、二-(1,1-二甲基-双胍)、二-(苯乙基-双胍)、二-甜菜碱甲酯和二-二甲基氨基乙醇。

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子和有机阳离子组成，其中阴离子选自5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、(6S)-四氢叶酸、5,10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸及其氧化衍生物JK12A和Mefox，其中阳离子选自单-精氨酸、单-胆碱、单-乙酰胆碱、单-(1,1-二甲基-双胍)、单-(苯乙基-双胍)、单-甜菜碱甲酯和单-二甲基氨基乙醇。

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-精氨酸组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-(1,1-二甲基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.51/7.8	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.54/7.50	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.62/6.57	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.73	多重峰(m)	1H
			4.27	多重峰(m)	1H
3.42	多重峰(m)	1H
			3.28	多重峰(m)	2H
3.16	多重峰(m)	1H
			2.92	单峰(s)	6H
2.32	多重峰(m)	2H
			2.12	多重峰(m)	1H
1.95	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-(苯乙基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-胆碱组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.50/7.80	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.54/7.50	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.62/6.57	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.73	多重峰(m)	1H
			4.27	多重峰(m)	1H
3.93	多重峰(m)	2H
			3.43	多重峰(m)	1H
3.39	多重峰(m)	2H
			3.27	多重峰(m)	2H
3.16	多重峰(m)	1H
			3.07	单峰(s)	9H
2.32	多重峰(m)	2H
			2.12	多重峰(m)	1H
1.95	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-(1,1-二甲基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.57	多重峰(m)	1H
			3.38	多重峰(m)	2H
3.20	多重峰(m)	1H
			3.13	多重峰(m)	1H
2.95	单峰(s)	6H
			2.84	多重峰(m)	1H
2.67	单峰(s)	3H
			2.26	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-(苯乙基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-胆碱组成，在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.56	双峰(d)	2H
6.65	双峰(d)	2H
			4.20	多重峰(m)	1H
3.95	多重峰(m)	2H
			3.43	多重峰(m)	1H
3.40	三重峰(t)	2H
			3.20	双峰(d)	1H
3.08	单峰(s)	9H
			3.04	多重峰(m)	1H
2.99	多重峰(m)	1H
			2.89	多重峰(m)	1H
2.42	单峰(s)	3H
			2.20	多重峰(m)	2H
2.04	多重峰(m)	1H
			1.91	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-2-二甲基氨基乙醇组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-精氨酸组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.69	三重峰(t)	1H
			3.58	多重峰(m)	1H
3.41	多重峰(m)	2H
			3.19	多重峰(m)	5H
2.71	单峰(s)	3H
			2.27	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H
1.83	多重峰(m)	2H
			1.60	多重峰(m)	2H

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-乙酰胆碱组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子单-乙酰胆碱组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形四氢叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-精氨酸组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.53/7.82	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.56/7.53	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.64/6.59	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.75	多重峰(m)	1H
			4.21	多重峰(m)	1H
3.66	三重峰(t)	2H
			3.44	多重峰(m)	1H
3.30	多重峰(m)	2H
			3.17	多重峰(m)	1H
3.11	单峰(s)	4H
			2.23	多重峰(m)	2H
2.07	多重峰(m)	1H
			1.95	多重峰(m)	1H
1.79	多重峰(m)	4H
			1.58	多重峰(m)	4H

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-胆碱组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-(1,1-二甲基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.57/7.86	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.60/7.56	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.68/6.63	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.80	多重峰(m)	1H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.48	多重峰(m)	1H
			3.33	多重峰(m)	2H
3.22	多重峰(m)	1H
			2.96	单峰(s)	12H
2.25	多重峰(m)	2H
			2.10	多重峰(m)	1H
1.96	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-(苯乙基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-精氨酸组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-(1,1-二甲基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.44	多重峰(m)	1H
			3.24	多重峰(m)	1H
3.10	多重峰(m)	1H
			3.01	多重峰(m)	1H
2.95	单峰(s)	12H
			2.92	多重峰(m)	1H
2.48	单峰(s)	3H
			2.25	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.97	多重峰(m)	1H

在另一实施方式中，无定形叶酸盐由四氢叶酸阴离子5-甲基-(6S)-四氢叶酸和有机阳离子二-(苯乙基-双胍)组成，无定形四氢叶酸盐在重水(D₂O)中的¹H-NMR位移为：

在另一优选实施方式中，药物组合物包含至少一种本发明的叶酸盐作为主要活性化合物。该组合物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。该组合物可以包含例如缓冲化合物。合适的以及优选的缓冲化合物为氨基丁三醇和羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。此外，组合物中可能存在抗氧化剂化合物。优选的抗氧化剂化合物为硫代甘油、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。

此外，至少一种本发明的叶酸盐用于制备药物、食品添加剂或营养补充剂，所述药物、食品添加剂或营养补充剂用于预防和/或治疗施用叶酸盐会产生正向促进作用的缺陷或疾病。有许多疾病状况受到包含叶酸盐的组合物的正向促进作用。这些疾病例如是病理生理疾病、神经疾病和炎性疾病。

另外，提供用于制备本发明的无定形叶酸盐的方法，其包括将草酸或氟化物盐加入到叶酸碱土金属盐的水性组合物中的步骤，所述四氢叶酸盐由叶酸阴离子和有机阳离子组成。

具体实施方式

实施例

实施例1

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-L-精氨酸盐的制备

在氩气、70℃下，将10.0g(16.62mmol)左亚叶酸钙五水合物溶于230ml水中。然后依次加入5.79g(33.24mmol)L-精氨酸和2.09g(16.62mmol)草酸二水合物。冷却至室温(RT)后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用甲醇使粗产物充分分散(digested)、过滤并在60℃下真空干燥，得到13.63g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+1.75°(c＝1，H₂O)

实施例2

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-(二甲双胍)盐的制备

在氩气、70℃下，将1.86g(3.09mmol)左亚叶酸钙五水合物溶于43ml水中。然后依次加入0.80g(6.18mmol)二甲双胍游离碱和0.39g(3.09mmol)草酸二水合物。冷却至室温(RT)后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用乙醇使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到2.13g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-2.84°(c＝1，H₂O)

实施例3

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-(苯乙双胍)盐的制备

在氩气、70℃下，将1.21g(2.02mmol)左亚叶酸钙五水合物溶于43ml水中。然后依次加入0.83g(4.04mmol)苯乙双胍游离碱和0.25g(2.02mmol)草酸二水合物。冷却至室温(RT)后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 5.5)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到1.80g标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.52/7.84	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.60/7.56	双峰(d)/双峰(d)	2H
			7.31	多重峰(m)	4H
7.23	多重峰(m)	6H
			6.67/6.61	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.77	多重峰(m)	1H
			4.26/4.22	多重峰(m)	1H
3.48	多重峰(m)	1H
			3.42	多重峰(m)	4H
3.28	多重峰(m)	2H
			3.16	多重峰(m)	1H
2.79	多重峰(m)	4H
			2.26	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H

旋光度：α^20D+1.39°(c＝1，H₂O)

实施例4

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-胆碱盐的制备

在氩气、70℃下，将1.92g(3.19mmol)左亚叶酸钙五水合物溶于40ml水中。然后加入经过滤的0.79g(6.38mmol)胆碱氟化物(由胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。冷却至0℃后，将析出的氟化钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6.5)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到1.89g标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.60/7.88	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.63/7.59	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.71/6.66	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.83	多重峰(m)	1H
			4.27	多重峰(m)	1H
4.01	多重峰(m)	4H
			3.48	多重峰(m)	1H
3.47	多重峰(m)	4H
			3.37	多重峰(m)	2H
3.27	多重峰(m)	1H
			3.14	单峰(s)	18H
2.26	多重峰(m)	2H
			2.11	多重峰(m)	1H
1.98	多重峰(m)	1H

旋光度：α^20D+1.14°(c＝1，H₂O)

实施例5

5-甲基-(6S)-四氢叶酸二-L-精氨酸盐的制备

在氩气、70℃下，将10.0g(17.67mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O(calciumlevomefolate×3.8hydrate)悬浮于100ml水中。然后依次加入2.23g(17.67mmol)草酸二水合物和6.15g(35.33mmol)L-精氨酸。冷却至0℃后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用甲醇使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到13.98g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+30.0°(c＝1，H₂O)

实施例6

5-甲基-(6S)-四氢叶酸二-(二甲双胍)盐的制备

在氩气、70℃下，将1.49g(2.63mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于38ml水中。然后依次加入溶于水中的0.332g(2.63mmol)草酸二水合物和溶于水中的0.68g(5.26mmol)二甲双胍游离碱。冷却至0℃后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到1.89g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+17.95°(c＝1，H₂O)

实施例7

5-甲基-(6S)-四氢叶酸二-(苯乙双胍)盐的制备

在氩气、70℃下，将1.64g(2.90mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于35ml水中。然后依次加入溶于水中的0.366g(2.90mmol)草酸二水合物和溶于水中的0.68g(5.26mmol)苯乙双胍游离碱。冷却至0℃后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 5.5)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到2.54g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+16.06°(c＝1，H₂O)

实施例8

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单L-精氨酸盐的制备

在氩气、70℃下，将0.258g(0.429mmol)左亚叶酸钙五水合物溶解于6ml水中。然后依次加入0.0747g(0.429mmol)L-精氨酸和溶于水中的0.0541g(0.429mmol)草酸二水合物。冷却至室温后，将析出的草酸钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 4)蒸发至干。然后用甲醇使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到0.274g标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.69	三重峰(t)	1H
			3.58	多重峰(m)	1H
3.41	多重峰(m)	2H
			3.19	多重峰(m)	5H
2.71	单峰(s)	3H
			2.27	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H
1.83	多重峰(m)	2H
			1.60	多重峰(m)	2H

旋光度：α^20D+0.62°(c＝1，H₂O)

实施例9

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单-(二甲双胍)盐的制备

在氩气下，将100.0mg(0.2112mmol)左亚叶酸和28.1mg(0.2175mmol)二甲双胍游离碱悬浮于2ml水和4ml甲醇中。搅拌和超声处理15分钟后，将所得溶液(pH 5)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到122mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.51/7.8	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.54/7.50	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.62/6.57	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.73	多重峰(m)	1H
			4.27	多重峰(m)	1H
3.42	多重峰(m)	1H
			3.28	多重峰(m)	2H
3.16	多重峰(m)	1H
			2.92	单峰(s)	6H
2.32	多重峰(m)	2H
			2.12	多重峰(m)	1H
1.95	多重峰(m)	1H

旋光度：α^20D-15.3°(c＝1，H₂O)

实施例10

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单-(苯乙双胍)盐的制备

在氩气下，将100.1mg(0.2114mmol)左亚叶酸和44.7mg(0.2178mmol)苯乙双胍游离碱悬浮于4ml水和4ml甲醇中。搅拌和超声处理10分钟后，将所得溶液(pH 5)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到137mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+13.50°(c＝1，H₂O)

实施例11

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单-胆碱盐的制备

在氩气下，将100.0mg(0.2112mmol)左亚叶酸和62.5μl(0.2218mmol)的氢氧化胆碱的45％甲醇溶液悬浮于2ml水和4ml甲醇中。搅拌5分钟后，进行超声处理并加热至回流，将所得的轻微浑浊的溶液(pH 5)趁热通过注射器过滤器过滤并蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在60℃下真空干燥，得到118mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-16.3°(c＝1，H₂O)

实施例12

5-甲基-(6S)-四氢叶酸单-(二甲双胍)盐的制备

在氩气下，将72.7mg(0.1582mmol)L-5-甲基四氢叶酸和21.5mg(0.1661mmol)二甲双胍游离碱悬浮于10ml水和20ml甲醇中。搅拌、超声处理和回流后，将所得溶液蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在50℃下真空干燥，得到94.6mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.57	多重峰(m)	1H
			3.38	多重峰(m)	2H
3.20	多重峰(m)	1H
			3.13	多重峰(m)	1H
2.95	单峰(s)	6H
			2.84	多重峰(m)	1H
2.67	单峰(s)	3H
			2.26	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H

实施例13

5-甲基-(6S)-四氢叶酸单-(苯乙双胍)盐的制备

在氩气下，将90.4mg(0.1967mmol)L-5-甲基四氢叶酸和42.4mg(0.2066mmol)苯乙双胍游离碱悬浮于5ml水和10ml甲醇中。搅拌、超声处理和回流一段时间后，将所得溶液蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散、过滤并在50℃下真空干燥，得到133mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-5.90°(c＝0.235，H₂O)

实施例14

5-甲基-(6S)-四氢叶酸单-胆碱盐的制备

在氩气、95℃下，将2.61g(4.611mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于60ml水中。然后加入经过滤的568mg(4.611mmol)胆碱氟化物(由胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。在95℃下继续搅拌10分钟，冷却至室温(RT)后，将析出的氟化钙通过Hyflo垫滤出，并将所得澄清溶液(pH 6.5)蒸发至干，得到2.568g标题化合物。在50℃下用乙醇使粗产物充分分散，然后在冰浴中冷却并过滤，在60℃下真空干燥，得到1.67g标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+0.1°(c＝1，H₂O)

实施例15

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-乙酰胆碱盐的制备

在氩气、70℃下，将330.6mg(0.5496mmol)左亚叶酸钙五水合物溶解于6ml水中。然后在30℃下加入经过滤的181.6mg(1.099mmol)乙酰胆碱氟化物(由乙酰胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。冷却至0℃后，将析出的氟化钙通过注射器过滤器滤出，并将所得澄清溶液(pH 6)蒸发至干，得到407mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-3.4°(c＝1，H₂O)

实施例16

5-甲基-(6S)-四氢叶酸二-乙酰胆碱盐的制备

在氩气、70℃下，将331.8mg(0.5862mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于8ml水中。然后在50℃下加入经过滤的193.6mg(1.172mmol)乙酰胆碱氟化物(由乙酰胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。冷却至0℃后，将析出的氟化钙通过注射器过滤器滤出，并将所得澄清溶液(pH 6.5)蒸发至干，得到433mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.55	双峰(d)	2H
6.64	双峰(d)	2H
			4.42	多重峰(m)	4H
4.19	多重峰(m)	1H
			3.60	多重峰(m)	4H
3.40	多重峰(m)	1H
			3.19	多重峰(m)	1H
3.09	单峰(s)	18H
			3.02	多重峰(m)	1H
2.96	多重峰(m)	1H
			2.87	多重峰(m)	1H
2.42	单峰(s)	3H
			2.19	多重峰(m)	2H
2.05	多重峰(m)	1H
			2.02	单峰(s)	6H
1.90	多重峰(m)	1H

旋光度：α^20D 17.04°(c＝1，H₂O)

实施例17

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-甜菜碱甲酯盐的制备

在氩气下，将50.6mg(0.0736mmol)左亚叶酸银悬浮于2ml水中。然后加入38.1mg(0.1473mmol)甜菜碱甲酯碘化物溶于1ml水中的溶液，并将混合物在搅拌下加热至90℃。冷却后，将悬浮液通过注射器过滤器过滤，并将得到的澄清溶液蒸发，在50℃下真空干燥，得到56mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.52/7.81	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.56/7.52	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.64/6.59	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.75	多重峰(m)	1H
			4.22	单峰(s)	4H
4.21	多重峰(m)	1H
			3.73	单峰(s)	6H
3.44	多重峰(m)	1H
			3.30	多重峰(m)	2H
3.22	单峰(s)	18H
			3.21	多重峰(m)	2H
2.22	多重峰(m)	2H
			2.06	多重峰(m)	1H
1.93	多重峰(m)	1H

实施例18

5-甲基-(6S)-四氢叶酸二-甜菜碱甲酯盐的制备

在氩气、70℃下，将520.1mg(0.919mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于6ml水中。然后在20℃下加入经过滤的291.8mg(1.930mmol)甜菜碱甲酯氟化物(由甜菜碱甲酯碘化物和氟化银获得)的水溶液。冷却至0℃后，将析出的氟化钙通过注射器过滤器滤出，并将所得的澄清溶液(pH 6.5)蒸发，在40℃下真空干燥，得到682mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+10.5°(c＝1，H₂O)

实施例19

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸二-(2-二甲基氨基乙醇)盐的制备

在氩气下，将58.0mg(0.1225mmol)左亚叶酸悬浮于0.5ml水中并用24.7μl(0.2450mmol)的2-二甲基氨基乙醇(地阿诺(deanol))处理。将混合物在室温(rt)下搅拌直至形成澄清溶液，蒸发并在45℃下真空干燥，得到77mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-8.5°(c＝1，H₂O)

实施例20

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单-(2-二甲基氨基乙醇)盐的制备

在氩气下，将71.6mg(0.1512mmol)左亚叶酸悬浮于2ml水和5ml甲醇中并用15.7μl(0.1558mmol)的2-二甲基氨基乙醇(地阿诺(deanol))处理。超声处理并迅速加热至60℃后，形成澄清溶液(pH 5)。蒸发该溶液，并在45℃真空干燥，得到89.6mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			8.58/7.87	单峰(s)/单峰(s)	1H
7.61/7.57	双峰(d)/双峰(d)	2H
			6.69/6.64	双峰(d)/双峰(d)	2H
4.81	多重峰(m)	1H
			4.33	多重峰(m)	1H
3.85	三重峰(t)	2H
			3.50	多重峰(m)	1H
3.34	多重峰(m)	2H
			3.24	三重峰(t)	2H
3.22	多重峰(m)	1H
			2.87	单峰(s)	6H
2.38	多重峰(m)	2H
			2.17	多重峰(m)	1H
2.01	多重峰(m)	1H

旋光度：α^20D-13.8°(c＝1，H₂O)

实施例21

5-甲基-(6S)-四氢叶酸单-L-精氨酸盐的制备

在氩气下，将82.0mg(0.1785mmol)L-5-甲基四氢叶酸悬浮于10ml水和20ml甲醇中。加入31.1mg(0.1785mmol)L-精氨酸，并对混合物进行处理直至形成溶液。将其蒸发，用乙腈充分分散，过滤并在50℃下真空干燥，得到109.7mg标题化合物。分析数据如下：

<u>化学位移δ(1H)，以ppm表示</u>	<u>多重度(Multiplicity)</u>	<u>强度(Intensity)</u>
			7.59	双峰(d)	2H
6.67	双峰(d)	2H
			4.25	多重峰(m)	1H
3.69	三重峰(t)	1H
			3.58	多重峰(m)	1H
3.41	多重峰(m)	2H
			3.19	多重峰(m)	5H
2.71	单峰(s)	3H
			2.27	多重峰(m)	2H
2.10	多重峰(m)	1H
			1.96	多重峰(m)	1H
1.83	多重峰(m)	2H
			1.60	多重峰(m)	2H

实施例22

5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸单-乙酰胆碱盐的制备

在氩气、70℃下，将656.0mg(1.090mmol)左亚叶酸钙五水合物溶于10ml水中。然后在30℃下加入经过滤的180.1mg(1.090mmol)乙酰胆碱氟化物(由乙酰胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。冷却至0℃后，将析出的氟化钙通过注射器过滤器滤出，并将所得的澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散，过滤并在50℃下真空干燥，得到640mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D-7.7°(c＝1，H₂O)

实施例23

5-甲基-(6S)-四氢叶酸单-乙酰胆碱盐的制备

在氩气、70℃下，将625.6mg(1.105mmol)L-5-甲基四氢叶酸钙·3.8H₂O悬浮于12ml水中。然后在30℃下加入经过滤的182.6mg(1.105mmol)乙酰胆碱氟化物(由乙酰胆碱氯化物和氟化银获得)的水溶液。将混合物迅速加热至60℃并再次冷却至20℃后，将析出的氟化钙通过注射器过滤器滤出，并将所得的澄清溶液(pH 6)蒸发至干。然后用乙腈使粗产物充分分散，过滤并在50℃下真空干燥，得到637mg标题化合物。分析数据如下：

旋光度：α^20D+29.7°(c＝1，H₂O)

所选叶酸盐的溶解度测定通常按照下述操作进行：

提供与预期溶解度相对应的一定量的盐(1-100mg之间)，并与相应溶剂的增量混合直至形成溶液。这可能需要更长的时间，尤其是对于高溶解性的盐(会导致具有极高粘度的溶液)。

对5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸和5-甲基-(6S)-四氢叶酸的两种二精氨酸盐在甘油中的溶解度进行了更详细的测试。首先将二精氨酸盐在玛瑙研钵中细磨，然后与甘油混合(50mg于1ml溶剂中(5％m/v)，在氩气下)，并用磁力搅拌器搅拌。搅拌过夜后，获得澄清溶液。在确定了5％(m/v)的溶解度之后，以两倍的浓度进行相同的操作，得到溶液。即使浓度为20％(m/v)，所得溶液也非常粘稠。

作为比较，进行了5-甲基-(6S)-四氢叶酸(Gelpell)的钙盐在甘油中的溶解度测定。该盐在5％(m/v)、2.5％(m/v)和1.6％(m/v)下是明显不溶的。在1.25％(m/v)下获得了溶液，初始时略带乳状，但经过整个周末的搅拌后明显溶解。这证实了先前的数据：该钙盐的溶解度约为1％。

精氨酸(被研碎过的)在甘油中的溶解度：100mg溶于500μl中，溶解性良好，200mg溶于500μl中，经搅拌过夜后得到溶液，36h后得到澄清溶液。(优质甘油：99.5％，含量测定99.99％，水(未指定)。(密度：1.26g/ml))

所有溶解度数据均以质量％(m/m)表示；溶解度在20℃下测定：

相对极性数据来源：NIST网站：http://webbook.nist.gov/chemistry/

FTHF＝5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸

MTHF＝5-甲基-(6S)-四氢叶酸

定量HPLC测量(将20.00mg物质溶于10.00ml H₂O，注入量为1.0μl，在280nm下)

地阿诺(Deanol)＝二甲基氨基乙醇。