从海藻提取物中鉴定和分离生物活性化合物的方法
阅读说明：本技术 从海藻提取物中鉴定和分离生物活性化合物的方法 (Method for identifying and isolating bioactive compounds from seaweed extract ) 是由 席琳·科南 菲利普·波汀 安妮·吉博伊 萨曼莎·贝丝 让－玛丽·朱伯特 于 2018-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种分离和纯化从海藻获得的提取物中的生物活性化合物的方法。该方法包括以下步骤：(a)使所述提取物循环通过具有合适的截留分子量的超滤膜；(b)收集来自所述提取物的滤液,以获得第一滤液级分和渗余物；和(c)冲洗所述渗余物以获得一种或多种另外的滤液级分。然后可以评估第一滤液级分和另外的滤液级分的生物活性以确定它们对植物生长的功效。还描述了分离自藻类物种的一种或多种生物活性分子,其中所述一种或多种生物活性分子具有在约0.15kDa至约1.0kDa范围内的分子量并且能够增强或改善植物生长。(The present invention relates to a method for the isolation and purification of biologically active compounds in extracts obtained from seaweed. The method comprises the following steps: (a) circulating the extract through an ultrafiltration membrane having a suitable molecular weight cut-off; (b) collecting the filtrate from the extract to obtain a first filtrate fraction and a retentate; and (c) rinsing the retentate to obtain one or more further filtrate fractions. The biological activity of the first filtrate fraction and the additional filtrate fraction can then be evaluated to determine their efficacy on plant growth. Also described are one or more bioactive molecules isolated from an algal species, wherein the one or more bioactive molecules have a molecular weight in the range of about 0.15kDa to about 1.0kDa and are capable of enhancing or improving plant growth.)
技术领域
本发明一般涉及从海藻提取物中纯化和分离负责植物生长刺激的生物活性化合物的方法。
背景技术
现代农业的挑战之一是解决对农业生产的可持续性、质量和安全性的社会需求，并通过改善产量和作物对变化环境的耐受性使其适应世界人口增长。
生物刺激物可用于改善植物营养，影响产量和品质参数。植物生物刺激物通常属于这些类别之一，即含有激素的产品、基于植物提取物的产品、基于微量营养素的产品、含有氨基酸的产品和含有腐植酸的产品，但可以不严格地仅限于这些类别。考虑到其增加生长速率，增加胁迫耐受性，增加光合速率和增加疾病耐受性的能力，植物生物刺激物用于处理商业环境中的作物。通常认为植物生物刺激物通过上调或下调关键生物路径基因而起作用。
如欧洲生物刺激物工业理事会(EBIC)所定义的，植物生物刺激物含有一种或多种物质和/或微生物，其在应用于植物或根际时的功能是刺激天然过程，以增强/有益于养分吸收、养分效率、对非生物胁迫的耐受性和作物质量。生物刺激物对害虫没有直接作用，因此不属于农药的监管框架。
生物刺激物可以以各种配方和各种成分获得，但通常基于它们的来源和含量进行分类。这些分组包括腐殖物质(HS)和含氨基酸的产品(AACP)。
生物刺激物可以以各种配方和各种成分获得，但通常根据它们的来源和含量分为七大组。这些分组包括腐殖物质(腐殖酸和富里酸，蛋白质水解产物和其他含N化合物，海藻提取物和植物性药材，壳聚糖和其他生物聚合物，无机化合物，有益真菌和有益细菌。
尽管商业上可获得大量肥料和植物生物刺激物，但仍然需要能够满足各种需要的改良产品。因此，需要用于改善植物生长响应和发育的新产品和方法。
由于海藻和海藻衍生的产品中存在许多植物生长刺激化合物，所以在这些产品已经广泛用于作物生产系统中。因此，由于缺乏关于海藻中存在的生长因子及其在影响植物生长中的各种作用模式的科学数据，这些产品中的许多的生物刺激潜能尚未被充分开发。
虽然已经研究了海藻提取物对植物防御和植物生长的生理作用，但是关于海藻提取物中负责这些植物刺激物的特定生物活性化合物知之甚少。加速藻类(包括例如褐藻提取物)中这些生物活性组分的鉴定将是合乎需要的。
褐藻科(Phaeophyceae)或褐藻是一大组主要为海洋多细胞藻类，包括位于两个半球水域中的多种类型的海藻。它们在作为食物和作为栖息地的海洋环境中起重要作用。许多褐藻，如褐藻目(Fucales)的成员，通常沿石质海岸生长。全世界已知超过1500种的褐藻。一些物种，例如泡叶藻(Ascophyllum nodosum)，在商业用途中是重要的并且也具有环境影响。
Michailovna等人的第7,611,716号美国专利描述了一种处理海藻以在单一过程中获得包含酸性和中性多糖的提取物和包含可用于医药、食品、香料和化妆品工业的低分子量生物活性化合物的提取物的方法。然而，该参考文献仅描述了处理海藻的方法，并且没有提供鉴定其中含有的潜在植物生物刺激物化合物的任何方法。
Strong等人的第3,856,569号美国专利描述了通过对溶液进行超滤而从源自海藻(红藻(Rhodophyceae)和褐藻(Phaeophyceae))的水溶液中纯化和浓缩期望的多糖(如角叉菜胶或藻酸盐)的方法。然而，该参考文献再次仅提供了一种处理海藻的方法，并且没有提供任何鉴定其中含有的生物刺激物化合物的方法。
由于对有机、环境友好且对人类健康无害的产品的需求日益增长，因此对天然生物刺激物的需求增加。此外，需要与已经使用的传统生物刺激物相比类似或更有效的生物刺激物。此外，本领域仍然需要改进的分离和纯化生物刺激物化合物的方法，所述生物刺激物化合物包括来自海藻的提取物。
发明内容
本发明的目的是鉴定和纯化可用作植物生物刺激物的物质。
本发明的另一个目的是鉴定和纯化各种海藻提取物中负责刺激植物生长的生物活性化合物。
为此，在一个实施方案中，本发明一般涉及分离自藻类物种的一种或多种生物活性分子，所述一种或多种生物活性分子具有在约0.15kDa至约1.0kDa范围内的分子量。
在另一个实施方案中，本发明一般涉及分离和纯化从海藻获得的提取物中的生物活性化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使所述提取物循环通过具有合适的截留分子量的超滤膜；
b)收集来自所述海藻提取物的滤液，以获得第一滤液级分和渗余物；和
c)冲洗所述渗余物以获得一种或多种另外的滤液级分。
附图说明
为了更全面地理解本发明，结合附图参考以下描述，其中：
图1a和1b描绘了在过滤的RM-3496提取物上进行的尺寸排阻色谱法(SEC)分级分离以及在SEC上注入的标准物的色谱图以评估在不同的级分中存在的分子的平均分子量。
图2描绘了示出RM-3496对莴苣的SEC分级分离的功效的箱形图。
图3a和3b描绘了箱形图，示出了与未处理对照、RM-3496提取物和重建的RM-3496提取物相比，用F3级分处理的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的体外培养物的地上部鲜重和根鲜重。
图4描绘了根据本发明的一个方面的超滤方法的视图。
图5描绘了箱形图，示出了用各种超滤级分、渗余物和提取物处理的莴苣的地上部鲜重。
图6描绘了箱形图，示出了用各种超滤级分、渗余物和提取物处理的小麦的地上部鲜重。
发明详述
植物“生物刺激剂”是指含有一种或多种物质和/或微生物的有机材料，当将所述物质和/或微生物施用于植物或根际时的功能是刺激天然过程，以增强/有益于养分吸收、养分效率、对非生物胁迫的耐受性和作物质量。
当介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词”一”、”一个“、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的并且意指可以存在除了所列出的要素之外的另外的要素。
如本文所用，术语“约”是指可测量的值，例如参数、量、持续时间等，并且意在包括具体列举值的+/-15％或更少的变化、优选地+/-10％或更少的变化、更优选+/-5％或更少的变化、甚至更优选+/-1％或更少的变化、并且仍更优选+/-0.1％或更少的变化，只要此类变化适合于执行在此描述的发明即可。此外，还应理解，修饰语“约”所涉及的值本身在本文中具体公开。
本发明描述了从源自海藻的提取物中纯化和分离生物刺激物化合物的方法，所述提取物能够增加宽范围作物的生长速率和产量。
如本文所述，在一个实施方案中，本发明提供了通过海藻提取物的代谢组学图谱来纯化在海藻提取物中负责刺激植物生长的生物活性化合物的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明一般涉及分离自藻类物种的一种或多种生物活性分子，所述一种或多种生物活性分子具有在约0.15kDa至约1.0kDa范围内的分子量。所述一种或多种生物活性分子是能够改善植物生长的生物活性分子。在一个实施方案中，藻类物种是褐藻物种。所述褐藻可以包含藻类物种，所述藻类物种选自包括以下的组：泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、马尾藻属(Sargassum sp.)以及前述一种或多种的组合。在一个实施方案中，所述一种或多种生物活性分子不包含硫酸化多糖或海带多糖。
本发明还一般涉及改善植物生长的方法，所述方法包括将包含分离的一种或多种生物活性分子的组合物施用于土壤、植物或种子中的至少一种的步骤。改善植物生长包括以下中的至少一种：促进种子发芽、刺激根发育、延长营养期、增加生产期或增加收获期。
本发明总体上还涉及一种分离和纯化从海藻获得的提取物中的生物活性化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)使所述提取物循环通过具有合适的截留分子量的超滤膜；
b)收集来自所述提取物的滤液，以获得第一滤液级分和渗余物；和
c)冲洗所述渗余物以获得一种或多种另外的滤液级分。
该方法进一步包括评估第一滤液级分和另外的滤液级分的生物活性以确定它们对植物生长的功效的步骤。对植物生长的功效可包括以下中的至少一种：促进种子发芽、刺激根发育、延长营养期、增加生产期或增加收获期。根据一个实施方案，所述提取物产生自褐藻物种。所述提取物可获自泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、墨角藻(Fucusvesiculosus)、或马尾藻属(Sargassum sp.)藻类。
在一个优选的实施方案中，渗余物包含选自由硫酸化多糖和海带多糖组成的组的活性分子，其是能够减轻作物中的非生物胁迫(如盐过量)的活性分子。所述第一滤液包含具有在约0.15kDa至约1.0kDa范围内的分子量的生物活性分子。
超滤膜可以具有小于3kDa的截留分子量(MWCO)，优选小于2kDa的MWCO，并且最优选小于1kDa的MWCO。
泡叶藻(Ascophyllum nodosum)(岩藻)是在北大西洋发现的褐藻类岩藻物种，已被用作农业作物的生物刺激物来源，以改善植物生长、植物生产力和食物质量。
根据分子的极性和大小，检测了几种纯化技术以对这些海藻提取物进行脱盐和纯化。对于每个纯化程序，在莴苣上测定级分，以确保生物活性保持在不同的脱盐级分中或保持与盐缔合。将该纯化步骤应用于海藻提取物(RM-2705，从获得的岩藻提取物)并且非极性纯化级分显示出高纯度水平。大多数生物分子(约69％)用盐共洗脱以显示生物活性分子位于非极性纯化级分之一中。然后，在莴苣上测试不同级分与全提取物的比较。然而，结果显示负责刺激植物生长的生物活性分子存在于也含有盐的极性部分中。确定根据RM-2705和RM-3496提取物中所含分子的极性分级分离不适用于海藻提取物的脱盐和纯化。实际上，对于所使用的所有分级分离技术，生物活性分子保持与盐缔合。
因此，提出了另一种使海藻提取物脱盐同时保持植物生长生物刺激活性的方法的挑战。研究了各种纯化技术，包括使用乙酸乙酯的液液萃取(LLE)，使用不同吸附剂的固相萃取(SPE)(正相：氰基丙基-二氧化硅和反相“XAD2”，使用丁醇的固液萃取(SLE)和尺寸排阻色谱法(SEC)。
此外，为了获得关于生物活性分子的稳定性的信息，在莴苣上测定RM-2705提取物的活性的热稳定性。结果表明，该生物活性分子具有一定的热稳定性，并且经处理的提取物的高压灭菌或煮沸增加了莴苣的地上部鲜重。
根据极性分级分离似乎在纯化生物活性分子方面效率低下，因此根据海藻提取物分子的粒度分级分离，以尝试其脱盐。
确定了除了使用30树脂的尺寸排阻色谱法(SEC)之外，所有这些技术对于该目的似乎是低效的，尺寸排阻色谱法也称为凝胶过滤色谱法(GP)。发现SEC是脱盐和纯化海藻滤液的唯一有效方法。
基于此，通过SEC分级分离方法将海藻提取物(RM-3496)分级分离，并根据分子的大小(或分子量)洗脱分子，如图1.a所示。使用Superdex树脂(瑞典比约克坦GE医疗(GEHealthcare))来确保分子量低于10kDa的分子的良好分离。分子越小(即分子量越小)，捕获在凝胶的多孔珠中的分子越多，并且被洗脱得越晚。因此，分子的分子量从第一级分(即，F1)到最后级分(即，F6)降低。级分F1和F2由比盐更快地流过柱的较大分子构成，并且非常低分子量的分子在级分F5和F6中洗脱。
为了评估含在不同级分中的分子的分子量范围，将标准品的混合物(0.5％w/v)注射到SEC系统上。标准品的色谱图描绘在图1.b中。a)海带多糖(从约3至约5kDa，b)棉子糖(594Da)，c)蔗糖(343.3Da)，d)柠檬酸盐(343.3Da)，e)甘露醇(182.2Da)和f)甘氨酸(75.1Da)。根据这些结果，级分F1含有高分子量(高于4kDa)的分子，级分F2含有在级分F1和F2之间洗脱的海带多糖(从约3至约5kDa)。
将RM-2705提取物在具有1kDa截留膜的超滤系统上超滤后获得的超滤液注入SEC系统。超滤液的色谱图仅显示对应于来自RM-2705提取物的SEC分级分离的级分F3、F4、F5和F6的那些的色谱峰。因此，级分F3含有分子量小于1kDa至约0.18kDa的分子，级分F4含有分子量小于约0.2kDa的分子，例如甘露醇(182.2Da)，级分F5和F6含有盐和分子量非常低的分子，如甘氨酸(75Da)。不同级分的NMR光谱证实在第一级分F1中存在硫酸化多糖(岩藻聚糖聚合物)，而第二级分F2含有海带多糖(从约3至约5kDa)，并且级分四F4含有甘露醇(182.2Da)。后两个级分F5和F6含有分子量非常低的分子和盐。
通过SEC分级分离获得的不同级分与全海藻提取物RM-3496相比，测试了它们对莴苣的植物生长刺激活性。在色谱法注射之前，过滤海藻提取物，并且还在莴苣上测试该过滤的提取物以检查其功效。结果表明，如图2所示，在F3级分中发现了生物活性分子。在含有约0.15kDa至约1kDa分子的F3级分中发现了显著的活性。
将RM-2705提取物进行脱盐的不同技术组合，提供了有关生物活性分子物理化学性质的信息。具体地，确定了这些生物活性分子是极性的并且它们的分子量范围从约0.15至约1kDa。因此，该信息从促进生长的生物活性聚合物中排除了岩藻多糖聚合物，它们是泡叶藻(Ascophyllum nodosum)酸性提取物中的主要硫酸化多糖，海带多糖(从约3至约4kDa)，β-1,3-葡聚糖激发剂和甘露醇(182Da)，甘露醇为一种多元醇，按干重计可占提取物的约8-10％。
为了确定纯化的F3级分的生物活性，使用模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)进行体外培养并繁殖数次。这些测试在图3.a中示出。证实了F3级分的生物活性，而RM-3496提取物中盐的存在干扰了拟南芥在这些培养条件下的生长。然而，对应于用SEC级分重构海藻提取物的重建-RM-3496显示出生长促进活性。此外，在该体外生物检测中，级分F3和重建-RM-3496也似乎增强根生长，如图3.b所示。
级分F3显示出强的生长刺激活性，而级分F1和F2是无活性的。然而，在后一生物测定的开发过程中，显示在盐(100mM氯化钠)存在下，级分F3不再具有刺激生长的活性，而F1和F2显示相似的作用，并且整个RM-2705提取物赋予盐耐受性。这些结果表明RM-2705提取物含有具有不同作用模式的不同活性化合物，包括(1)负责生长刺激的低分子量(LMW)级分，和(2)含有海带多糖和岩藻聚糖的级分，其赋予胁迫耐受性(盐，以及生物胁迫耐受性)。
总之，这些结果表明RM-2705提取物的分级分离可以提供具有不同作用模式的至少两种类型的产物，并因此提供使用相同原料的不同应用。
由于SEC在工业规模上是不可转移的，因此还需要开发能够生产海藻提取物的分级分离产物的另一种方法，该方法能够在更大规模上提供植物生长刺激活性。
SEC的一种替代方法是超滤(UF)，这是一种其中海藻提取物通过具有适当分子量截留值(MWCO)的超滤膜进行过滤的分级分离过程，在一个实施方案中，MWCO为1kDa，可生产出所需范围约为0.15kDa至1.0kDa的具有生物活性分子的级分。因此，在一个实施方案中，可以使用1kDa MWCO膜将海藻提取物进行超滤。
在一个实施方案中并且在最广泛的意义上，本发明提供了纯化衍生自海藻提取物的生物刺激物组合物的方法，该方法包含使用半渗透超滤膜进行超滤的步骤，以根据分子的分子量、大小和形状，将兴趣分子从其余混合物中分离出来。
该超滤步骤可以使用超滤设备进行，在该超滤设备中使用具有适当截留分子量(MWCO)的膜对包含按重量计在约1％与按重量计约15％之间的干物质、更优选按重量计在约2％与按重量计约7％之间的干物质的海藻提取物溶液进行超滤。在一个实施方案中，超滤方法包括切向超滤。
收集滤液以用于其生物刺激特性，同时使渗余物(或浓缩物)再循环，该渗余物在该过程结束时分开用于其他应用。尽管通常不是必要的或需要的，但如果需要，则通过以相应于从超滤液中除去水和分子量小于或等于1kDa的分子的速率加入淡水，可以实现渗余物(或浓缩物)的进一步纯化。
如图4所示，超滤可以通过向溶液储器(1)中加入一批海藻提取物的方法进行。溶液通过管线(2)和泵(3)循环到超滤单元(5)的入口歧管(4)中。该超滤单元(5)包含平行设置的一个或多个筒以提供适当的超滤膜面积。然后，超滤液经由出口管线(6)离开超滤单元(5)并被收集在罐(7)中。该超滤浓缩物经由出口歧管(8)离开该超滤单元(5)并且经由管线(9)返回到该溶液储器(1)中。
包含在超滤单元(5)中的膜可以是聚合物型膜或陶瓷型膜。在一个实施方案中，膜包含管状陶瓷膜，该管状陶瓷膜包含多个通道。例如，膜可以含有约15至约50个通道、更优选约19至约39个通道，并且可以具有约50至约150cm的长度。在其他实施方案中，螺旋膜和交叉流膜也可用于实施本发明。膜面积通常在约0.20至约0.6m2之间，更优选在约0.30至0.40m2之间。
将该渗余物冲洗数次，以去除具有小于该膜的截止值的分子量的分子的主要部分。所述超滤液含有分子量小于所述截留膜的分子量的分子。在一种情况下，截止值为3kDa，更优选为2kDa，并且还最优选为1kDa。超滤物中所含的分子显示出比MWCO更小的低分子量，例如，约1kDa，并且通常称为代谢物。所述渗余物含有分子量大于截留膜的分子，例如，约1kDa。渗余物中含有的分子显示高分子量(例如，从约3kDa至约4kDa的海带多糖，或高于约30kDa的岩藻多糖和其他褐藻高分子量生物聚合物)。
已经发现来自墨角藻(Fucales)目的所有藻类物种显示有希望的活性并且可以经受在此描述的方法。这些藻类物种包括，但不限于，墨角藻科(Fucaceae)，马尾藻科(Sargassaceae)和Durveilleaceae科的物种。来自墨角藻目和海带目的其他物种包括，但不限于阿斯科藻属(Ascoseirales)、阿斯特藻目(Asterocladales)、酸藻目(Desmarestiales)、网地藻目(Dictyotales)、Dictyotophycidae、玉匣藻目(Discosporangiales)、Discosporangiophycidae、水云目(Ectocarpales)、墨角藻目(Fucales)、墨角藻亚纲(Fucophycidae)、铁打菜目(Ishigeales)、Ishigeophycidae、海带目(Laminariales)、线皮藻目(Nemodermatales)、内纵藻目(Onslowiales)、Phaeophyceaeordo incertae sedis、Phaeosiphoniellales、褐壳藻目(Ralfsiales)、革丛藻目(Scytothamnales)、黑顶藻目(Sphacelariales)、毛头藻目(Sporochnales)、柱冰藻目(Stschapoviales)、管皮藻目(Syringodermatales)、线翼藻科(Tilopteridales)等。
此外，虽然描述和示出了本发明以显示来自墨角藻目的藻类物种的阳性结果，但是该方法不限于这些藻类物种，并且还可以用于分离和分析可以用作生物刺激物的任何藻类或其他物种的滤液，以确定这些滤液的生物活性。
如本文附图中所用，术语“滤液”是指通过超滤单元进行一次或多次超滤后获得的滤液和超滤物。
如本文附图中所用，术语“渗余物”是指没有冲洗的渗余物和在一次或多次冲洗后获得的渗余物。
具体实施方式
实施例1：
将RM-3496提取物在实验室规模用1kDa MWCO膜超滤并将渗余物用水冲洗三次。在莴苣和小麦上测试了含有分子量小于1kDa的分子的超滤液和含有分子量大于1kDa的分子的渗余物。因此，将不同的滤液和渗余物施用到莴苣和小麦上。以墨角藻(Fucusvesiculosus)和马尾藻(Sargassum natans)为原料，采用相同的方法制备GF142和GS142提取物。结果示于图5和6中，图5和6描绘了箱形图，其示出了对照植物、用四种不同海藻提取物(分别为RM-2705、RM-3496、GF142和GS142)处理的植物的地上部鲜重，用高分子量分子处理的植物对应于称为RM-3496.渗余物、GF142.渗余物和GS142.渗余物的渗余物。用低分子量分子处理的植株对应于RM-3496.滤液、GF142.滤液、和GS142.滤液。这些结果证实了海藻提取物的功效并且在滤液中显示出生长促进活性，其中渗余物似乎在促进植物生长方面是低效的。
实施例2：
将10升来自泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的水性提取物(pH 2.76)放置在配备有58cm长的管状(直径：25mm，23个通道，截留1kDa)陶瓷超滤膜(由Tami工业公司供应)的中试规模超滤单元的溶液储器中。将该溶液泵送通过超滤管，同时将浓缩物完全再循环回到储器中。收集6升滤液并鉴定为F1。将渗余物(4L)用5升水冲洗两次以产生2次滤液(F2＝5L；F3＝5L进一步评估了不同滤液(F1、F2、F3)的生物刺激特性。
实施例3：
将5升来自墨角藻(Fucus vesiculosus)的水性提取物(pH 2.42)放置在配备有58cm长的管状(直径：25mm，23个通道，截留1kDa)陶瓷超滤膜(由Tami工业公司供应)的中试规模超滤单元的溶液储器中。将该溶液泵送通过超滤管，同时将浓缩物完全再循环回到储器中。收集滤液并鉴定为F1。将渗余物(2.5L)用2.5L水冲洗一次以产生2.5升滤液(F2＝2.5L)。进一步评估了不同滤液(F1、F2)的生物刺激特性。
实施例4：
将5升来自马尾藻(Sargassum natans)的水性提取物(pH 2.92)放置在配备有58cm长的管状(直径：25mm，23个通道，截留1kDa)陶瓷超滤膜(由Tami工业公司供应)的中试规模超滤单元的溶液储器中。将该溶液泵送通过超滤管，同时将浓缩物完全再循环回到储器中。收集滤液并鉴定为F1。将渗余物(2.5L)用2.5L水冲洗一次以产生1升滤液(F2＝2.5L)。进一步评估了不同滤液(F1、F2)的生物刺激特性。
实施例5：
将由法国高默尔实验室公司(Laboratoires )制造的来自泡叶藻(Ascophyllum nodosum)提取物的RM-3496和两种其他海藻提取物(分别由法国高默尔实验室公司(Laboratoires )制造的来自墨角藻(Fucus vesiculosus)和马尾藻(Sargassum natans)的GF142和GS142)进行超滤并评估它们的生物刺激特性。
将这三种岩藻糖提取物在具有合适MWCO(即约1kDa)的陶瓷膜(可从TAMI工业公司获得)上超滤。将10升RM-3496超滤，收集5升超滤液并构成用于莴苣和小麦的另外实验的滤液1。用5升水冲洗渗余物(5L)两次，用2.5升水冲洗GF142和GS142渗余物(2.5L)一次。测量滤液、超滤液和渗余物的干重。根据RM-3496提取物的分级分离方法，滤液(含有分子量小于1kDa的分子)的总干重为RM-3496提取物的约80％，且渗余物为RM-3496提取物的约20％。
植物生长实验的细节描述如下。
用不同的提取物(RM-2705、RM-3496、GF142和GS142)进行处理，所有实验使用250的稀释因子(相当于每升营养溶液4毫升的液体提取物)。根据用干重计算的纯化产率将SEC分级分离和超滤分级分离得到的不同级分施用于植物。通过处理用n株植物对不同的级分进行若干独立的生物重复。
用莴苣(Lactuca sativa)生态型Fabieto或Janero(购自法国科尔玛市Voltz)的种子进行生菜生长试验。使莴苣在生长室中在旋转台上生长以获得对于任何处理条件尽可能均一的植物表型。植物在高压碘-钠灯下生长，其中光合有效辐射为150±10μmol光子.m-2.s-1，热周期为20/18℃(日/夜)，长日光周期为16h光。为了控制对植物的养分输入和促进根的收集，使莴苣的种子在砂锅中生长。将植物用具有N/P/K 20：20：20(1g/L)比率的氮、磷酸盐和钾浓度的市售营养溶液(可购自法国Les Clayes-sous-Bois的Puteaux)每周浇三次。
将莴苣用不同的海藻提取物处理两次(在第21天和第28天每周一次)，将级分加入到营养溶液中，并将锅的底部浸入营养溶液中直至观察到完全吸收。
在第一次处理后16天，收获植物，并分别收集地上部和根。用不同的海藻提取物和级分进行三次独立的生物重复。12个莴苣(n＝12)用于SEC分级分离实验的处理，而18个莴苣(n＝18)用于超滤实验的处理。
拟南芥生态型Columbia的种子(获自ABRC种子原种中心的Col-0)在体外培养物中生长。首先将种子表面灭菌，并将其播种在含有半强度Murashige和Skoog(MS)基础培养基的方形皮氏培养皿中，所述基础培养基补充有1％(w/v)蔗糖(30mM)和0.6％(w/v)PhytagelTM。皮氏培养皿在强度为225±10μmol光子.m-2.s-1的冷荧光灯下生长，并在21℃±0.5℃的光照下持续16h的长期光照。每天更改氖气灯下皮氏培养皿的位置，并在整个实验过程中进行随机化实验。
选择生长一致的植株，在处理培养基上发芽6天后转移。对于每种条件，制备6个皮氏培养皿，每个培养皿均被制备。
在转移到处理培养基上9天后收集植物。进行4次独立的生物测定并通过SEC分级分离实验的处理使用6次重复(n＝6)。
用Altigo品种的冬小麦种子(购自法国Saint-Beauzire的Limagrain)进行了小麦生长试验。使小麦在生长室中在旋转台上生长以对于每种条件获得尽可能均一的植物表型。为了控制养分对植株的投入，在蛭石盆中种植小麦种子。植物在生长室中在高压碘-钠灯下生长，其中光合有效辐射为150±10μmol光子.m-2.s-1，热周期为22/18℃，长日光周期为16小时。播种后1天，均一的植株分布在不同的托盘中；每个托盘6植株数且每个条件两个托盘。每周用与莴苣实验所用相同的市售营养溶液浇植物三次。
播种后2周，将小麦用不同级分和提取物处理5倍(每2或3天)，并在第一次处理后13天收获。通过比较地上部鲜重来评估不同级分的功效。用不同的海藻提取物和级分进行三次独立的生物重复。超滤实验处理使用12株小麦(n＝12)。
在本发明中，通过统计方法评估不同级分和提取物对植物生长刺激的功效。的确，对于所示的每个生物测定，数据的正态性首先用Shapiro-Wilk进行正态性测试、用Q-Q图和用密度直方图检验。在对这些数据进行参数检验之前，也用Barlett测试来检验这些数据的同方差性。进行几种生物检测(在时间上3-4次独立重复)以评估用N种植物通过处理对植物生长刺激的不同处理。然后对数据进行参数双向方差分析(双向方差分析(双向Anova))以确定在每种生物检测的不同处理的平均值之间和所进行的不同生物测定的每种处理的平均值之间是否存在显著差异(α误差为5％)。根据Anova结果，对数据进行参数化的post-hocHSD Tukey测试或多对比较，以确定范围和定义什么方式彼此显著不同。Tukey测试结果以粗体字母显示在柱状图上。彼此显著不同的处理方式显示不同的粗体字母。这些手段在每个箱形图上由点描绘。
本文所述的化合物可用于各种作物，包括例如大豆；玉米；谷类(即小麦、大麦、黑麦和燕麦)、油菜籽、芸苔、向日葵、甜菜、马铃薯、干豆类(即小扁豆、干菜豆等)；甘蔗；水果蔬菜，包括番茄、茄子、瓜类蔬菜、胡椒、葫芦等；鳞茎蔬菜，包括洋葱和韭菜；头和叶类蔬菜，包括莴苣、菠菜和芹菜；芸苔；核果；柚子；柑橘；咖啡；可可；坚果树；浆果；葡萄(鲜食葡萄和藤蔓)。
最后，还应当理解，权利要求旨在覆盖这里描述的本发明的所有通用和特定特征以及本发明范围的所有陈述，这些陈述根据语言可能落入它们之间。